人間-iPSC 由来心筋細胞分離の収縮測定 384 ウェル プレートの温度制御の Ca 感受性蛍光色素

要約

幹細胞は、人間の心臓の生理学および薬理学の有用なモデル人間誘導された多能性から派生した心筋細胞の分離を自発的に契約です。周波数を破って、Ca 感受性蛍光色素と温度制御のイメージング ウェル プレート リーダーを使用してに外因性の化合物の効果を定量化するハイスループットス クリーニング システムをご紹介します。

要約

人間誘導された多能性から派生した心筋細胞の分離を自発的に契約幹細胞による CM) は、人間の心臓の生理学および薬理学の有用なモデルです。この自発的な活動を記録して薬剤の効果を評価するさまざまな方法が提案されているが、これらのメソッドの多くは、スループットの制限および/または生理学的な関連性苦しみます。Ca 感受性蛍光色素および温度制御のイメージング ウェル プレート リーダーの使用による CM の打撃頻度に外因性の化合物の効果を定量化する高スループット スクリーニング システムを開発しました。セル板・複合板を準備する方法と高い感度と再現性を実現する自動化された分析を実行する方法について述べる。また変換し、自発性リズム変動に対する薬剤の効果の信頼性の高い手段を提供するために蛍光データを分析する方法について述べる。この試金はガイド化学最適化から離れてまたはに向かって、人間の心機能に影響を及ぼす化合物を創薬プログラムで使用できます。

概要

この議定書は、生理学的に関連するリズムでによる CM の両の自発頻度に対する薬剤の効果を測定する方法を示しています。人間誘導された多能性幹細胞は、暴行分離体外^1,2,3、4を自発的に確立する機能的な心筋細胞に区別できます。これらによる CM は、商用プロバイダー経由または実験室の生産で大量に得ることができる、人間の心臓の生理学および薬理学のモデルを生成する細胞の有用なソースです。特に、予測したり、人間⁵に薬剤を投与するときに発生する可能性があります心臓の効果を特徴付けるために使用できます。

微小電極アレイまたはインピー ダンス計測¹を用いた生理学的条件下でによる CM 両打撃回数を測定ことができる: これらの非侵襲的手法は、薬の効果の非常に詳細な情報がなく、低スループットと彼らは、現実的な時間と予算の制約内で大規模な化合物ライブラリのテストを有効にしません。384 ウェル蛍光プレート リーダーを使用してより効果的なシステムを詳述することができます、Ca 感受性色素⁶、古典的なプレート リーダーが最適温度制御/集録周波数によって妨げられます。これらの制限は、生理的暴行率 (~ 15 bpm、35-55 bpm 制御環境¹と比較して) によって示されている、Ca 信号解像度が低い (取得周波数 8 Hz が下限 120 bpm を達することができる記録的な率を刺激の条件下で、斜面や期間などの情報を抽出できません)。ここで説明する方法は、生理のリズム、これらの懸念を排除するための十分な解像度のパターンを破っての記録を組み合わせたものです。

正側では、このメソッドは、単純な信頼性、および高スループット、合理的なコストで化合物の大量の急速なテストが可能です。負側では、このメソッドは高価な投資は、効果的な温度コントロールで高速プレート リーダーが必要です、観察された薬剤の効果は、さらにより詳細なテストが必要になる場合があります少し機械的情報を提供メソッド。

Approximatively 6 x 10⁶による CM は、1 つの 384 ウェルの細胞板の 1 つの測定に必要です。による CM は通常、〜 1 mL の 10 の⁶セル × 4 の冷凍因数として商業的供給されます。したがって、3 つの冷凍因数 2 セル板を準備すると便利です。ほとんどの場合、このアッセイの変動の少ないテスト混合物の重複した測定を実行し、, 各セル板のポジティブ コントロール (フォルスコリン, N6-シクロペンチルホモログ-アデノシンおよび E-4031) の測定すれば十分ですし、ネガティブ コントロール (DMSO だけ) の 20 扇たたみの測定。したがって、352 化合物/濃度ペアの最大は 2 セル 384 ウェルプレートで評価できます。次のプロトコルは、352 テスト混合物、2 つのセル板 1200 万セル; 3 つの冷凍因数として指定と実行このような実験を考慮します。追加のデータ ポイントが必要な場合、それは簡単にスケール アップできます。

プロトコル

1. セル板の準備

注: は、4 週間前に薬剤の効果の測定セル板 3-を準備します。

1. 実験の日 0
   注: 実験 28 日 22-の間の任意の日のプランニングのためテスト複合アプリケーションを実行できます。
   1. 37 ° C で風呂の水をオンにし、めっき中の 40 mL (製造元によって提供される) を暖かい。
      注: は、サプライヤーが提供した一致する文化や保守メディアでセルを使用します。
   2. 雪解けによる CM の 2 分間水浴の凍結細胞を含む cryotubes を配置することによって。
   3. 50 mL の円錐管に 1 mL の細胞懸濁液を慎重に転送します。
   4. 1 ml の残りのセルの取得しステップ 1.1.3 を含んでいるセルから同じ円錐管に洗浄メディアを追加暖かいめっき中の各 cryotube を洗ってください。
   5. 細胞懸濁液に暖かいメッキ媒体の慎重に別の 8 mL を混ぜます。
   6. トリパン ブルー色素排除法と hematocytometer⁸を使用して生きているセルをカウントします。
      注: 6 x 10⁶の要件細胞 1 つ 384 ウェルの細胞板凍結細胞の間で最大 20% の死んだ細胞の可能性を熟考します私たちの経験では最大であるため。
   7. 5 x 10⁵ライブ セル/mL に暖かいめっき中に細胞懸濁液を調整します。
   8. 25 μ L を各ウェル (ウェルあたり約 12,500 セル) に追加することによって、2 つセル 384 ウェルプレートに細胞懸濁液を配布します。
      注: セル板は、任意の行列にプレコートする必要はありません (ディスカッションを参照してください)。
   9. 37 ° c 5% CO₂を含む加湿雰囲気でセル板を維持します。
2. 実験の日 1
   1. 37 ° C および 1 %v/v ペニシリン ストレプトマイシン溶液を添加した培地の暖かい 50 mL で風呂の水を入れます。
   2. セルのプレートの各ウェルに暖かい培地の 50 μ L でメッキ媒体を交換してください。
3. 実験 (27 日) まで 21 日間 2-
   注: による CMs 必要はありません任意のこの期間に、継、非分裂細胞。
   1. 3 日間すべての 2-を更新維持培地の半分と 7、14、21 日に更新します。
      注: 22 と実験の 28 日間蛍光測定を実行できます。長い期間は試みられていないが、罰金があります。

2. 計測器、複合板、アッセイ プレートの準備

注: 計測器、複合板を準備し、アッセイ プレートの 22 と実験の 28 日間の薬剤の効果の測定の日。温度制御と適切な蛍光フィルター キットと励起光蛍光プレート リーダーを使用してソース。たとえば、蛍光-3/蛍光色/蛍光-8 4 蛍光フィルター キットを使用 (励起: 472 nm; 発光: 520-560 nm) と 150 W 励起光源ユニット。

1. 測定用のプレート リーダー内に配置されます最初の細胞板が前に少なくとも 2 時間はリーダーをオンにし、37 ° C で加熱システムを設定
   注: これはまた前に、の晩を行うことが。
2. それぞれ、DMSO、DMSO、10 mM と、H2O で 3.33 mM 0.33 mM の原液として肯定的なコントロール、フォルスコリン、N6-シクロペンチルホモログ-アデノシンおよび E-4031 を準備しています。
   注: 在庫ソリューションを 333-fold 希釈が時間によってセルに追加され、目的がおよぼすフォルスコリン 1 μ M、30 μ M N6-シクロペンチルホモログ-アデノシンと 10 μ M の最終的な試験濃度を達成することです E-4031 は、信頼性と再現性のある効果を生み出します。
3. 333-fold、予定していたテスト濃度 (例えば、30 μ M でのテストの 10 の mM) で DMSO 溶液として 352 テスト混合物を準備します。
   注: 目的化合物の応用; 後 0.3% (v/v) DMSO セル板の最終的な集中を達成するためにはこれは、心筋細胞の律動に影響しない最高の DMSO 濃度です。溶液は、前日も用意できます。原液の 5 μ L の最小重複測定ごとに必要です。
4. 複合板を準備します。
   1. 部屋の温度に 1 %v/v ペニシリン ストレプトマイシン溶液を添加した培地の 40 mL を温めます。
   2. ウェルあたり原液 1.5 μ L を追加することによって 2 つの複合 384 ウェル プレートに配布: i) テスト化合物 (それぞれの 2 つの井戸)、ii) 肯定的なコントロール (フォルスコリン、N6-シクロペンチルホモログ-アデノシン、E-4031、複合板あたり 4 井戸)、iii) 負コントロール (DMSO、複合板あたり 20 井戸)。
   3. 複合板 1 分 100 × gで遠心分離機します。
   4. 室温でメンテナンス中の 37 μ L を各ウェル (その段階で 38.5 μ L で 3.9 %dmso) に追加します。
   5. 複合板 1 分 100 × gで遠心分離機します。
   6. 複合板をプレート リーダーに読み込みます。
      注: 次の手順は、複合板の蒸発を最小限に抑えるため、できるだけ早く実行必要があります。
5. 蛍光染料を準備します。
   1. 37 ° C および 1 %v/v ペニシリン ストレプトマイシン溶液を添加した培地の暖かい 100 mL で風呂の水を入れます。
   2. Ca 感受性蛍光色素と抗生物質で暖かい培地 10 mL でクエンチャを再構成します。
      注: Ca 感受性蛍光色素、通常蛍光-4、および、逆にこのストック蛍光媒体が含まれ、残ったを少なくとも 5 日間の 4 ° C で保存できます。

3. データ集録

注: 薬剤の効果の測定の日にデータ集録を実行します。最初のセル板完全.10 3.1-の手順を実行し、2 番目のセル板のそれらを繰り返します。

1. (必要なら) プレート リーダー ソフトウェアを起動し、ピペットのヒントを読み込みます。
2. 各ウェルのベースライン打撃速度を定義する少なくとも 10 ヘルツの取得頻度を持つカルシウム波の 2 分セグメントを記録するソフトウェアの設定を調整します。
3. 1 つのセル板蛍光培地を作るための抗生物質で暖かい培地の 12 mL にストック蛍光媒体の 3 mL を希釈します。
4. 細胞プレートの各ウェル中の 20 μ L を 30 μ L の蛍光媒体に置き換えます。
5. ミックスに 1 x 上下ピペットします。
6. セル板をプレート リーダーによる CM の温度に慣らすようにできるだけ早く配置します。
7. データ集録を開始する前に 60 分待ちます。
8. 各ウェルのレートを破ってベースラインを定義する、少なくとも 10 Hz の取得頻度を持つ Ca 波の 2 分セグメントを記録するプレート リーダー ソフトウェアでデータ集録を開始します。
   注: 各記録系列細胞板は転送されません自動的にデバイスからデータ取得後を確認してください。これは細胞板が室温で冷却することを防ぎます。プレート リーダー ソフトウェアのいくつかのバージョンでは、それはこれを達成するために完全に終了する前に、各録音を停止する必要があります。
9. セル板に複合板から井戸-井戸 5 μ L を分注、プレート リーダー ロボット テストおよび参照化合物を追加 (また後、DMSO 濃度は 0.3% [v])。
10. Ca 波化合物添加について 5、15、30、45、60 分以降のレコード 2 分セグメントにプレート リーダー ソフトウェアでデータ集録を開始 (確認セル板滞在するたびにデバイスで)。

4. データ解析

注: 測定後随時、データ分析を実行できます。

1. ASCII テキスト ファイルとしてプレート リーダー ソフトウェアからの録音期間ごとに raw データをエクスポートします。
2. Raw データをデータ解析ソフトウェアにインポートできます。
3. 各ウェルおよびすべての時間のポイントは、プライマリの打撃頻度を抽出します。
   注: データ分析ソフトウェアで材料の表に記載されている、周波数を破って計算できる最小自乗スペクトル解析^{7 の小児眼科-Scargle 法に基づく、LombPeriodogram 関数を使用してカスタム解析ルーチンを}.6.00 は、0.01 と 5 Hz の間の周波数の範囲の計算する必要があります。主な周波数は、PeakAutoFind ルーチンを使用してピリオド グラムから抽出できます。この分析方法は、プレート リーダー ソフトウェアのオプションとして提供されたメソッドより周波数を破ってのより正確な測定を提供します。ただし、後者も使用できますソフトウェアのカスタマイズは、オプションではない場合。
4. クリップボードにコピー、または ASCII テキスト ファイルとして、データ解析ソフトウェアからの録音期間ごとにプライマリ暴行周波数をエクスポートします。
5. 表計算ソフトにクリップボード貼り付けまたはテキスト ファイルのインポートによってプライマリ暴行周波数をインポートします。
   注: 任意の近代的な表計算ソフトで 4.9 4.5-の手順を実行できます。
6. 正規化各ウェルのベースラインに薬剤塗布後の各時点で打撃頻度 (5、15、30、45、および 60 分) その時点で、プライマリ周波数で割って基準で主要な打撃頻度によってポイントします。
7. 薬剤塗布後各時点で平均 DMSO の効果を計算 (5、15、30、45、および 60 分) DMSO が適用された 20 の井戸の正規化した値を平均することによって。
8. 薬剤塗布後ポイント各ウェルの各のため (5、15、30、45、および 60 分) 平均 DMSO 効果 (時間一致) 同じ板を引きます。
9. 重複した測定値の平均値します。
   注: 化合物生産不整脈かどうか化合物は、周波数を変更またはソフトウェアは、化合物の添加後主な周波数を見つけることができません、打撃パターンの目視検査が評価できます。

結果

図 1は、1 つの 384 ウェル プレート間でベースラインで Ca 波の代表的な録音を示します。ほとんどの場合、すべての井戸を明らかに通常打撃率少し変動とプレート間 (平均 ± SD = 40.1 ± 3.5 bpm; range = 34-54 bpm)。非常に時折 (以下 10 のうち 1 実験)、いくつかの井戸 (5 未満) 不整脈やリズムの不在があります。3 384 ウェル プレートで我々 はまた別のサプライヤーから心筋細胞を試してみました (材料の表を参照してください)、自発の非常に同様の基準値を取得。

心臓のイオン チャネルのブロッカー再現方法⁵で心筋細胞のリズムに影響を与えます。アムロジピン、遅い Ca チャネル⁹ブロッカーは、(図 2 a) 1 μ M までの濃度依存的に 100% 以上のリズムを加速します。効果は最初の 5 分以内でよく発達してが、まだ増加 approximatively 次の 30 分以内 50% それが安定する前に。アムロジピン逮捕暴行 (破線)、1 μ M、上記事実から予想されることがその Ca 自発収縮に重要なサイクリングです。他の選択的ジヒドロピリジン系 Ca チャネル遮断薬は、非常に同様の効果を生成します。

E-4031、急速な遅延整流 K チャネル¹⁰のブロックは、10 μ M (図 2 b) までの濃度依存的に 70% 約 65-リズムを減速します。最初の 5 分以内に効果が成長して次の 60 分以内は変わりません。速度の最大の減少は、(例えば、35-40 %cisapride、E-4031 の 70%、ドフェチリドの 90-95%) 変わることができるが、他は選択的 IKr ブロッカーは同様の効果を生成します。この格差には知られていません。

テトロドトキシン、速い Na チャネル¹¹のブロックは、1-30 μ M (図 2) までの濃度依存的に約 15% のリズムを減速します。効果は最初の 5 分以内も開発され、それは次の 60 分以内あまりを変化しません。しかし、30 分後に 1 μ M の上に逮捕に対し 30 μ M 以上テトロドトキシンは最初の 5 分以内は、暴行を阻止します。リドカイン、メキシレチンなどの他の Na チャネル遮断薬は、まったく同様の効果を生成します。

Bepridil、心臓 Na, Ca, K チャネル⁹の混合のブロッカーはまた全か無かの影響 (図 2 D) を生成します。この準備の Na チャネルのブロックは bepridil の主な作用が示唆されました。Ca チャネル ブロックによる加速度を見ていないと IKr ブロックによる減速より進歩的な Na チャネル効果によるマスク表示されます。

図 1: 代表的なベースライン Ca 波 384 ウェル プレートにします。(A) プレート間のすべての井戸が小さな変動で通常打撃率を示します。この画像は、プレート リーダー ソフトウェアから直接キャプチャされます。各トレースは 10 時間で s。蛍光強度は任意 (相対光台ビデオカメラ グレースケールから派生した) です。(B) 1 つの 10 のこの爆発のトレースは、信号の低ノイズを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 心臓のイオンの代表的な効果拮抗します。これらのパネルは選択性 Na チャネル遮断薬 TTX と (D) 非選択性チャネル、選択的な Ca チャネル ブロッカー アムロジピン、(B) 選択的 IKr ブロッカー E-4031、(C) (A) の濃度-反応曲線を表示します。ブロックの bepridil。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

2 つの側面は成功の記録周波数を破っての最も重要です。最初は、セルめっきと文化に注意を行使することです。特に、しようとする媒体を交換するときに井戸の底で細胞層を傷つけないことが重要です。ピペットで井戸の底に接触してかまいませんが、たびに、それによって細胞層とアッセイのパフォーマンスに影響を及ぼしていない小さな傷のみを生産、同じ角度を使用する必要があります。再現性のある均一なリズムを得る 2 つ目の重要な側面は、測定の期間のセル板全体 37 ° C で良い温度制御を提供することです。我々 はここでは、使用するプレート リーダー以外のデバイスを使用して、この均質を取得できませんでしたが、それは体温調節に特別な変更可能であること: 板の単一ブランドを超えてより広く利用可能なここで提示されたプロトコルになります。リーダー。ここで使用されるデバイスと実験の期間の温度安定性を達成するために; それが終了する前に、各録音を停止する必要があります。それ以外の場合、ロボットは、測定セル板を取り出すでしょう。この技術的な問題は、プレート リーダー ソフトウェアの次のリリースで消えることがありますが、今のところが重要であります。セル板をプレート リーダー外誤って転送する場合それはできるだけ早く内部に戻って読み込む必要があります。それにもかかわらず、温度変化非常に急速に暴行率に影響を与えるので、実験の質が悪くなります。

、徹底的にテストされていない、いくつか他の側面は、重要度の低い可能性があります。たとえば、による CM メーカーは、細胞を播種する前に細胞培養プレートのコーティングをお勧めしますが、この特定のアッセイでコーティングされていない、細胞付着様々 な面で非常に簡単に、正しくコート 384 ウェルに非常に難しいのでプレート。しかし、細胞板のコーティングがあります許容、またはアッセイの品質を改善するかもしれない。また決して DMSO 以外の溶媒を認めることが、他の録音の技術と経験から、エタノールまたはメタノールのような濃度も耐えられるだろうかどうかをテストしました。我々 は通常、同じ製造元からによる CMs を使用し、同様の方法で動作するように登場した、1 つだけ他のサプライヤーからの細胞を調べた。同様に、彼らの最初のバッチにも同様の振る舞いを確認するそれらを個によって選択されたによる CMs の異なるバッチの数が少ないを使用しています。1 つまたは 2 つのバッチは、ここでその分離安定性の悪いまたは培養条件下で再現性があったので不適切な使用と判断されました。そうでなければ、薬理学登場似てバッチ間で「典型的な」化合物 (フォルスコリン、N6-シクロペンチルホモログ-アデノシンと E-4031 と同様、エンドセリン、イソプロテレノール、アムロジピン、ponesimod) の限られたパネルをテストするとき。健康なドナー由来による CM のみ使いました。チロシンキナーゼ阻害剤の心毒性を評価する際、健常者と患者との間の差は認められなかったものの、心臓病患者由来による CM は、異なる結果を提供するかどうかを評価する価値があるかもしれません¹²します最後に、我々 は通常薬剤の効果を計測する前に 22-28 日間培養を待つ: インピー ダンス (細胞層の安定性の指標) と高速インピー ダンス (インジケーターの同じセルのインピー ダンスの録音での経験、の定常状態が遅くなる。周波数を破って) と、15 日間の培養 12-の後で達されます。ただし、これはとき心臓チャネルの成熟マーカー発現プロファイルは安定して¹³時間なので 22-に 28 日を待つことにしました。セルは、以前またはそれ以降を使用した場合と同等の結果になるかどうか検討されてこなかった。

説明プロトコルはここで人間の心臓電気生理に対する潜在的な薬剤の効果を評価するのにこと CM 自発速度の非常に簡単な測定を使用します。他の方法論上の主な利点として i) それはハイスループットス クリーニング環境に従う、ii) それは心筋細胞の活動と生理的温度で薬剤の効果を記録、iii) それは必要としない、します。電気生理学的専門知識、実行、結果の評価。

多くの薬剤が人間の使用のために承認を実行検証研究ではアッセイは、既存の臨床データ⁵によって予測された人間の医学で使われる薬に反応することを示した。このメソッドは、心臓のリズム上のすべての潜在的な効果を考慮される、ため、包括的な体外Proarrhythmic 試金 (CiPA) イニシアティブ¹⁴プロ不整脈の可能性を具体的に評価するを補完します。

将来は、このメソッドは、自発レートに影響する薬の行動モードのさらなる理解を提供可能性があります。機構の詳細は Ca トランジェント (例えば、彼らの振幅または図形) の蛍光の録音である可能性が高いです。蛍光録画が実行された場合より高い購入率 (例えば、30 Hz) でこれらのパラメーターが簡単に暴行率に加えて抽出し、の既知の影響とこれらのパラメーターの変更を関連付けるは興味深いことがあります。臨床的に薬剤を使用しました。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
FDSS7000 fluorescent plate reader	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	not a catalog item
FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit	Hamamatsu Photonics (Massy, France)		installed initially in the device
FDSS7000 temperature control	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	A10118-09
FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	C11653-11
FDSS7000 pipet tips for 384-well plates	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	A8687-62
Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	U8524-12	optional alternative to the Igor Pro software
Igor Pro data analysis software	Wavemetrics (Portland, Oregon, USA)	Latest version
iCell-Cardiomyocytes Kit	Cellular Dynamics International (Madison, WI)	R1106	includes cells, plating and maintenance media
Cor.4U Cardiomyocyte Kit	Ncardia Germany (Cologne, Germany)	Ax-B-HC02-4M	includes cells, plating and maintenance media alternative to the iCell-Cardiomyocytes
384-well cell culture plates	Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)	781091
384-well compound plates	Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)	781280
FLIPR Calcium 4 Assay Kit	Molecular Devices (Sunnyvale, California)	R8142
Forskolin	Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland)	F6886
N6-cyclopentyl-adenosine	Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland)	C8031
E-4031	Enzo Life Sciences (Lausen, Switzerland)	BML-KC158
Penicillin-Streptomycin solution	Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland)	15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland)	15250061