Схватки Syncytia человека iPSC производные Cardiomyocyte измеряется с Ca чувствительных Люминесцентную краску в контролируемой температурой 384-ну пластины

Резюме

Спонтанно Договаривающихся syncytia кардиомиоцитов, производный от человека индуцированные плюрипотентные стволовые клетки являются полезной модели человеческого сердца физиологии и фармакологии. Здесь мы представляем систему высокопроизводительного скрининга для количественного определения эффектов экзогенных соединений на избиение частоты, используя Ca чувствительных Люминесцентную краску и контролем температуры изображений несколькими хорошо пластины читателя.

Аннотация

Спонтанно Договаривающихся syncytia кардиомиоцитов, производный от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC см) являются полезной модели человеческого сердца физиологии и фармакологии. Были предложены различные методы для записи этой спонтанной активности и оценить эффекты наркотиков, но многие из этих методов страдают от ограниченной пропускной способности и/или физиологической значимости. Мы разработали систему высокопроизводительного скрининга для количественного определения воздействия внешних соединений на hiPSC-CM частоты биений, используя Ca чувствительных Люминесцентную краску и контролем температуры изображений несколькими хорошо пластины читателя. Мы опишем, как подготовить сотовый плит и составные пластин и как запускать автоматизированные assay для достижения высокой чувствительностью и воспроизводимость. Мы также описывают, как для преобразования и анализа данных флуоресценции для предоставления надежных мер воздействия препарата на спонтанный ритм. Этот assay может использоваться в программах обнаружения наркотиков для руководства химических оптимизация, или выгнутых, соединений, влияющих на функции человеческого сердца.

Введение

Настоящий Протокол описывает метод для измерения воздействия наркотиков на частоте спонтанных избиение syncytia hiPSC-см на физиологически соответствующих ритмов. Человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток могут дифференцироваться в функциональных кардиомиоцитов, которые устанавливают спонтанно syncytia избиение в пробирке^3,1,2,4. Эти hiPSC см могут быть получены в большом количестве через коммерческих провайдеров или производства в лаборатории, и они являются полезным источником клеток для создания модели человеческого сердца физиологии и фармакологии. В частности они могут использоваться для прогнозирования или характеризовать сердечных эффектов, которые могут произойти, когда препарат вводят людей⁵.

Частота биений hiPSC-CM syncytia может быть измерена в физиологических условиях, с использованием микроэлектродные массивы или импеданса зондирования¹: эти неинвазивные методы обеспечивают очень подробную информацию о воздействии наркотиков, но они скорее низкая пропускная способность и они не позволяют тестирование большого комплекса библиотек в реалистичные сроки и бюджетные ограничения. Более эффективной системы может быть разработан с использованием 384-ну флуоресценции воображения читателя пластины и Ca чувствительных красителя⁶, но классическая пластины читателей препятствуют субоптимальные температуры контроля и приобретение частоты. Эти ограничения могут быть проиллюстрированы unphysiological избиение ставки (~ 15 bpm, по сравнению с 35-55 bpm в контролируемых условиях¹) и бедных Ca разрешение сигнала (приобретение частота 8 Гц — нижний предел для записи ставки, которые могут достигать 120 bpm стимулируется условиях, и не может извлекать информацию, такую как склон или длительность). Метод, описанный здесь сочетает в себе запись избиения узоры на физиологические ритмы и достаточным разрешением для предотвращения этих проблем.

На положительной стороне этот метод является простым, надежным и высокой пропускной способности, которая позволяет быстрое тестирование большого числа соединений по разумной цене. На отрицательной стороне этот метод требует Быстрый плита читателя с эффективной температуры, который является дорогим инвестиций, и он содержит мало механистический информацию о наблюдаемых наркотиков эффекты, которые могут потребовать дальнейших испытаний с более подробными методы.

Для одного измерения в одном плита клетки 384-ну необходимо приблизительно 6 x⁶ hiPSC 10СМ. hiPSC см обычно поставляются коммерчески замороженных аликвоты ~ 4 x 10⁶ клеток в 1 мл. Таким образом это удобно подготовить две ячейки пластины с тремя замороженными аликвоты. В большинстве случаев, вследствие низкой изменчивости этот assay, это достаточно для выполнения повторяющихся измерений испытаний соединений и в каждой ячейке пластина, quadruplicate измерения положительных элементов управления (форсколин, N6-cyclopentyl аденозин и E-4031), и 20-складчатых измерения отрицательного контроля (ДМСО только). Таким образом максимум 352 соединения/концентрации пар может оцениваться с двумя пластинами 384-ну клеток. Следующий протокол считает такой эксперимент с 352 тест соединения, две клетки пластины и 12 миллионов клеток, поставляется как три аликвоты замороженные; Это может быть легко увеличен, если нужны дополнительные данные точек.

протокол

1. Подготовка сотовый плит

Примечание: Подготовка клетки пластины 3–4 недели до начала измерения воздействия наркотиков.

1. День 0 эксперимента
   Примечание: для целей планирования, тест соединения приложение может выполняться на любой день между дней 22–28 эксперимента.
   1. Поверните на водяной бане при 37 ° C и теплый 40 мл среды покрытие (как поставляемые производителем).
      Примечание: Используйте клетки с их поставщик условии соответствия культуры и обслуживания средств массовой информации.
   2. Потепление hiPSC-CM, поместив cryotubes, содержащих замороженные клетки в водяной бане на 2 мин.
   3. Передать 1 мл суспензии клеток тщательно 50 мл Конические трубки.
   4. Мыть каждый cryotube с 1 мл теплой обшивка среднего для извлечения оставшихся клетки и добавить мыть СМИ же конической трубки от шаг 1.1.3 содержащих клеток.
   5. Смесь тщательно еще 8 мл теплой обшивка среднего в суспензию клеток.
   6. Количество живых клеток, используя метод исключения Трипановый синий и hematocytometer⁸.
      Примечание: требования 6 х 10⁶ клеток для одной плиты клетки 384-ну рассматривает возможность до 20% мертвых клеток среди замороженных клеток, который является максимум в нашем опыте.
   7. Отрегулируйте суспензию клеток 5 x 10⁵ живых клеток/мл с теплым обшивка среднего.
   8. Распределить суспензию клеток в двух пластин ячейки 384-Ну, добавляя 25 мкл для каждой скважины (около 12 500 ячеек на хорошо).
      Примечание: Сотовый плит не нужно быть ветротурбин с любой матрицы (см. обсуждение).
   9. Сохранить клетки пластины при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO₂.
2. 1 день эксперимента
   1. Поверните на водяной бане при 37 ° C и теплым 50 мл среды обслуживания дополняется раствора пенициллина и стрептомицина 1% v/v.
   2. Замените среднего покрытие 50 мкл теплое обслуживание среды в каждой скважине сотовый плит.
3. Дни 2–21 (до 27-й день) эксперимента
   Примечание: hiPSC-CMs не нужно любой пассированый за этот период, как они, без деления клеток.
   1. Возобновить половину среднего обслуживания каждые 2–3 дня и возобновить его полностью на 7, 14 и 21 дней.
      Примечание: Измерения флуоресценции может производиться между дней 22 и 28 эксперимента. Более длинней продолжительности не пробовал, но все еще могут быть в порядке.

2. подготовка инструмента, соединения плит и пластин Assay

Примечание: подготовка документа, составные плиты и пробирного пластины в день измерения воздействия наркотиков, между дней 22 и 28 эксперимента. Использование флуоресцентных пластины читателя, с контролем температуры и флуоресценции соответствующего фильтра kit и возбуждения света источника. Например, используйте комплект фильтров флуоресценции Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 (возбуждения: 472 Нм; выбросов: 520–560 Нм) и блок источника света возбуждения 150 Вт.

1. По крайней мере за 2 ч до первой ячейки пластина быть размещены внутри читатель пластины для измерения, включите читателя и системе отопления при температуре 37 ° C.
   Примечание: это может быть также сделано накануне вечером.
2. Подготовьте позитивные элементы, форсколин, N6-cyclopentyl аденозин и E-4031 как фондовый решения 0,33 мм в ДМСО, 10 мм в ДМСО и 3.33 мм H2O, соответственно.
   Примечание: фондовая решения будет разбавленным 333-fold к тому времени они добавляются к клеткам, и целью является достижение финальный тест концентрации 1 мкм форсколин, 30 мкм N6-cyclopentyl аденозин и 10 мкм E-4031, которые производят надежных и воспроизводимых эффекты.
3. Подготовьте 352 испытаний соединений как ДМСО акций решения при 333-fold запланированных испытаний концентрациях (например, 10 мм для теста на 30 мкм).
   Примечание: Цель – добиться конечной концентрации 0,3% (v/v) ДМСО в пластину клеток после составного приложения; Это самая высокая концентрация ДМСО, которая не влияет на ритмической активности кардиомиоцитов. Складе решения можно также готовить в день до. Для каждого дубликата измерения требуется минимум 5 мкл Стоковый раствор.
4. Подготовьте составные пластины.
   1. Теплый 40 мл обслуживания среды дополняют раствором пенициллина и стрептомицина 1% v/v до комнатной температуры.
   2. Распределить в две составные 384-ну пластины, добавляя 1.5 мкл Стоковый раствор в хорошо: i тест соединения (по две скважины), ii) позитивные элементы управления (форсколин, N6-cyclopentyl аденозин и E-4031, четыре скважины на составные пластину) и iii) отрицательный управления (ДМСО, 20 скважин на составные пластину).
   3. Центрифуга для соединения плит на 100 x g за 1 мин.
   4. Мкл 37 обслуживания среды при комнатной температуре для каждой скважины (3,9% ДМСО в 38,5 мкл на данном этапе).
   5. Центрифуга для соединения плит на 100 x g за 1 мин.
   6. Загрузите соединения плит плиты читателя.
      Примечание: Следующие шаги следует быть выполнены как можно скорее к минимуму испарения в составные пластины.
5. Подготовьте Люминесцентную краску.
   1. Поверните на водяной бане при 37 ° C и теплых 100 мл среды обслуживания дополняется раствора пенициллина и стрептомицина 1% v/v.
   2. Воссоздать Ca чувствительных Люминесцентную краску и утоления с 10 мл теплой обслуживания среды с помощью антибиотиков.
      Примечание: этот запасов флуоресценции носитель содержит Ca чувствительных Люминесцентную краску, обычно Fluo-4 и утоления, и любые остатки могут храниться при температуре 4 ° C для по крайней мере 5 дней.

3. сбор данных

Примечание: выполнить сбор данных в день измерения воздействия наркотиков. Выполните шаги 3.1–.10 полностью для первой ячейки пластины, затем повторять их для второй пластины ячейки.

1. Запустите программное обеспечение reader пластины (при необходимости) и загрузите накапайте советы.
2. Настройка программного обеспечения для записи 2 мин сегмент кальция волны с частотой приобретение по крайней мере 10 Герц для определения базовых избиение ставки для каждой скважины.
3. Для одной ячейки пластины разбавьте 3 мл запасов флуоресценции средних 12 мл теплой обслуживания среды с антибиотиками, чтобы сделать средство флуоресценции.
4. Замените 20 мкл среды в каждой скважине клетки пластины с 30 мкл флуоресценции среды.
5. Пипетка вверх и вниз, 1 x смешивать.
6. Место пластину клеток в считывающее устройство пластины как быстро, как можно скорее, чтобы акклиматизироваться к температуре hiPSC см.
7. Подождите 60 минут до начала сбора данных.
8. Начало сбора данных в программное обеспечение читателя пластины для записи 2 мин сегмент Ca волны с частотой приобретение по крайней мере 10 Гц, чтобы определить базовые, победив ставки для каждой скважины.
   Примечание: для каждой записи последовательности, убедитесь, что плита ячейки не переносится автоматически из устройства после сбора данных. Это предотвращает пластину клетки от охлаждения при комнатной температуре. С некоторыми версиями программного обеспечения пластины читателя может быть необходимо остановить каждую запись, прежде чем он полностью заканчивается для достижения этой цели.
9. Добавьте тест и ссылки соединений с роботом читателя пластины, закупорить скважины 5 мкл от составной плиты в пластину клетки (после того, концентрация ДМСО-0,3% [v/v]).
10. Начало сбора данных в пластине читателя программное обеспечение для записи 2 мин сегменты волн Ca, начиная примерно 5, 15, 30, 45 и 60 мин после нанесения смеси (убедитесь, что каждый раз, что клетки пластина остается в устройстве).

4. анализ данных

Примечание: анализ данных могут выполняться в любое время после измерения.

1. Экспорт необработанных данных для каждой записи период от программ чтения пластины как ASCII текстовых файлов.
2. Импорт необработанных данных в программное обеспечение для анализа данных.
3. Для каждой скважины и все моменты времени Извлеките основной избиение частоты.
   Примечание: С программным обеспечением анализа данных, перечисленные в Таблице материалов, победив частоты могут быть рассчитаны с обычной Пользовательский анализ, используя функцию LombPeriodogram, основанный на методе Lomb – Скарджла спектрального анализа наименьших квадратов⁷ . Периодограмм должна быть рассчитана на диапазон частот от 0,01 до 5 Гц. Основной частоты могут быть извлечены из периодограмм, с помощью процедуры PeakAutoFind. Этот метод анализа обеспечивает более точные измерения, избиение частотах, чем метод поставляется как опция с программным обеспечением чтения пластины. Однако последний может все еще использоваться если настройки программного обеспечения не является альтернативой.
4. Экспорт основной избиение частоты для каждой записи период с программное обеспечение для анализа данных как копии буфера обмена или как текстовые файлы ASCII.
5. Импортируйте частоты первичного избиение в программного обеспечения таблицы буфера обмена вставки или импорта текстового файла.
   Примечание: шаги 4.5–4.9 могут быть выполнены в любой современной электронной таблицы программного обеспечения.
6. Для каждой скважины, нормализовать к базовой частоты биений в каждый момент времени после применения препарата (5, 15, 30, 45 и 60 мин) путем деления частоты первичного избиение в то время точки по частоте основного избиение в базовых.
7. Рассчитать средний эффект ДМСО в каждый момент времени после применения препарата (5, 15, 30, 45 и 60 мин) путем усреднения нормализованных значений для 20 скважин, где была применена ДМСО.
8. Для каждой скважины и каждый раз точки после применения препарата (5, 15, 30, 45 и 60 мин), вычесть среднее ДМСО эффект (время соответствия) для же пластины.
9. Средняя повторяющихся измерений.
   Примечание: Если соединение изменения частоты или программное обеспечение не может найти основной частоты после соединения того, визуальный осмотр избиение шаблон может оценить ли соединение производится аритмий.

Результаты

На рисунке 1 показана запись представителя Ca волн на базовом через одну плиту 384-хорошо. В большинстве случаев, все скважины показывают курс регулярных биений с маленькой изменчивости через пластину (означает ± SD = 40.1 ± 3.5 bpm; диапазон = 34-54 bpm). Очень редко (менее чем 1 из 10 экспериментов), несколько скважин (менее 5) имеют аритмии или отсутствие ритма. В трех 384-ну пластины, мы пробовали кардиомиоцитов от другого поставщика (см. Таблицу материалы) и получил очень похожи исходных значений для спонтанного избиение.

Блокаторы сердечной ионных каналов влияют на ритм кардиомиоцитов в воспроизводимый способом⁵. Амлодипин, блокатор медленных Ca каналы⁹, ускоряет ритм, более чем на 100% в зависимости от концентрации до 1 мкм (рисунок 2A). Эффект хорошо развита в течение первых 5 минут, но он по-прежнему увеличивается приблизительно 50% в течение следующих 30 минут прежде, чем она стабилизируется. Выше 1 мкм, Амлодипин аресты биений (пунктирные линии), как можно ожидать от факта что Ca Велоспорт имеет решающее значение для спонтанного схватки. Другие блокаторы кальциевых каналов Ca селективного dihydropyridine производят очень похожие эффекты.

E-4031, блокатор каналы быстрой задержки выпрямителя K¹⁰, замедляет ритм около 65–70% в зависимости от концентрации до 10 мкм (рис. 2B). Эффект развивается в течение первых 5 минут, и она не меняется в течение следующих 60 мин. Другие селективного блокаторы IKr производят аналогичные последствия, хотя максимальное снижение ставки может меняться (например, 35–40% для цизаприда, 70% для E-4031 и 90% - 95% для dofetilide). Основой для этого неравенства не известна.

Тетродотоксин, блокатор быстро Na каналы¹¹, замедляет ритм около 15% в зависимости от концентрации, до 1–30 мкм (рис. 2 c). Эффект хорошо развита в течение первых 5 минут, и она не меняется многое в течение следующих 60 мин. Однако выше 30 мкм, Тетродотоксин аресты избиение в течение первых 5 мин, тогда как после 30 мин, она арестовывает его выше 1 мкм. Другие блокаторы кальциевых каналов Na, например лидокаина или мексилетин, аналогичный эффект все или ничего.

Бепридил, блокатор смешанного сердечной Na, Ca и K каналы⁹, также производит эффект все или ничего (Рисунок 2D). Это свидетельствует о том, что в этом препарате, блок Na каналов является основным действием бепридил. Ускорение, вызванное Ca канал блок не видели, и более прогрессивный, замедляется вследствие IKr блока появляется масках Na канал эффекта.

Рисунок 1: представитель базовых Ca волн через 384-ну плита. (A) все скважины через пластину демонстрируют курс регулярных биений с маленькой изменчивости. Этот образ записывается непосредственно из программ чтения пластины. Каждый след-10 s в продолжительности. Интенсивность флуоресценции является произвольным (относительная свет единиц производные от серого видео камеры). (B) этой раздутии одной 10 s трассировки показывает низкий шум сигнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: представитель эффекты сердечных иона канал блокаторы. Эти панели показывают концентрация реакция кривых с (A) селективного Ca канала блокатор Амлодипин, (B) IKr Селективный блокатор E-4031, (C), Селективный блокатор канала Na TTX и (D) неселективной канал блокатор бепридил. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Два аспекта являются наиболее важными для успешной записи избиения частоты. Первый — проявлять осторожность с обшивкой клеток и культуры. В частности важно, чтобы попытаться избежать царапин слоя клеток в нижней части скважины при обмене среды. Это приемлемо для сенсорных в нижней части скважины с пипетки, но тот же угол должен использоваться каждый раз, тем самым производить только крошечные нуля в слой клетки и не влияет на производительность assay. Второй критический аспект получения воспроизводимых однородной ритмов является предоставление контроля температуры при 37 ° C на пластину клеток в течение измерения. Мы не могли получить эта однородность, использование устройств за исключением читателя пластины, используемые здесь, но это может быть возможным с специальные модификации для регулирования температуры: было бы сделать протокол, здесь представлены более широко использоваться за пределами единого бренда пластины читатель. Для достижения стабильности температуры в течение всего эксперимента с устройством, используемый здесь, было необходимо остановить каждую запись, прежде чем она закончилась; в противном случае робот будет извлечь измеренной пластину ячейки. Этот технический вопрос может исчезнуть в следующем выпуске программного обеспечения читателя пластины, но сейчас он остается критическим. Если плита клетки ошибочно передается вне читателя плита, он должен быть загружен обратно внутрь как можно быстрее. Тем не менее качество этого эксперимента будут ухудшаться, потому что изменения температуры влияют на скорость избиение чрезвычайно быстро.

Некоторые другие аспекты, которые не были тщательно протестированы, могут быть менее важными. Например hiPSC см производители рекомендуют покрытие культуры клеток пластины перед посевом клетки, но в этой конкретной assay, покрытие не используется, потому что клетки придерживаются довольно легко на различных поверхностях, и это очень трудно правильно пальто 384-Ну плиты. Тем не менее клеток плиты покрытия все еще может быть допустимой, или это может даже улучшить качество анализа. Мы также никогда не испытывал ли растворителей помимо ДМСО будет приемлемым, но из опыта с другими технологиями записи ожидается, что аналогичные концентрации EtOH или метанола также будет терпимой. Мы обычно используем hiPSC-CMs от того же производителя, и были протестированы клетки от только одного дополнительного поставщика, который, как представляется, работают аналогичным образом. Кроме того мы использовали лишь небольшое количество различных серий hiPSC-CMs, которые были выбраны путем prechecking их, чтобы убедиться, что они вели себя подобным образом в первоначальный пакет. Один или два пакетов были сочтены неуместными, потому что их syncytia бедных стабильность и воспроизводимость в условиях культуры используется здесь. В противном случае фармакологии появился очень похож по всей партии, при тестировании ограниченной группы «типичного» соединений (форсколин, N6-cyclopentyl аденозин и E-4031, а также эндотелина, isoproterenol, амлодипина и ponesimod). Мы только использовали hiPSC-CM, полученные от здоровых доноров. Это может быть целесообразным оценить ли hiPSC-CM, полученных от пациентов с заболеваниями сердца будет предоставлять различные результаты, хотя никакой разницы между здоровых доноров и пациентов наблюдалось при оценке кардиотоксичности ингибитора киназы тирозина ¹². и наконец, мы обычно ждать 22 – 28 дней в культуре до измерения наркотиков эффекты: в нашем опыте с записями сопротивления те же клетки, установившемся для медленно импеданс (показатель стабильности слоя клеток) и быстро импеданса (показатель избиение частоты) достигается после 12–15 дней в культуре. Однако мы решили ждать 22–, 28 дней, потому что это время, когда выражение профиль сердца каналов и маркеры созревания стабилизировалась¹³. Он не рассматривался ли сопоставимые результаты будут получены, если клетки использовались раньше или позже.

Протокол, в описанный здесь использует очень простой измерения скорости спонтанного избиение hiPSC см для оценки потенциального воздействия препарата на человека сердечной электрофизиологии. Его основные преимущества перед другими методологиями, что i) оно поддается среде высокопроизводительного скрининга, ii) он записывает деятельность кардиомиоцитов и эффекты препаратов при физиологических температурах, и iii) не требует Электрофизиологические опыт для выполнения или для оценки результатов.

В исследовании проверки выполняется с много лекарств, одобренных для использования человеком мы показали, что assay реагирует на лекарства, используемые в человеческой медицине как предсказано существующих клинических данных⁵. Так как этот метод учитывает все потенциальные последствия для сердечного ритма, он дополняет всеобъемлющий в пробирке Proarrhythmic проба (CiPA) инициативы¹⁴ , специально оценивает про аритмических потенциал.

В будущем этот метод может обеспечить дальнейшее понимание режима действия препаратов, показано, что влияет на уровень спонтанной избиение. Вполне вероятно, что дополнительные механистическая информация присутствует в флуоресценции записей Ca транзиентов (например, в их амплитуда или форму). Если флуоресценции записи выполняются на более высокие цены приобретения (например, 30 Гц), эти параметры легко извлекаются помимо избиение скорость, и это может быть интересно соотнести изменения этих параметров с известных последствий клинически употребляли наркотики.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
FDSS7000 fluorescent plate reader	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	not a catalog item
FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit	Hamamatsu Photonics (Massy, France)		installed initially in the device
FDSS7000 temperature control	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	A10118-09
FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	C11653-11
FDSS7000 pipet tips for 384-well plates	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	A8687-62
Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes	Hamamatsu Photonics (Massy, France)	U8524-12	optional alternative to the Igor Pro software
Igor Pro data analysis software	Wavemetrics (Portland, Oregon, USA)	Latest version
iCell-Cardiomyocytes Kit	Cellular Dynamics International (Madison, WI)	R1106	includes cells, plating and maintenance media
Cor.4U Cardiomyocyte Kit	Ncardia Germany (Cologne, Germany)	Ax-B-HC02-4M	includes cells, plating and maintenance media alternative to the iCell-Cardiomyocytes
384-well cell culture plates	Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)	781091
384-well compound plates	Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)	781280
FLIPR Calcium 4 Assay Kit	Molecular Devices (Sunnyvale, California)	R8142
Forskolin	Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland)	F6886
N6-cyclopentyl-adenosine	Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland)	C8031
E-4031	Enzo Life Sciences (Lausen, Switzerland)	BML-KC158
Penicillin-Streptomycin solution	Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland)	15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland)	15250061