384-şey plakaları ısı kontrollü bir Ca duyarlı floresan boya ile ölçülen insan IPSC türetilmiş Cardiomyocyte Syncytia kasılmalar

Özet

Kendiliğinden müteahhitlik insan kaynaklı pluripotent türetilmiş cardiomyocytes syncytia kök hücre insan kalp fizyolojisi ve farmakoloji yararlı modelleri vardır. Burada frekans yenerek, bir Ca duyarlı floresan boya ve ısı kontrollü görüntüleme çok iyi plaka okuyucu kullanarak eksojen bileşikler etkilerini ölçmek için bir yüksek-den geçerek tarama sistemi mevcut.

Özet

Kendiliğinden insan kaynaklı pluripotent türetilmiş cardiomyocytes syncytia sözleşme kök hücreler (hiPSC-CM) insan kalp fizyolojisi ve farmakoloji uzun bir faydalı model vardır. Bu kendiliğinden etkinliklerini kaydetmek için ve ilaç etkileri değerlendirmek için çeşitli yöntemler önerilmiştir ama bu yöntemlerin çoğu sınırlı işlem hacmi ve/veya fizyolojik alaka gelen acı. Bir Ca duyarlı floresan boya ve ısı kontrollü görüntüleme çok iyi plaka okuyucu kullanarak hiPSC-CM'ın dayak frekans, eksojen bileşikler etkilerini ölçmek için bir yüksek-den geçerek tarama sistemi geliştirdik. Biz hücre plakaları ve bileşik plakaları karşı hazırlıklı olma ve yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik elde etmek için otomatik tahlil çalıştırmak açıklanmaktadır. Ayrıca nasıl dönüştürmek ve spontan ritim üzerinde uyuşturucu etkileri güvenilir ölçüleri sağlamak için floresans verileri çözümlemek için açıklar. Bu tahlil ilaç bulma programları Kılavuzu kimyasal optimizasyon merkezden uzağa veya doğru insan kardiyak fonksiyon etkileyen bileşikler için kullanılabilir.

Giriş

Mevcut iletişim kuralı üzerinde syncytia hiPSC-cm fizyolojik ilgili ritimleri, kendiliğinden dayak sıklığını uyuşturucu etkileri ölçmek için bir yöntem gösterilmektedir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler kendiliğinden dayak syncytia vitro^1,2,3,4kurmak fonksiyonel cardiomyocytes ayırabilirsiniz. Bu hiPSC-CM çok sayıda üretim Laboratuvarı veya ticari satıcıları aracılığıyla elde edilebilir ve onlar hücre insan kalp fizyolojisi ve farmakoloji modelleri oluşturmak için yararlı bir kaynaktır. Özellikle, tahmin etmek için ya da bir uyuşturucu insanlar⁵' e yönetilir oluşabilir kardiyak etkileri tanımlamak için kullanılabilir.

HiPSC-CM syncytia dayak sıklığını elektrot diziler veya empedans¹algılama kullanarak fizyolojik koşullar altında ölçülebilir: noninvaziv bu teknikleri üzerinde uyuşturucu etkileri çok ayrıntılı bilgi sağlar, ancak oldukça vardır düşük işlem hacmi ve onlar büyük bileşik kitaplıkları gerçekçi zaman ve bütçe kısıtlamaları içinde test etkinleştirmeyin. Daha etkili bir sistem plaka okuyucu Imaging 384-şey floresan kullanarak özenli ve Ca duyarlı boya⁶ama klasik plaka okuyucu suboptimal sıcaklık kontrol ve yakalama frekans tarafından engellemiştir. Bu sınırlamalar unphysiological dayak oranları (~ 15 bpm, 35-55 bpm kontrollü ortamlarda¹karşılaştırıldığında) tarafından gösterilmiştir ve yanlış Ca sinyal çözünürlükte (bir edinme 8 Hz sıklığıdır alt sınırı 120 bpm ulaşabilirsiniz kayıt oranları uyarılan koşullarda ve eğim veya süresi gibi bilgileri ayıklanamıyor). Burada açıklanan yöntemi fizyolojik ritimleri ve bu endişeleri önlemek için yeterli çözünürlükte desenleri yenerek kayıt birleştirir.

Pozitif tarafta, bu bileşikler makul maliyetle çok sayıda hızlı test sağlayan basit, güvenilir ve yüksek üretim yöntemidir. Olumsuz tarafta, bu yöntem pahalı bir yatırımdır, etkili sıcaklık kontrolü ile hızlı plaka okuyucu gerektirir ve daha fazla daha ayrıntılı test gerektiren gözlenen uyuşturucu etkileri küçük mekanik bilgiler sağlar yöntemleri.

Approximatively 6 x 10⁶ hiPSC-CM bir 384-şey hücre plaka bir ölçüm için ihtiyaç vardır. hiPSC-CM genellikle sağlanan ticari olarak ~ 4 x 1 mL 10⁶ hücrelerde donmuş aliquots. Bu nedenle, üç donmuş aliquots ile iki hücre tabak hazırlamak uygundur. Çoğu durumda, bu tahlil düşük değişkenlik nedeniyle her hücre plaka ölçüleri olumlu denetimlerinin (forskolin, N6-cyclopentyl-Adenozin ve E-4031) quadruplicate ve test bileşiklerin yinelenen ölçümleri gerçekleştirmek yeterlidir ve negatif kontrol (DMSO yalnız) 20-plicate ölçümleri. Bu nedenle, en fazla 352 bileşik/konsantrasyon çiftleri iki 384-şey hücre tabak ile değerlendirilebilir. Aşağıdaki iletişim kuralı 352 test bileşikleri, iki hücre tabak ve 12 milyon hücre üç donmuş aliquots sağlanan yanında böyle bir deneme olarak görüyor; ek veri noktaları gerekirse kolayca ölçekli-up olabilir.

Protokol

1. hücre plakaları hazırlanması

Not: hücre plakaları 3-4 hafta önce uyuşturucu etkileri ölçümü hazırlayın.

1. Denemenin 0 gün
   Not: planlama amacıyla, sınama bileşik uygulaması herhangi bir gün gün 22-28 deneme arasında gerçekleştirilebilir.
   1. Su banyosu 37 ° C'de açmak ve (üretici tarafından sağlanan gibi) kaplama orta 40 mL sıcak.
      Not: hücreleri onların tedarikçi tarafından sağlanan eşleşen kültür ve bakım kitle iletişim araçları ile kullanın.
   2. HiPSC-CM su banyosu 2 min için dondurulmuş hücreleri içeren cryotubes koyarak çözülme.
   3. 1 mL hücre süspansiyonlar dikkatle 50 mL konik tüp aktarın.
   4. Her cryotube arta kalan hücreleri almak ve yıkama medya aynı konik tüp için adım 1.1.3 içeren hücrelerden eklemek için sıcak kaplama orta 1 mL ile yıkayın.
   5. Dikkatli bir şekilde başka bir 8 mL sıcak kaplama Orta hücre süspansiyon karıştırın.
   6. Trypan mavi dışlama yöntemi ve hematocytometer⁸kullanarak canlı hücreleri saymak.
      Not: 6 x 10⁶ şartı hücreleri için bir 384-şey hücre plaka deneyimlerimize maksimum olduğu %20 ölü hücreleri donmuş hücreleri arasında olasılığını dikkate alır.
   7. Hücre süspansiyon 5 x 10⁵ canlı hücre/ml sıcak kaplama orta ile ayarlayın.
   8. Hücre süspansiyon için her şey (iyi başına yaklaşık 12.500 hücreleri) 25 µL ekleyerek iki 384-şey hücre kalıplara dağıtın.
      Not: Hücre plakaları ile herhangi bir matris precoated gerekmez ( konuyabakın).
   9. 37 ° c oksijen bir atmosferde % 5 CO₂içeren hücre plakaları korumak.
2. Gün 1 deneme
   1. 37 ° C ve bakım orta % 1 v/v penisilin-streptomisin çözüm ile desteklenmiş 50 mL sıcak su banyosu açın.
   2. 50 µL sıcak bakım orta her iyi hücre plakaların kaplama orta yerine.
3. Gün 2-(en çok gün 27) 21 deneme
   Not: sigara bölen olduğu gibi herhangi bir bu süre içinde passaging hiPSC-CMs gerekmez hücreleri.
   1. Bakım orta yarısı 3 gün her 2-yenilemek ve tamamen, 7, 14 ve 21 günlerde yenilemek.
      Not: 22 ve deneme 28 gün arasında floresans ölçüm gerçekleştirilir. Daha uzun süreler hiç denemedim ama hala iyi olabilirsin.

2. araç, bileşik plakaları ve tahlil plakaları hazırlanması

Not: hazırlamak enstrüman, bileşik plakaları ve tahlil plakaları uyuşturucu etkileri, 22-28 deneme gün arasında ölçüm günü. Sıcaklık kontrolü ve uygun floresan filtre seti ve uyarma ışık ile donatılmış bir floresan plaka okuyucu kullanın kaynak. Örneğin, bir Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 floresan filtre seti kullanın (uyarma: 472 nm; Emisyon: 520-560 nm) ve 150 W uyarma ışık kaynağı birimi.

1. İlk hücre plaka ölçüm için plaka okuyucu içinde yerleştirilmesi için önce en az 2 h okuyucu üzerinde açın ve Isıtma sistemi 37 ° C'de ayarlayın
   Not: Bu akşam önce yapılabilir.
2. Pozitif denetimleri, forskolin, N6-cyclopentyl-Adenozin ve E-4031 hisse senedi çözümleri DMSO, DMSO 10 mM ve 3.33 mM H2O, 0,33 mm olarak anılan sıraya göre hazırlayın.
   Not: stok çözümleri 333-fold seyreltilmiş zamanla bunlar hücrelere eklenir ve amaç 1 µM forskolin, 30 µM N6-cyclopentyl-Adenozin ve 10 µM son test konsantrasyonları elde etmektir güvenilir ve tekrarlanabilir efektler oluşturmak E-4031.
3. 352 test bileşikler olarak DMSO hisse senedi çözümleri 333-fold planlanan test konsantrasyonları (Örneğin, bir test 30 µM için 10 mM), hazır olun.
   Not: Amaç %0,3 (v/v) DMSO hücre plaka son bir konsantrasyon bileşik uygulamadan sonra elde etmektir; cardiomyocytes ritmik etkinliği etkilemez en DMSO yoğun bu. Hisse senedi çözümleri de önceki gün hazır olun. En az 5 µL hisse senedi çözüm yinelenen her ölçüm için gereklidir.
4. Bileşik plakaları hazırlayın.
   1. Bakım orta % 1 v/v penisilin-streptomisin çözüm Oda sıcaklığı ile takıma 40 mL sıcak.
   2. Hisse senedi çözüm iyi başına 1,5 µL ekleyerek iki 384-şey bileşik kalıplara dağıtmak: i) test bileşikler (iki kuyu her), pozitif II) denetimleri (forskolin, N6-cyclopentyl-Adenozin ve E-4031, dört kuyu her bileşik plaka başına) ve III) negatif Denetim (DMSO, bileşik plaka başına 20 kuyu).
   3. 100 x g 1 dk. için de bileşik plakaları santrifüj kapasitesi.
   4. Bakım orta 37 µL her şey (Bu aşamada 38,5 µL % 3,9 DMSO) Oda sıcaklığında ekleyin.
   5. 100 x g 1 dk. için de bileşik plakaları santrifüj kapasitesi.
   6. Bileşik plakaları plaka okuyucu yükleyin.
      Not: Sonraki adımlar en kısa zamanda bileşik plakaları buharlaşma en aza indirmek için yapılmalıdır.
5. Floresan boya hazırlamak.
   1. 37 ° C ve bakım orta % 1 v/v penisilin-streptomisin çözüm ile desteklenmiş sıcak 100 mL su banyosu açın.
   2. Ca-duyarlı floresan boya ve içki 10 mL sıcak bakım orta antibiyotik ile yeniden oluşturma.
      Not: Bu hisse senedi floresans orta Ca duyarlı floresan boya, genellikle Fluo-4 ve bir içki içerir ve herhangi bir artık 4 ° C'de en az 5 gün süreyle saklanabilir.

3. veri toplama

Not: veri toplama uyuşturucu etkileri ölçüm günü gerçekleştirmek. Adımları izleyerek 3.1-.10 tamamen için ilk hücre plaka, sonra onları ikinci hücre plaka için yineleyin.

1. Plaka okuyucu bilgisayar yazılımı (gerekirse) başlatın ve damlalıklı ipuçları yüklemek.
2. Kalsiyum dalgalar 2 dk segmentinin en az 10 Hertz temel Dayak oranı her şey için tanımlamak için bir satın alma sıklığı ile kaydetmek için yazılım ayarları.
3. Bir hücre plaka için hisse senedi floresans orta 3 mL 12 mL sıcak bakım orta floresan orta yapmak için antibiyotik içine oranında seyreltin.
4. Her iyi hücre plaka orta 20 µL floresans orta 30 µL ile değiştirin.
5. Yukarı ve aşağı 1 x-karıştırmak için pipet.
6. Hücre plaka plaka okuyucu için sıcaklık parkenizin hiPSC CM izin için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde yerleştirin.
7. 60 dakika için veri toplama başlamadan önce bekleyin.
8. Veri toplama Ca dalgalar 2 dk segmentinin en az 10 Hz oranı her şey için dayak temel tanımlamak, bir satın alma sıklığı ile kaydetmek için plaka okuyucu yazılım başlatın.
   Not: her kayıt dizisi için hücre plaka değil transfer otomatik olarak cihazın dışında veri toplama sonra emin olun. Bu hücre plaka oda sıcaklığında soğutma engeller. Plaka okuyucu yazılım bazı sürümleri ile bunu başarmak için tamamen bitmeden her kaydı durdurmak gerekli olabilir.
9. İyi-iyi 5 µL bileşik plaka hücre plaka pipetting tarafından test ve referans bileşikleri plaka okuyucu robot ile eklemek (eklenmesinden sonra DMSO konsantrasyon %0,3 [v/v] 's).
10. Veri toplama plaka okuyucu yazılım kayıt 2 dk kesimine 5, 15, 30, 45 ve 60 dk hakkında bileşik toplama sonra başlayan Ca dalgaların başlatmak (hücre levha kalıyor her zaman cihazý emin olun).

4. veri analizi

Not: veri analizi herhangi bir süre sonra ölçüm yapılabilir.

1. Ham veri--dan plaka okuyucu bilgisayar yazılımı her kayıt döneminde ASCII metin dosyaları olarak dışa aktarın.
2. Veri analiz yazılımı ham veri.
3. Her şey ve bütün zaman puan için birincil dayak frekans ayıklayın.
   Not: Tablo reçetesilistelenen veri analiz yazılımı ile frekansları yenerek en küçük kareler spektral analiz^{7 Lomb – Scargle yöntemiyle alan LombPeriodogram işlevini kullanarak bir özel analiz rutin ile hesaplanabilir} . Periodogram frekansları 0,01 ve 5 Hz arasında bir dizi için hesaplanmalıdır. Birincil frekans PeakAutoFind rutinleri kullanılarak periodogram elde edilebilir. Bu analiz yöntemi Frekanslar plaka okuyucu yazılımı ile isteğe bağlı olarak sağlanan yöntem daha yenerek daha doğru ölçümler sağlar. Yazılım özelleştirme bir seçenek değilse ancak, ikincisi hala kullanılabilir.
4. Birincil dayak frekanslar için veri analiz yazılımı her kayıt döneminden panoya kopyalar veya ASCII metin dosyaları olarak dışa aktarın.
5. Birincil dayak Frekanslar Pano yapıştırma veya metin dosyası alma tarafından bir elektronik tablo yazılımı alın.
   Not: adımları 4.5-4.9 herhangi bir modern elektronik tablo yazılımda gerçekleştirilebilir.
6. Her şey için satır taban çizgisine dayak frekans, her zaman bir noktada ilaç uygulama sonra normale (5, 15, 30, 45 ve 60 dk) o zaman birincil dayak frekans bölünmesi ile temel birincil dayak frekansta ölçütü üzerine gelin.
7. İlaç uygulama sonra her zaman bir noktada ortalama DMSO etkisini hesaplayın (5, 15, 30, 45 ve 60 dk) nerede DMSO uygulandığı 20 kuyuları için normalleştirilmiş değerlerin ortalamasını tarafından.
8. Her şey ve her zaman uyuşturucu uygulamadan sonra gelin için (5, 15, 30, 45 ve 60 dk), çıkarma (zaman uyumlu) ortalama DMSO etkisi aynı plaka için.
9. Yinelenen ölçümler ortalama.
   Not: bileşik aritmiler üretilen olup olmadığını bir bileşik sıklığını değiştirir veya yazılım birincil bir frekans bileşik toplama sonra bulamamanız durumunda, dayak deseninin görsel muayene değerlendirebilir.

Sonuçlar

Şekil 1 bir 384-şey plaka arasında temel Ca dalgaları temsilcisi kaydı gösterir. Çoğu durumda, tüm wells bir düzenli dayak oranı ile küçük değişkenlik plaka arasında ortaya (± SD demek = 40,1 ± 3,5 bpm; aralığı 34 – 54 bpm =). Çok nadiren (daha az 1 10 deneyler), kalp ritim bozukluğu ya da ritim yokluğu birkaç wells (5'ten az) sahip. Üç 384-şey levha, biz-si olmak da güvenilir cardiomyocytes başka bir tedarikçiden ( Tablo malzemelerigörmek) ve spontan dayak için çok benzer temel değerleri elde.

Kardiyak iyon kanal blokerleri tekrarlanabilir şekilde⁵cardiomyocytes ritmine etkiler. Amlodipin, bir engelleyici yavaş Ca kanal⁹, 1 µM (Şekil 2A) kadar bir konsantrasyon bağımlı şekilde ritim fazla %100 hızlandırır. Etkisi iyi ilk 5 dk içinde geliştirilmiştir, ancak bu stabilize önce hala approximatively sonraki 30 dk içinde % 50 artar. Aslında beklendiği gibi amlodipin 1 µM dayak (kesikli çizgiler), tutuklamalar bu Ca Bisiklete binme için kendiliğinden kasılma kritik. Diğer seçmeli dihydropyridine Ca kanal blokerleri çok benzer etkiler üretmek.

E-4031, bir engelleyici hızlı gecikmeli doğrultucu K kanal¹⁰, ritim yaklaşık 65-%70 10 µM (Şekil 2B) kadar bir konsantrasyon bağımlı şekilde hızlanan/yavaşlayan. Etkisi ilk 5 dk içinde gelişir ve 60 dk içinde değişiklik. Hızı maksimum azalma (Örneğin, 35 cisapride için-%40, E-4031% 70 ve % 90-%95 dofetilide için) değişebilir, ancak diğer seçmeli IKr blokerler benzer efektler oluşturmak. Bu eşitsizlik için temel bilinmemektedir.

Tetradotoksin, bir engelleyici hızlı Na kanal¹¹, 1-30 µM (Şekil 2C) kadar bir konsantrasyon bağımlı şekilde ritim yaklaşık % 15 hızlanan/yavaşlayan. Etkisi de ilk 5 dk içinde geliştirilen ve sonraki 60 dakika içinde çok fazla değişiklik değil. Ancak, bu 1 µM tutuklama 30 dak sonra ise 30 µM ilk 5 dk içinde dayak Tetradotoksin tutuklama. Lidokain veya mexiletine, gibi diğer Na kanal blokerleri benzer ya hep ya hiç efektler oluşturmak.

Bepridil, karışık bir engelleyici kardiyak Na, Ca ve K kanal⁹, ayrıca bir ya hep ya hiç efekti (Şekil 2B) oluşturur. Bu bu hazırlık, bepridil birincil eylemi Na kanalları bir parçası olduğunu göstermektedir. Ca channel bloğu nedeniyle bir ivme görmedim ve yavaşlama nedeniyle IKr blok daha fazla ilerici Na kanal etkisiyle maskeli görünür.

Şekil 1: temsilcisi temel Ca dalgalar arasında 384-şey plaka. (A)plaka arasında bütün wells düzenli dayak oranı ile küçük değişkenlik göstermektedir. Bu görüntü doğrudan plaka okuyucu yazılımından yakalanır. 10 her izidir süresi içinde s. Floresan yoğunluğu (video kamera greyscale türetilmiş rasgele göreli ışık) birimdir. (B) bu şişme bir 10 s izleme düşük gürültü sinyal gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: kardiyak iyon temsilcisi etkileri kanal blokerleri. Bu paneller konsantrasyon-yanıt eğrileri (A) seçmeli Ca kanal engelleyici amlodipin, (B) seçmeli IKr engelleyici E-4031, (C) ile seçici Na kanal engelleyici TTX ve (D) seçmeli kanal göster kütük parçası bepridil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

İki Frekanslar yenerek başarılı kayıt için en kritik'dır. İlk hücre kaplama ve kültürü ile dikkatli olmaktır. Özellikle, deneyin ve ne zaman orta alışverişi hücre katmanı kuyu dibinde çizilmemesi önlemek önemlidir. Pipetler ile kuyu dibinde dokunmak kabul edilir, ancak aynı açı-meli var olmak kullanılmış ne zaman böylece üreten hücre katmanı ve tahlil performansını etkileyen değil sadece küçük bir çizik. Tekrarlanabilir homojen ritimleri alma ikinci önemli bir özelliği, ölçüm süresi için hücre plaka arasında iyi sıcaklık kontrolü 37 ° C'de sağlamaktır. Biz burada kullanılan plaka okuyucu dışındaki aygıtlar kullanarak bu homojenliği elde edilemedi, ama sıcaklık regülasyonu için özel değişiklikler ile mümkün olabilir: burada sunulan protokolü daha geniş plaka ötesinde bir tek marka kullanılabilir hale getirmek okuyucu. Sıcaklık kararlılığı deneme süresince burada kullanılan aygıt ile elde etmek için bu sona ermeden önce her kaydı durdurmak gerekli; Aksi takdirde, robot ölçülen hücre plaka dışarı atmak. Bu teknik sorun plaka okuyucu yazılımı sonraki sürümü ile kaybolabilir, ancak şu an için kritik kalır. Bir hücre tabak yanlışlıkla plaka okuyucu dışında transfer edilirse, bu içeri kısa sürede yüklenebilir. Deneme kalitesini sıcaklık değişiklikleri dayak oranı son derece hızlı bir şekilde etkileyeceği yine de, bozulacaktır.

İyice sınanmamıştır, bazı diğer yönleri daha az önemli olabilir. Örneğin, hücreleri tohum önce kaplama hücre kültürü kaplamalar hiPSC-CM üreticileri tavsiye, ancak bu özel tahlil, kaplama, hücreleri kolayca çeşitli yüzeylerde uygun ve düzgün kat 384-şey çok zordur çünkü kullanılmadı tabaklar. Henüz, hücre levha kaplama hala izin verilen olabilir veya hatta tahlil kalitesini artırmak. Ayrıca hiç olsun çözücüler DMSO dışındaki kabul edilebilir, ama bu deneyimi diğer kayıt teknolojileri ile alkol veya MeOH benzer konsantrasyonları da tolere edilebilir olacaktır beklenen test ettik. Biz genellikle hiPSC-CMs aynı üreticinin kullanım ve benzer bir şekilde çalışmak için ortaya hücreleri tek bir ek tedarikçiden denendi. Aynı şekilde, biz onları prechecking tarafından ilk toplu işlemine benzer şekilde davrandığını doğrulamak üzere seçildi hiPSC-CMS farklı toplu işlemleri yalnızca az sayıda kullandık. Bir veya iki toplu işlemi uygun olmayan zavallı istikrar veya tekrarlanabilirlik kültür koşullar altında onların syncytia vardı çünkü burada kullanılan kabul edildi. Aksi takdirde, farmakoloji toplu işlemleri arasında "tipik" bileşikler (forskolin, N6-cyclopentyl-Adenozin ve E-4031, hem de endotelin, isoproterenol, amlodipin ve ponesimod) sınırlı bir panel test ederken çok benzer ortaya çıktı. Sadece hiPSC-CM sağlıklı bağış elde ederdik. HiPSC-CM kalp hastalığı olan hastalarda elde farklı sonuçlar sağlayacak sağlıklı bağış ve hastalar arasında hiçbir fark Tirozin kinaz inhibitörleri rastlantısal değerlendirirken gözlendi rağmen değerlendirmek için faydalı olabilir ¹². son olarak, normalde 22-28 uyuşturucu etkileri ölçme önce gün kültür bekleyin: empedans kayıtları aynı hücre ile deneyim, kararlı bir duruma için yavaş Empedans (hücre katmanı istikrar bir gösterge) ve hızlı Empedans (bir göstergesi frekans yenerek) 12-'den sonra 15 gün içinde kültür ulaşılır. Bu otelde kalp kanalları ve olgunlaşma işaretleri ifade profil¹³stabilize zaman olduğundan Ancak, biz 22-28 gün, beklemeye karar verdim. Eğer hücreleri önceye ya da sonraya kullanılan benzer sonuçlar elde o incelenmiştir değil.

Açıklanan protokol hiPSC-cm kendiliğinden dayak oranının çok basit bir ölçüm üzerinde insan kalp Elektrofizyoloji potansiyel uyuşturucu etkileri değerlendirmek için burada kullanır. İ) Bu bir yüksek-den geçerek tarama ortamına mükellef, II) o kayıtları cardiomyocytes etkinliği ve fizyolojik sıcaklıklarda ilaçların etkileri ve III) o does değil istemek diğer yöntemlerden üzerinde başlıca avantajları vardır elektrofizyolojik uzmanlık bir değerlendirme sonuçlarının veya yürütme için.

Birçok ilaç insan kullanımı için onaylanmış ile gerçekleştirilen bir doğrulama çalışmada, tahlil mevcut klinik veri⁵tahmin ettiği gibi insan tıpta kullanılan ilaçlara tepki gösterdi. Bu yöntem kalp ritim tüm potansiyel etkileri dikkate alır çünkü, özellikle pro aritmik potansiyel değerlendiriyor kapsamlı vitro Proarrhythmic tahlil (CIPA) girişimi¹⁴ tamamlar.

Gelecekte, bu yöntem modu-in-eylem kendiliğinden dayak oranı etkiler için gösterilen ilaçların daha fazla anlayış verebilir. Bu ek mekanik bilgi Ca geçişler (Örneğin, genlik veya şekli) Floresan kayıtları bulunması olasıdır. Floresans kayıtları gerçekleştirilmesi durumunda yüksek edinme oranları (Örneğin, 30 Hz), bu parametreleri kolayca oranı yenerek ek olarak ayıklanır ve bu parametreler değişiklikleri bilinen etkileri ile ilişkilendirmek ilginç olabilir klinik olarak kullanılan ilaç.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
FDSS7000 fluorescent plate reader	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	not a catalog item
FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit	Hamamatsu Photonics (Massy, France)		installed initially in the device
FDSS7000 temperature control	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	A10118-09
FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	C11653-11
FDSS7000 pipet tips for 384-well plates	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	A8687-62
Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	U8524-12	optional alternative to the Igor Pro software
Igor Pro data analysis software	Wavemetrics (Portland, Oregon, USA)	Latest version
iCell-Cardiomyocytes Kit	Cellular Dynamics International (Madison, WI)	R1106	includes cells, plating and maintenance media
Cor.4U Cardiomyocyte Kit	Ncardia Germany (Cologne, Germany)	Ax-B-HC02-4M	includes cells, plating and maintenance media alternative to the iCell-Cardiomyocytes
384-well cell culture plates	Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)	781091
384-well compound plates	Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)	781280
FLIPR Calcium 4 Assay Kit	Molecular Devices (Sunnyvale, California)	R8142
Forskolin	Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland)	F6886
N6-cyclopentyl-adenosine	Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland)	C8031
E-4031	Enzo Life Sciences (Lausen, Switzerland)	BML-KC158
Penicillin-Streptomycin solution	Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland)	15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland)	15250061