信号経路活性ルシフェラーゼ ベースの大きい腫瘍のサプレッサー (ラッツ) バイオ センサーを用いたカバを監視

要約

大きな腫瘍サプレッサー (ラッツ) のキナーゼ活動を定量化するルシフェラーゼを用いたバイオ センサーの紹介-中央キナーゼ シグナル伝達経路カバで。このバイオ センサーには、カバ経路レギュレータの in vitroとin vivoの調査を目的とした基礎やトランスレーショナル研究の多様なアプリケーションがあります。

要約

シグナル伝達経路カバは臓器のサイズの節約されたレギュレータし、開発および癌の生物学で重要な役割を持っています。技術的な問題のため、このシグナル伝達経路のアクティビティを評価して、生物学的文脈の中で解釈することは困難残ります。大きな腫瘍サプレッサー (ラッツ) に関する既存の文献は、スクリーニングを質的、ことはできません簡単にするスケール アップ法に依存します。最近では、カバのキナーゼカスケードの背筋のコア コンポーネントのキナーゼ活動を監視する生物発光に基づくバイオ センサーを開発しました。ここでは、我々 はカバ経路レギュレータを特徴付けるためのこの背筋バイオ センサー (LATS BS) の使用方法について手順を説明します。まず、背筋 BS を使用して背筋活動発現タンパク質候補者 (例えばVEGFR2) の効果を調査するための詳しいプロトコルをいたします。その後、小規模なキナーゼ阻害剤スクリーンのための背筋 BS の使用方法を示す.このプロトコルはうまくカバ経路の新規規制当局が確認されます間違いなく大画面を実行するスケール アップをすることができます。

概要

カバはシグナリング経路最初ショウジョウバエの細胞の成長と動物サイズ^1,2の新規調節因子として同定されました。その最初の発見以来証拠説得力を示しているカバ経路が (例えば、初期胚、臓器サイズ制御、および三次元の [3-D] 形態)、開発に重要な役割を果たしていること腫瘍 (例えば腫瘍の開発、転移、血管新生、免疫回避、ゲノム不安定性、ストレス応答、および薬剤耐性)、および組織恒常性 (例えば、幹細胞の複製分化と損傷後の組織再生)^{3,4,5,6,7,8,9,10}. カバがシグナル伝達は頻繁に様々 な癌^{7,8,9,10、11,12}調節不全。したがって、がん生物学と治療と再生医療でカバ経路の機能を解明となっているホットな分野の生物医学研究における。

一言でいえば、カバ経路、上流のレギュレータ (例えば細胞間接触、養分ストレスは、細胞外マトリックス [ECM]) による活性化に MST1/2 (MST;ショウジョウバエカバの哺乳類ホモログ) セリン/スレオニンキナーゼ (S/T) 活性アダプター蛋白質 hMOB1 と WW45 をリン酸化/アクティブ化だけでなく、その後、転写コアクチベーター ヤップとその相同 (H、ヒスチジン; 保存 HX(H/R/K)XX(S/T) で TAZ をリン酸化するキナーゼを LATS1/2 (ラッツ)R、アルギニン。K, リジン;S、セリン;T, スレオニン;X の任意のアミノ酸) モチーフ、ヤップ S127 TAZ s89 デッドワカサギ^11,12を含みます。S127 リン酸化ヤップ (ヤップ-pS127) および s89 デッドワカサギ リン酸化 TAZ (タズ pS89) ユビキチン化によって低下または細胞質タンパク質 14-3-3 にバインドし、下流 transactivate 核 TEAD1 4 転写因子との相互作用を防ぐ細胞の増殖とアポトーシス (図 1) にかかわる遺伝子。カバ経路の途方もない興味、にもかかわらずカバの信号を測定するためのいくつかのツールが存在してヤップ、タズ、TEAD 転写出力の記者に歴史的に限られているか。確かに、ごく最近までなかった定量的、リアルタイム、高スループット、および非侵襲的な方法でコンポーネントをシグナリング カバの状況やダイナミクスを測定するためのツールの in vitroとin vivoの両方。

私たち新興の生理学および病理学のタンパク質間相互作用の役割の理解を与え、定量的かつリアルタイム^{13、これらの相互作用を研究するためのツールの開発に大きな関心があります。 14,,1516}。確かに、進展があった重要な酵母 2 ハイブリッド (Y2H)¹⁷、表面プラズモン共鳴 (SPR)¹⁸、蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)¹⁹試金などのバイオ分析戦略の開発蛋白質蛋白質の相互作用を評価します。ただし、その多くの構造は、効率的な 1 つを見つけるテストする必要が、これらのアプローチはレポーター向きの大幅な最適化を必要とする制限を運ぶ。さらに、これらのアプローチもある比較的低い信号対雑音比など真の肯定的な信号を付けに挑戦することができます。

蛋白質否定回路試金は、これらの制限を克服するために開発されました。蛋白質否定回路試金の第一世代は、分割多色蛍光蛋白質に基づいていたし、前述の制限²⁰を解決できなかった。多色蛍光タンパク質は、難しく低親和性とバック グラウンド ノイズ²¹2 つの別々 の安定したフラグメントに分割する 1 つのドメインで構成されます。その後、ホタルのルシフェラーゼはスプリット蛋白質否定回路試金を開発するための新しい候補者として識別されました。このアプローチでは、ホタルのルシフェラーゼは興味のターゲット蛋白質に溶ける各フラグメントと共に 2 つのフラグメント ([NLuc と CLuc] の N 末端と C 末端のルシフェラーゼ) に分割されます。NLuc と CLuc は、2 つのターゲット蛋白質の相互作用の時に近くに持って来られる、ルシフェラーゼ活性を再構成し、ルシフェリン基板と ATP²²存在下で発光光を生成します。2001 年を実行して様々 なサイトで NLuc と CLuc フラグメントを含むライブラリを使用して組合せスクリーニングをカット、異なるリンカー蛋白質に付け、Paulmurugan、スタンフォード大学の Gambhir が開発した最適化された分割-ホタル蛋白質蛋白質の相互作用²³のルシフェラーゼ フラグメント支援補完システム。このシステムは、ホタルのルシフェラーゼはアミノ酸 (aa) 398 NLuc と CLuc、8 つのグリシン残基の適用範囲が広いリンカーを使用して興味の 2 つの蛋白質に付すを形成する、2 つのセリン残基でカットされます。

我々 は、15 NLuc を融合させることで新しいラッツ BS を最近開発同様のアプローチを使用して、S127 で背筋のリン酸化サイトを取り巻くヤップの aa (YAP15)、14-3-3 で CLuc。他の上流の規制当局がヤップ (例えば、他のサイトでユビキチン化リン酸化) の翻訳後修飾によるシグナルを交絡を避けるためには、実物大のヤップ蛋白質が使用できません。ここで紹介背筋 BS は、両方の細胞の体外および体内マウス^20,24 (図 2) で非侵襲的信号活性カバを監視できます。ここでは、ラッツ キナーゼ活動の in vitroラッツ BS を使用して測定のための詳しいプロトコルについて述べる。まず、背筋活性発現タンパク質の効果を調べるための背筋 BS の使用方法を示します。その後、バイオ センサーを使用して、カバの経路を調整するエージェントと治療後カバ経路の活動を監視する方法を示す.このプロトコルは、識別し、シグナル伝達経路やラッツ キナーゼ活動を規制する刺激を分類する使用ことができます。

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プロトコル

1。 カバはラッツ BS を使用して信号の推定レギュレータの調査

1. めっきと細胞のトランスフェクション
   1. 細胞培養の準備
      1. 1x PBS、10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンと約 30 分間水浴の 37 ° C に 0.25% トリプシン-EDTA を含む DMEM を温めます。
      2. 70% のエタノールの安全キャビネットを徹底的に掃除します。
      3. 必要に応じて、ティッシュ文化フードにティッシュの培養皿、パスツール ピペット、血清ピペット、ピペット チップを配置します。
      4. PBS、メディア、および水の風呂からトリプシン-EDTA x 1 を取り出し、70% エタノール、それらをきれいに、フードにそれらを置きます。
   2. メンテナンスとセルの transfection のためのめっき
      1. 実験のため (例えばHEK293) 高いトランスフェクション効率のセルの行を選択します。ウエスタンブロット カバ信号がアクティブかどうかを確認するこの細胞におけるカバ経路コンポーネントの式を確認します。
      2. 37 ° C、5% CO₂でインキュベーターで 10 cm シャーレに DMEM HEK293 細胞を成長します。顕微鏡下で細胞を毎日監視します。80-90% の confluency を観察すると下記のようにセルを通過します。
      3. プレートに 5 mL の 1x PBS を追加し、プレートを軽く旋回、メディアを完全に吸引洗浄を行う。
      4. プレートに 1 mL のトリプシン-EDTA を追加します。トリプシンがセルを均等にカバーするようにプレートを旋回します。
      5. 5 分またはすべてのセルを取り外すまでの CO₂インキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。
      6. トリプシンを中和する、上下に数回ピペッティングにより細胞を再懸濁します (10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン) とメディアの 4 つの mL を追加し、(1:10 の合格率) のための新しい 100 mm プレートに細胞の 10 分の 1 (0.5 mL) を調剤の 9.5 mL を含む完全なメディア。
      7. ラッツ BS transfection のためトランスフェクション前に 24 h 12 ウェル プレートの各ウェルに検定とプレート 2 x 10 の⁵セルを使用してセルをカウントします。
         注: 高いセル番号を使用してカバ シグナリング活性は細胞密度によって調整としてバック グラウンド発光信号を高める可能性があります。トランスフェクション試薬への細胞の感度を増加し、増加細胞死²⁴下のセル番号を使用しています。
   3. ラッツ BS単独で、または一緒に候補遺伝子のトランスフェクション
      1. Miniprep ラッツ BS プラスミド (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-温および 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) 新鮮な DH5a 細菌の液体培養 (LATS BS 式最適を達成するために必要)。
      2. トランスフェクション効率を促進する前に 1 h 板から培地を吸引、12 ウェル プレートの各ウェルに完全な成長媒体の 500 μ L を追加、インキュベーターにセルを返します。
         注: 次のプロトコルは、市販のポリマー ベースのトランスフェクション試薬を用いた遺伝子導入方法を説明します。他のトランスフェクション試薬は、適したトランスフェクション; もあります。しかし、まだ未テストです彼ら。
      3. A と Bの表 1で説明するようにソリューションを作る。N transfections ください (N + 0.5) プレミックス液と B x。
      4. すぐに DNA (溶液) に希薄ポリマー ベースのトランスフェクション試薬 (ソリューション B) を追加します。ミックスに軽く上下ピペットします。
      5. サンプル フォームにトランスフェクション錯体を許可するように 15 分間室温で孵化させなさい。
      6. 穏やかな旋回 12 ウェル プレートの各ウェルに滴下トランスフェクション錯体の総量 (76 μ L) を追加します。
      7. 細胞をインキュベート一晩 (18-24 h) 37 ° C で
         注: ポリマー ベースのトランスフェクション試薬に敏感な細胞の 5 h にインキュベーション時間を短縮することができます。
      8. トランスフェクション後、日トランスフェクション複合体を含むメディアを取り出し新鮮な完全なメディアに置き換えます。ルシフェラーゼ アッセイを実行する別の日の 37 ° C で培養します。
2. ルシフェラーゼ アッセイ
   メモ: 1 つのアッセイでホタルとRenillaを一緒に検出ルシフェラーゼ レポーター アッセイ システム ルシフェラーゼ アッセイに使用されます。Renillaは内部統制として使用していない場合、ワンステップ ルシフェラーゼ アッセイを実行するには、 Renilla検出試薬を追加することがなく LARII を追加します。
   1. セル lysates の準備
      1. 5 x パッシブ換散バッファー (PLB) 蒸留水をとおり希薄化します。
      2. 1 の容量 x PLB 必要 = x (PLB x 5 の 50 μ L) + dH2O の 200 μ L N = 1 N x 250 μ 12 ウェルのウェルあたり x PLB (N = サンプル数)。
      3. メディアを完全に吸引します。各ウェルに 1 mL の 1x PBS を追加します。戸建削除セルと残留成長媒体に優しくプレートを旋回します。1 × PBS を完全に吸引します。確認の 1 添加前に PBS のまま x 残留 1 x PLB。
      4. 1 の 250 μ L を追加 PLB/ウェル x。
      5. 1 でセル単一層の完全かつもカバレッジを確保する穏やかなロッキング ロッキング プラットフォーム上培養皿を置く x PLB。溶解セルように 15 分間室温で培養皿を揺する。
      6. 1.5 mL 遠心チューブに液を転送します。
   2. 発光信号の測定
      1. LARII を取る (20 μ L/サンプル) から-80 ° C と室温に釣り合います。
      2. N の試金のためのRenilla検出試薬の準備: (N +1) を追加 50 0.4 μ x そのバッファーの 19.6 μ L × (1 + N) 基板 x。
      3. 各セルを 1.5 mL チューブに溶解液の 10 μ L を predispense します。
      4. 各デュアル ルシフェラーゼ アッセイ用 10 の測定期間続いて 2 s premeasurement 遅延を実行するルミノをプログラムします。
         注: 最初と 2 番目の測定がそれぞれに対応して、背筋 BS 信号とRenilla内部統制。シングルまたはデュアルのルシフェラーゼと互換性のある任意のルミノを使用ことができます。
      5. 慎重に 1 つの管に LARII 試薬の 20 μ L を転送し、すぐにそれをミックスする 3 x 上下ピペットします。
      6. すぐに、ルミノに管を配置し、読書を開始します。
      7. ルミノからサンプル チューブを削除、すぐにRenilla試薬の 20 μ L を追加し、3 倍上下ピペッティングで混ぜます。ルミノのサンプルを持参し、次の読み取りを開始します。測定値を記録します。
      8. 反応管を破棄し、次のサンプルに進みます。

2. 識別カバ経路レギュレータ使用して、画面の背筋 BS

1. 細胞培養と transfections
   1. セクション 1.1 で説明した HEK293AD 細胞を培養。
      注: HEK293AD は他 HEK293 細胞株よりもより付着性画面で使用するため良い細胞ラインになります。
   2. 1.1.2 のセクションで説明するように細胞をデタッチします。数えるし、100 mm プレート トランスフェクション前に 24 h の 2 × 10⁶セルのプレートします。
   3. トランスフェクション効率を促進する前に 1 h プレートからメディアを吸引し、新鮮な完全な成長媒体の 5 mL と置き換えます。
   4. A と Bの表 2で説明したソリューションを作る。
   5. すぐに DNA (溶液) に希薄ポリマー ベースのトランスフェクション試薬 (ソリューション B) を追加します。上下のピペットをミックスします。
   6. サンプル フォームにトランスフェクション錯体を許可するように 15 分間室温で孵化させなさい。
      1. 穏やかな旋回と細胞に滴下トランスフェクション錯体の容量 (500 μ L) を追加します。
      2. 37 ° C で一晩細胞をインキュベートします。
      3. 次の日は trypsinize し、セルをカウントします。1 x 10⁴ 2 x 10 の⁴セルを 100 μ L/ウェル メディアのボリューム サイズは合計で 96 ウェル プレートの各ウェルにプレートします。別の日に孵化させなさい。
   7. 次の日も、ルシフェラーゼ アッセイを実行する前に 1-4 h 10 μ M の最終的な集中でカバの経路を調整するエージェント/小分子を追加します。
      注: ほとんどの小さな分子/エージェント、10 μ M で 4 h 治療しても細胞生存率は影響しません。低濃度を使用すると、治療は時間の長い期間の拡張可能性があります。
2. ルシフェラーゼ アッセイ
   1. ルシフェラーゼ アッセイ体外
      1. 細胞からメディアを完全に吸引します。1x PBS 各ウェルに 100 μ L のセルを洗浄します。完全に吸引します。
      2. 1 の 20 μ L を追加 96 ウェル プレートの各ウェルに x PLB (に記載されているステップ 1.2.1.1 として準備)。
      3. ロッキング プラットフォーム上で 15 分間室温で穏やかな揺動培養皿を配置します。
      4. 慎重に LARII 試薬の 20 μ L を各ウェルに転送、ピペットのミックスに 3 倍上下。
      5. すぐに板読むルミノのプレートを置き、読書を開始します。
   2. 生きているセル ルシフェラーゼ アッセイ
      1. D-ルシフェリン株式 x 11 を次のようにする: 通常培地 1 mL 中の D-ルシフェリン粉 1.5 mg を溶解します。
      2. それぞれに D-ルシフェリン井戸し、井戸の中にあるメディア優しく混ぜる 11 x 10 μ L を転送します。
      3. 10 分のためのインキュベーターにセルを交換してください。
      4. ルミノのプレートを置き、読書を開始します。
         注: 信号強度は D-ルシフェリンのこの濃度は十分に強くない、D-ルシフェリン株式の 10 μ L 別がセルに追加可能性があります。

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結果

ラッツ BS は背筋活動 (図 3) に及ぼす影響を評価するための異なる遺伝子を持つ cotransfected だった。この実験では、 Renillaは内部統制として使用されました。ヤップ 5SA の一過性の発現、ヤップの構成アクティブ フォーム設立されたフィードバック経路²⁵ラッツ キナーゼ活性のヤップ転写ターゲットとその後の増加のレベ?...

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ディスカッション

カバ経路は様々 な生物学的プロセスに重要な役割を果たしているが、カバ経路の制御不全癌⁶につながる、様々 な刺激への応答でカバの経路を調整する方法は完全にわかりません。また、カバのコア コンポーネントのアクティビティを評価する定量的およびリアルタイム システムはないずっと。最近、我々 は開発およびカバ経路²⁴ラッツ キナーゼ活性を?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin-EDTA	Life Technologies	2520056	0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F1051
DMEM	Sigma	D6429-500ml	DMEM with high glucose
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent	Signagen	SL100688.5
5x Passive lysis buffer	Promega	E194A	30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System	Promega	E2940	100 ml kit
20/20 luminometer	Turner Biosystems	998-2036	Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors	Promega	GM2010	96-well plates reader luminometer