Количественные клеточной биологии нейродегенеративные у дрозофилы путем объективного анализа дневно тегами белков с помощью ImageJ

Резюме

Мы разработали простой и адаптации рабочего процесса для получения количественных данных из ячейки на основе изображений флуоресценции биологических исследований агрегации белков и autophagic потока в центральной нервной системе дрозофилы моделей нейродегенеративные.

Аннотация

С ростом распространенности нейродегенеративных заболеваний все более важно понять основные патофизиологии, что приводит к дисфункции нейронов и потери. На основе флуоресценции изображений инструменты и технологии позволяют беспрецедентный анализ субцеллюлярные нейробиологических процессов, пока сохраняется потребность в беспристрастной, воспроизводимые и доступные подходы для получения количественных данных из изображений исследования . Мы разработали простой и гибкой рабочий процесс, чтобы извлекать из на основе флуоресценции изображений исследования с использованием модели дрозофилы нейродегенеративные количественные данные. В частности, мы описываем easy-to последующие, полуавтоматическое подход с использованием Фиджи/ImageJ для анализа двух клеточных процессов: во-первых, мы количественно совокупного содержания белка и профиль в доле зрительного дрозофилы , с помощью люминесцентной меткой мутант гентингтина белков; и во-вторых, мы оцениваем autophagy Лизосома потока в системе дрозофилы визуальные с количественной оценки на основе ratiometric тандем флуоресцентные репортер autophagy. Важно отметить, что изложенные здесь протокол включает полуавтоматическая сегментация шаг, чтобы убедиться, что все флуоресцентные структуры анализируются к минимуму систематическая и увеличить разрешение тонкие сравнений. Этот подход может быть продлен для анализа других клеток биологических структур и процессов причастны нейродегенеративные, таких как белковых puncta (гранулы стресс и синаптическую комплексы), а также мембраны прыгните отсеков (митохондрии и мембрана везикулы торговли людьми). Этот метод обеспечивает стандартизированный, но адаптированы ссылку для анализа изображений и количественной оценки и могли бы способствовать надежности и воспроизводимости через поле и в конечном итоге повысить механистического понимания нейродегенеративные.

Введение

Нейродегенеративные заболевания затрагивают миллионы людей каждый год, и растет с старение населения¹. Хотя каждый нейродегенеративные заболевания имеет уникальный этиологии, агрегирование смятых протеинов и разбивка proteostasis сети общих патологических отличительными особенностями являются многие из этих болезней. Разъяснение, как нарушение этих основных и взаимосвязанных процессов идет наперекосяк вносить нейрональных дисфункции и клеток смерть имеет решающее значение для понимания нейродегенеративных заболеваний, а также руководящих терапевтических вмешательств. На основе флуоресценции изображений позволяет для расследования эти сложные и динамичные процессы в нейронах и внесла значительный вклад в наше понимание биологии нейрональные клетки. Анализ дневно тегами белков является сложной задачей, особенно когда эксперименты проводятся в естественных условиях, из-за весьма компактный тканей, типов различных клеток и морфологическая неоднородность. Вручную помощь количественной оценки является доступным и простым, но часто занимает много времени и при условии человека предвзятости. Таким образом существует потребность в беспристрастной, воспроизводимые и доступные подходы для получения количественных данных из изображений исследования.

Мы разработали простой и гибкой рабочего процесса с помощью Фиджи/ImageJ, мощный и свободно доступных изображений, обработки программного обеспечения^2,3, чтобы извлечь количественные данные из флуоресценции изображений исследования в экспериментальной модели нейродегенеративные используя дрозофилы. Следуя этот протокол для количественного определения белка агрегации и autophagic потока — две ячейки биологических особенностей, которые весьма актуальны для нейродегенеративные заболевания патология — мы продемонстрировали чувствительность и воспроизводимость этого подхода. Анализ дневно тегами мутант гентингтина (НТТ) белков в доле зрительного дрозофилы показали, число, размер и интенсивность белка агрегатов. Мы визуализирована тандем флуоресцентные репортер autophagic потока в пределах дрозофилы зрительной системы, которая отображает различные выбросов сигналов в зависимости от среды полигамное⁴. На основе Ratiometric анализа тандем репортер позволяет представление количественных и всеобъемлющей autophagy Лизосома потока от autophagosome формирования, созревания и транспорта к деградации в Лизосома и дополнительно выделены уязвимые отсеки в нейродегенеративных условий. Главное в обоих анализах мы реализовали полуавтоматические ограничивание и сегментация шаги в нашей протокол к минимуму бессознательного смещения, увеличения отбора мощности и установить стандарт для облегчения сопоставлений между аналогичные исследования. Простой рабочий процесс предназначен для мощных плагинов Фиджи/ImageJ (разработанных компьютерных ученых, основанные на математических алгоритмов) более доступными для neurobiologists и наук о жизни сообщества в целом.

протокол

1. соображения и подготовка для проектирования эксперимент анализ изображений

1. Предопределяют подходит анатомические, сотовых, или внутриклеточных маркеров, чтобы служить в качестве ориентиров для стандартизации региона интерес (ROI) через различные образцы, например 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), маркеры мембраны, локализованные люминесцентные белок и т.д.
2. Выберите флуоресцентные маркер, который можно разграничить дискретных puncta Помимо фоновых уровней для структуры интереса.
   Примечание: Этот протокол оптимизирован для белковых структур (например, смятых протеинов агрегаты) и мембранных органелл (например, autophagy репортер). Чтобы визуализировать агрегации белков, фрагмент ППП тегами N-терминальный человека Htt белка с патогенных polyQ тракта 138 повторяется (ППК hHttQ138) был используется⁵. Мутантный белок Htt образует цитоплазматических агрегатов при выраженных в нейрональных драйверам например elav-GAL4^5,6. Для визуализации потока autophagosome Лизосома, Актин GAL4 использовался повсеместно водить выражение тандем mCherry-GFP-Atg8a репортер. mCherry - и GFP-позитивных puncta указывают autophagosomes, и поток контролируется как GFP флуоресценции закаленных в кислой среде Лизосома, где кислоты регистра mCherry остается до тех пор, пока белок является деградированных⁷. Для ratiometric анализа один канал, который является маркером последовательной структуры может использоваться для сегментации, или если необходимо, что проекция двух или более каналов может использоваться для описания структур, хотя описанные явно не в настоящем Протоколе. В этом примере mCherry используется для сегментации Atg8-позитивных частиц, как она нечувствительна кислоты и будет оставаться в секции на протяжении всего потока через пути.
3. Скачать и установить открытым исходным кодом изображения анализ платформы ImageJ или Фиджи — распределение вероятностей ImageJ с комплекте плагины^2,3.
4. Установите плагин для h Максима Интерактивные водосборных бассейнов.
   Примечание: Этот протокол использует Фиджи; для ImageJ могут потребоваться дополнительные плагины. Подключаемый модуль, разработанный Benoit Lombardot для SCF-MPI-CBG-доступны онлайн (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
5. Перейдите к «Справка | Обновление», выберите «Управление обновление сайтов» от «ImageJ Updater», выберите сайт обновления SCF-MPI-ЦБС из списка и затем закройте и перезапустите Фиджи.

2. мозг диссекции и иммунофлюоресценции пятнать

1. Делают силиконовые эластомера выстроились рассечение блюда.
   1. Наливайте силиконовые эластомера компонентов в стакан, как указано заводом-изготовителем и перемешать хорошо до тех пор, пока тщательно перемешивают.
   2. Использование пипетки для заполнения 5 см культуры ткани блюда одной трети до половины полный (около 10 мл смеси эластомер). Разрешить любые пузыри поднимаются на поверхность и аккуратно удалить с папиросной бумаги. Обложка блюда и разместить их на ровную поверхность для лечения для 48-72 ч при комнатной температуре (RT).
2. Вскрыть дрозофилы мозга и зрительной системы при необходимости.
   1. Выполнения диссекции дрозофилы мозга как описано^8,9. Выполните рассечение в картонных эластомер рассечение блюда, с помощью эластомер снизу для стабилизации мозг, чтобы избежать повреждения ткани или щипцами.
   2. Чтобы сохранить нетронутыми пластинки во время вскрытия, сдвиньте две щипцы под сетчаткой и аккуратно слезоточивый через середины глаза, чтобы удалить сетчатки. Отведите в сторону любой ткани сетчатки, придает пластинки с щипцами, проведенных параллельно поверхности пластинки.
      Примечание: Остаточные пигмент будет смыть в следующих шагах и обычно не мешают антитело пятная и обработки изображений.
   3. Разбавьте 37% формальдегида в фосфат амортизированное saline (PBS), с тем чтобы сделать окончательный 3,7% концентрации свежий перед использованием в пробки microcentrifuge 500 мкл. Передать пробки microcentrifuge с решения расчлененных мозга и Инкубируйте 15 мин на RT с плавное покачивание.
      Примечание: Формальдегид имеет естественную тенденцию к окислению, производя муравьиную кислоту. Таким образом он предложил Алиготе 37% формальдегида для хранения и разбавить до 3,7% свежей перед каждым использованием. Чрезмерной фиксации или недостаточная фиксация будет влиять на целостность ткани и флуоресценции¹⁰.
   4. Вымойте 3 раза с PBTx (PBS с 0,4% Тритон X-100) за 15 мин.
3. Выполняют иммуногистохимии и смонтировать образцов.
   1. Если необходима Пятнать антитела, удалите PBTx, добавить основное антитело, разбавляют 5% нормальной козьего сыворотки в PBTx и инкубировать на аликвота смеситель на ночь при 4 ° C.
   2. Удаление основного антитела и промыть PBTx 3 раза за 15 мин. Добавление вторичного антитела, разбавляют 5% нормальной козьего сыворотки в PBTx и инкубировать 1 час на RT или на ночь при 4 ° C. Промыть PBTx 3 раза за 15 мин.
   3. Если DAPI окрашивания необходимо, удалить PBTx, добавить DAPI решение (фондовый раствор: 5 мг/мл, разбавляют до рабочей концентрации 15 мкг/мл в PBTx) и проинкубируйте втечение 10 мин на RT. мыть 3 раза с PBTx за 15 мин.
   4. Чтобы очистить ткани, поместите каплю монтажа средних на центр слайд микроскопии с распоркой один слой прозрачной клейкой ленты с обеих сторон. Передача мозг на падение среднего монтажа и ждать 1-2 мин до тех пор, пока мозг становится прозрачным. Осторожно удалите средство монтажа с пипеткой.
   5. Для монтирования, примените капли свежего монтажа средних на мозги на слайде. Тщательно наложение крышка стекла, избегая пузыри. Уплотнение края с резиновый клей и просушите в РТ на 20 мин приступить для захвата изображений для достижения наилучших результатов.

3. изображение приобретение

1. Оптимизировать параметры приобретение микроскопа, включая пространственное разрешение, цель, масштаб, скорость сканирования, и шаг размер, чтобы максимизировать резолюции структур, представляющих интерес для облегчения полуавтоматическая сегментация во время анализа изображений.
   Примечание: Это может быть полезным для захвата изображения образца и протестировать полуавтоматическая сегментация (в шаге 5 настоящего Протокола) перед изображений всех экспериментальных образцов. Таким образом пользователь может настройки изображений так, что аналитические инструменты могут легко различить биологической структуры интереса.
2. Отрегулируйте изображение детектор захватить высокое соотношение сигнал шум и высокий динамический диапазон образца.
   1. Используйте LUT (смотрите таблицу), указывающее пиксель насыщения (воздействие слишком высока) или undersaturation (смещение слишком низкий) во время настройки (рисунок 3B, красный указывает пиксель насыщение Хай/Лоу LUT).
   2. Убедитесь, что усиление и смещение параметры подходят для всех экспериментальных групп, как экспериментальных манипуляций может изменить структуру интерес.
      Примечание: Важно, что те же параметры используются для всех групп сделать количественные сравнения.
3. Изображение через ткани, чтобы захватить все данные.
   Примечание: Рекомендуется для захвата всех имеющихся данных в течение одной сессии изображений и для определения более точной области во время выбора ROI на шаге 4 при необходимости.
4. Сохраните изображение как тип файла, поддерживаемый изображений программное обеспечение для сохранения метаданных, таких как приобретение параметры и пространственной калибровке. Сохранить изображение с именем файла, включая экспериментальные Дата, генетический фон и флуоресцентные репортеров, антитела, или красителей, соответствующие каналы сканирования как [имя группы] _ [имя образца] _ [эксперимент Дата] _Ch1. [Флюорофор цель /Dye]_Ch2.[Fluorophore-Target/Dye], и т.д.

4. Фиджи/ImageJ импорта изображений и выбор ROI

1. Откройте изображение в Фиджи. Используйте диалоговое окно «Параметры импорта био-форматы», выберите «Просмотр стека с: Hyperstack» и «цветовой режим: серого».
   Примечание: Рекомендуется открыть тип файла Микроскоп, как метаданные, такие как пространственной калибровке могут быть прочитаны Фиджи.
2. Определите область от одной плоскости z или проекции, основанные на каналы маркер, который может использоваться как стандартизированные ROI различных образцов (рис. 1, выбор ROI).
   1. Используйте полосу прокрутки «C» для просмотра каналы, используемые для захвата marker(s), указанных в шаге 1.1.
   2. Используйте «Z» прокрутки для перемещения плоскости фокуса. Выберите один срез или создайте проекция нескольких фрагментов, нажав кнопку «изображение | Стеки | Проект Z» и установить «начало фрагмента» и «Остановить срез» охватывают ROI.
      Примечание: Установка типа »проекции» до «Макс интенсивности» в проекте «Z» диалоговое окно часто лучше всего подходит подчеркнуть структур для сегментации в разделе 5, хотя это может не подходить для всех приложений. Если для анализа требуется другой тип проекции, позаботьтесь, чтобы сохранить и документ этот файл таким образом, для извлечения компонентов в разделе 6 или 7.
   3. Создать новое изображение, содержащий каналы и фокальной плоскости, представляющие интерес для упрощения следующие шаги в протоколе анализа изображения. Выберите «изображение | Дубликаты», задайте нужное «каналы» (c) и «Фрагменты» (z) и изменить имя файла, чтобы отразить выбор (например, [имя группы] [имя образца] _ [эксперимент date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
3. Используйте один из «выделение» на панели инструментов Фиджи вручную выбрать стандартизированных ROI на основе критериев отбора, определенный на шаге 4.2.
4. Добавьте ROI рентабельность менеджер, нажав кнопку «анализировать | Инструменты | ROI менеджер» и нажмите кнопку «Добавить» в меню менеджера ROI. Сохранить рентабельность инвестиций ROI менеджер меню, нажав «более | Сохранить», а затем укажите имя файла для отражения ROI (например, [имя группы] [имя образца] _ [эксперимент Дата] _ [канал] _ [z-плоскости] _ [ROI описание]).
   Примечание: Это может быть возобновлено в Фиджи для последующего анализа или могут быть применены к другим каналам или изображения как в раздел 5.3.

5. Предварительная обработка и сегментация с h Максима Watershedding

1. Выполняйте операции предварительной обработки на канал, используемый для захвата структуры интереса.
   1. Если файл изображения состоит из нескольких каналов, отдельные каналы, нажав «изображение | Цвет | Разделить каналы» изолировать канал интерес.
   2. Применить фильтр как медианный фильтр для уменьшения шума или Гауссово размывание для сглаживания, нажав «процесс | Фильтры | Тип фильтра» (например, «Медиана-фильтр» или «Гауссово размывание»).
      1. Отведайте различные фильтры и параметры на изображения из каждой экспериментальной группы фильтра. Выполните шаг 6.2 с репрезентативного примера из каждой группы, чтобы проверить производительность сегментации. Выберите фильтр и настройки, которые облегчают сегментация структур интерес.
   3. Запись фильтр и параметры. Применять эти параметры в экспериментальных группах.
   4. Сохраните копию изображения в виде файла tiff включая прикладной фильтр для справки. Используйте подробное имя, например [имя группы] [имя образца] _ [эксперимент Дата] _ [канал] _ [z-плоскости] _ [фильтр с параметрами].
2. Выполните сегментация структур интерес с инструментом интерактивного h Максима водосборных бассейнов на предварительно обработанного изображения создается и сохраняется в шаге 5.1.
   1. С предварительно обработанного изображения в Фиджи, инициировать средство интерактивного водораздел h Максима, нажав «СКФ | Маркировка | Интерактивная H_Watershed».
      Примечание: Этот плагин сначала вычисляет водораздел и затем позволяет пользователю исследовать влияние местных Максима и порог параметры сегментации через мгновенно Обновлено вывода изображения.
   2. Из панели управления настройте семян динамика (h), интенсивность порога (T) и Пик наводнения (%), чтобы оптимизировать сегментации.
      Примечание: Всегда относятся к raw изображений перед препроцессирование из раздел 4.2, чтобы вручную проверить производительность сегментация структур интерес.
   3. Когда удовлетворены результатами сегментации, выберите «Экспортировать регионы маска» и выберите «Экспорт». Это будет генерировать двоичное изображение результатов водораздел (рис. 1, сегментация).
   4. Запишите параметры сегментации; Эти параметры должны применяться во всех экспериментальных групп на количественных сопоставлениях. Сохранить маску двоичные результаты при желании для справки с параметрами сегментации, подробно изложены в имя как [имя группы] [имя образца] _ [эксперимент Дата] _ [каналы] _ [z-плоскости] _ [фильтр с параметрами] _ [H_Watershed параметры].
3. Извлечь структуры интереса от водораздела результаты.
   1. Откройте сохраненный ROI от шаг 4.4, в менеджере ROI. С двоичной области маски из шага 5.2.4 активных выберите ROI от ROI менеджера для применения к изображению, чтобы ограничить функцию извлечения для стандартизированной ROI.
   2. С Руа, активных на бинарные водораздел маску, выберите «анализировать | Анализ частиц» с «Менеджер» выбран в диалоговом окне извлечь функции.
      Примечание: Это будет добавить идентификатор частиц для каждой структуры, разделенное в ходе сегментации к диспетчеру ROI. Параметры доступны в этом меню, чтобы исключить функции, основанные на размер или замкнутости, если это необходимо для уточнения структур, включенных в анализ.
   3. Нажав сохранить частицы «более | Сохранить» в меню менеджера ROI. Убедитесь, что выбран идентификаторы и все частицы будет сохранен в zip-файле. Используйте подробное имя, например [имя группы] [имя образца] _ [эксперимент Дата] _ [каналы] _ [z-плоскости] _ [фильтр с параметрами] _ [H_Watershed параметры] _ [структуры].

6. количество, области и интенсивности количественной оценки и анализа

1. Откройте изображений в формате raw создается и сохраняется в шаге 4.2. Выделите канал, используемый для захвата структуры интереса.
   Примечание: Очень важно для измерения интенсивности из raw изображений (до предварительной обработки) как применение фильтров в шаге 5.1 изменения значения пикселов.
2. Откройте частицы, полученные от добычи особенность в шаге 5.3 и выберите «Показать все» от менеджера ROI.
   Примечание: Это действие будет наложение изложение каждой частицы на «ROI менеджер» на изображение и должно соответствовать края структуры интереса (рис. 1, функция извлечения).
3. Установите желаемый измерения, нажав кнопку «анализировать | Набор измерений».
   Примечание: Площадь, интенсивности и плотности частиц может измеряться, выбрав «область» и «комплексной плотность». При выборе интегрированной плотность, Фиджи будет производить два значения: «Встроенный плотности» рассчитывается как произведение района и среднее значение серого и Raw интегрированный «плотности» измеряется как сумма значений пикселей. Плотность флуоресцирующего белка в частицы рассчитывается как сумма значений пикселов, разделенная на площадь. Количество частиц, созданного на шаге 5.3 указывает количество частиц в ткани, ROI, определенным в шаге 4.4.
4. ROI менеджер меню выберите «Мера». Результаты выражаются в калиброванных единицах, пока измерения взяты из файлов, полученных изображений в Фиджи. Копирование результатов из окна результаты и вставить в таблицу программное обеспечение для компиляции и дальнейших вычислений.

7. Ratiometric количественная оценка и анализ данных

1. Выполните шаги 6.1 и 6.2 открыть идентификаторы частиц на первом канале сырье интерес.
2. Установите желаемый измерения, нажав кнопку «анализировать | Набор измерений».
   Примечание: Средняя интенсивность за частиц может измеряться, выбрав «Означает значение серого».
3. От менеджера ROI выберите «Мера». Копирование данных из окна результаты и вставить в таблицу программного обеспечения.
4. Перенести второй канал необработанных интерес, GFP в этом примере (рис. 4A), scrollbar «C» и повторите шаги 7.2. и 7.3.
   Примечание: Частицы, сохраненные на шаге 5.3 будет по умолчанию канал и срез, из которого он был создан. Позаботьтесь, чтобы убедиться, что частицы применяются к правильный канал интерес.
5. Вычислите коэффициент интенсивности от одного канала с интенсивностью второй для каждой частицы в программном обеспечении электронной таблицы.
6. Используйте точечную диаграмму для визуализации и количественной оценке данных ratiometric от флуорофоров, выставлять отдельные изменения, отражающие основных биологических процессов.
   1. Создание точечной графического программного обеспечения.
      Примечание: Каждая точка данных представляет собой структуру интерес, где интенсивность первого Флюорофор интерес значение «x» и интенсивность второй Флюорофор значение «y» измеряется от каждой частицы.
   2. Установите стробирования пороговые значения для каждого Флюорофор для определения квадрантах.
7. Используйте линии профиля для визуализации Флюорофор интенсивности по всей структуры интереса.
   1. Выберите ROI, созданного на шаге 5.3 и использовать прямой инструмент на панели инструментов чтобы нарисовать прямую линию через ROI. Добавьте строку ROI к диспетчеру ROI.
   2. Для каждого канала интереса, с линией ROI активных, выберите «анализировать | Участок профиля».
      Примечание: Функция профиля сюжет будет генерировать гистограммы сюжет и таблица значений интенсивности вдоль линии. Скопируйте результаты измерений от каждого канала и вставить в таблицу программное обеспечение для создания участка показаны оба канала вдоль линии.

Результаты

Количественная оценка числа, область и интенсивность дневно тегами мутант Htt агрегатов в доле зрительного дрозофилы

Расследовать агрегации смятых протеинов в центральной нервной системе дрозофилы модели болезни Гентингтона,...

Обсуждение

Протокол, изложенные здесь может использоваться для энергично и герметизации quantitate биологических процессов клетки визуализированы на основе флуоресценции изображений. Контекста биологических и технических ограничений необходимо тщательно направлять экспериментальный дизайн. Флу?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	PF184250	Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish	Corning	351008	Dissection dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dissection tool
Sodium Chloride	Sigma	S3014	PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	PBS solution
Triton X-100	Sigma	T9284	Washing and antibody incubaton solution.
37% Formaldehyde	VWR	10790-710	Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)	VWR	89000-022	Fixation, washing, and antibody incubaton.
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm)	VWR	48312-004	Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm)	VWR	48393-172	Slides for confocal imaging
Rubber Cement	Slime	1051-A	Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m)	3M Company	810	Mounting
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope	AmScope	SM-1BNZ	Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749