Monitoramento de hipopótamo, sinalizando o Pathway atividade usando um Tumor grande baseado em Luciferase supressor (LATS) Biosensor

Resumo

Aqui nós apresentamos um biossensor baseado em luciferase para quantificar a atividade da quinase do supressor do tumor grande (LATS)-uma quinase central no Hippo via de sinalização. Este biosensor tem diversas aplicações na pesquisa básica e translacional, visa investigar hipopótamo via reguladores in vitro e em vivo.

Resumo

O hipopótamo via de sinalização é um regulador conservado do tamanho do órgão e tem papéis importantes na biologia do desenvolvimento e câncer. Devido a desafios técnicos, continua a ser difícil avaliar a atividade desta via de sinalização e interpretá-lo dentro de um contexto biológico. A literatura existente sobre o supressor de tumor grande (LATS) se baseia em métodos qualitativos e não podem facilmente ser escalado-acima para a seleção. Recentemente, temos desenvolvido um biossensor baseado em bioluminescência para monitorar a atividade da quinase do LATS-a principal componente da cascata da quinase hipopótamo. Aqui, descrevemos procedimentos de como este biosensor LATS (LATS-BS) pode ser usado para caracterizar reguladores de caminho de hipopótamo. Primeiro, nós fornecemos um protocolo detalhado para investigar o efeito de um candidato de proteína Blumental (por exemplo, VEGFR2) na atividade LATS usando o LATS-BS. Em seguida, mostramos como o LATS-BS pode ser usado para uma tela de inibidor de quinase em pequena escala. Este protocolo viável pode ser dimensionado-up para executar telas maiores, o que sem dúvida irão identificar novos reguladores da via de hipopótamo.

Introdução

O hipopótamo sinalização via foi identificada em Drosophila como um romance regulador do crescimento celular e animal tamanho^1,2. Desde a sua descoberta inicial, evidências convincentemente demonstrou que que o percurso de hipopótamo tem um papel crítico no desenvolvimento (por exemplo, desenvolvimento embrionário precoce, controle de tamanho de órgão e tridimensional [3D] morfologia), (tumorigênese por exemplo, desenvolvimento de tumor, metástase, angiogênese, evasão imune, instabilidade genômica, resposta ao estresse e resistência às drogas) e a homeostase do tecido (por exemplo, renovação de células-tronco e diferenciação e regeneração de tecidos após lesão) ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. a sinalização de hipopótamo é frequentemente prejudicado em vários cânceres^{7,8,9,10,11,12}. Por conseguinte, elucidar as funções da via hipopótamo na biologia do câncer e terapêutica e medicina regenerativa tornou-se uma das áreas mais quentes na investigação biomédica.

Em breve, na via de hipopótamo, após a activação pelos reguladores montante (por exemplo, contato célula-célula, stress nutriente e matriz extracelular [ECM]), quinase serina/treonina (S/T) de MST1/2 (MST; mamíferos homologs da drosófila Hippo) fosforilar/ativar adaptador proteínas hMOB1 e WW45, bem como as cinases de LATS1/2 (LATS) que, posteriormente, fosforilar ativador transcricional de co YAP e sua paralog TAZ em HX(H/R/K)XX(S/T) conservada (H, histidina; R, arginina; K, lisina; S, serina; T, treonina; X, qualquer aminoácidos) motivos, incluindo YAP-S127 e TAZ-S89^11,12. YAP S127-fosforilada (YAP-pS127) e TAZ S89-fosforilada (TAZ-pS89) são degradados por ubiquitination ou ligam a proteína citoplasmática 14-3-3 e são impedidos de interagindo com fatores de transcrição TEAD1-4 no núcleo para transativar a jusante genes envolvidos na proliferação celular e apoptose (Figura 1). Apesar do enorme interesse na via de hipopótamo, existem poucas ferramentas para medir a sinalização de hipopótamo e aqueles que têm sido historicamente limitada aos repórteres de saída transcriptional YAP/TAZ/TEAD. Com efeito, até muito recentemente, não havia sem ferramentas para medir a dinâmica e a atividade do hipopótamo sinalização componentes de forma quantitativa, em tempo real, alta produtividade e não-invasiva tanto in vitro e in vivo.

Dada nossa compreensão do papel das interações da proteína-proteína em fisiologia e patologia de emergentes, há grande interesse no desenvolvimento de ferramentas que pode ser usado para estudar essas interações em uma forma quantitativa e em tempo real^{13, 14,15,16}. Na verdade, tem havido um progresso significativo no desenvolvimento de estratégias de bio-analítica, incluindo do dois-híbrido de levedura (Y2H)¹⁷, a superfície plasmon ressonância (SPR)¹⁸e ensaios de¹⁹ do (FRET) de transferência de energia de ressonância Förster, para avaliar as interações da proteína-proteína. No entanto, essas abordagens carregam a limitação de que exigem otimização significativa da orientação do repórter, tal que muitas construções devem ser testadas para encontrar um eficiente. Além disso, essas abordagens também tem uma relativamente baixa relação sinal-ruído, tal que discernir uma sinalização positiva verdade pode ser um desafio.

Ensaios de complementação da proteína foram desenvolvidos para superar essas limitações. A primeira geração dos ensaios de complementação da proteína foi baseada em proteínas de fluorescência multicolor de divisão e não podia resolver as limitações acima referidas²⁰. Proteínas de fluorescência multicolor consistem em apenas um domínio, tornando-se difícil separá-los em dois fragmentos separados de estáveis com baixa afinidade e ruído de fundo²¹. Posteriormente, luciferase de vaga-lume foi identificado como um novo candidato para uso no desenvolvimento de ensaios de complementação do separação da proteína. Nesta abordagem, luciferase de vaga-lume é dividido em dois fragmentos (N-terminal e C-terminal do luciferase [NLuc e CLuc]) com cada fragmento fundida a uma proteína do alvo de interesse. Se o NLuc e CLuc são trazidos para a proximidade com a interação das proteínas dois alvo, atividade do luciferase é reconstituída e luz bioluminescente é gerado na presença de substrato luciferina e ATP²². Em 2001, através da realização de uma análise combinatória usando uma biblioteca que contém fragmentos de NLuc e CLuc cortada em vários sites e ligado a proteínas com diferentes linkers, Paulmurugan e Glauber na Universidade de Stanford desenvolveram um otimizado split-vagalume sistema de complementação assistida por fragmento do luciferase de interações proteína-proteína²³. Neste sistema, luciferase de vaga-lume é cortada em aminoácidos (aa) 398 para formar NLuc e CLuc, que estão ligados a duas proteínas de interesse usando um vinculador flexível de oito resíduos de glicina e dois resíduos de serina.

Usando uma abordagem similar, desenvolvemos recentemente um novo LATS-BS fundindo NLuc para 15 aa de YAP em torno do site de fosforilação LATS em S127 (YAP15) e CLuc com 14-3-3. A proteína de YAP completo não foi usada, para evitar confundir sinais por modificações borne-translational de YAP (por exemplo, a fosforilação em outros sites e ubiquitination) por outros reguladores upstream. O LATS-BS aqui apresentados não invasiva pode monitorar hipopótamo sinalização atividade tanto in vitro em células vivas e em vivo em ratos^20,24 (Figura 2). Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para medir LATS quinase atividade no vitro usando o LATS-BS. Primeiro, mostramos como o LATS-BS pode ser usado para investigar o efeito de uma proteína Blumental na atividade LATS. Em seguida, mostramos como o biosensor pode ser usado para monitorar a atividade da via hipopótamo após tratamento com agentes regulando o percurso de hipopótamo. Este protocolo pode ser usado para identificar e caracterizar a sinalização de percursos ou estímulos que regulam a atividade da quinase LATS.

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Protocolo

1. a investigação de um regulador putativo de hipopótamo sinalização usando o LATS-BS

1. Chapeamento e transfecção de células
   1. Preparação de cultura celular
      1. Aquecer 1X PBS, DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina e 0,25% do trypsin-EDTA a 37 ° C em banho-maria por aproximadamente 30 min.
      2. Limpe cuidadosamente um gabinete de segurança biológica com etanol a 70%.
      3. Coloque pratos de cultura de tecidos, pipetas Pasteur, pipetas e pontas de pipetas ao subúrbio de cultura de tecidos, conforme necessário.
      4. Tiro de 1X PBS, a mídia e do trypsin-EDTA do banho, limpe-os com etanol a 70% e colocá-los na capa.
   2. Manutenção e chapeamento das células para transfeccao
      1. Escolha uma linhagem de células com uma eficiência de transfeccao alta (por exemplo, HEK293) para o experimento. Verificar a expressão de componentes de caminho hipopótamo nesta linha de celular pelo borrão ocidental para certificar-se de sinalização hipopótamo está ativo.
      2. Desenvolvem-se células HEK293 em DMEM em placas de Petri de 10 cm em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂. Monitore as células sob um microscópio todos os dias. Passagem das células conforme descrito abaixo, quando é observada a confluência de 80-90%.
      3. Lave as células pela adição de 5 mL de 1X PBS em um prato, agitando suavemente a placa e aspirando a mídia completamente.
      4. Adicione 1 mL de tripsina-EDTA para a placa. Agite a placa para garantir que a tripsina cobre uniformemente as células.
      5. Incube as células a 37 ° C numa incubadora de CO₂ por 5 min ou até que todas as células são desanexadas.
      6. Adicionar 4 mL de mídia (com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina) para neutralizar a tripsina, Ressuspender as células pipetando acima e para baixo várias vezes e dispense um décimo (0,5 mL) das células em novas chapas de 100 milímetros (para uma relação passageira 01:10) contendo 9,5 mL de mídia completa.
      7. Para transfeccao LATS-BS , conte as células usando um hemocytometer e placa de 2 x 10⁵ células em cada poço de uma placa de 12 24 h antes do transfection.
         Nota: Usar o maior número de células pode aumentar o sinal de fundo bioluminescentes como hipopótamo sinalização atividade é regulada pela confluência de célula. Usar o menor número de células pode aumentar a sensibilidade da célula para reagentes de transfecção e aumentar de morte celular²⁴.
   3. Transfecção de LATS-BS sozinho ou junto com o gene candidato
      1. Miniprep LATS-BS plasmídeos (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-higrômetro e 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) fresca de DH5a cultura líquida de bactérias (necessário para alcançar uma melhor expressão LATS-BS).
      2. 1 h antes do transfection, Aspire o meio do prato, adicione 500 µ l do meio de cultura completo a cada poço das placas 12-poços e retornar as células para a incubadora.
         Nota: O seguinte protocolo descreve métodos de transfeccao usando um reagente de transfeccao baseados em polímeros comercialmente disponível. Outros reagentes de transfecção também podem ser adequados para transfeccao; no entanto, nós ainda não testei eles.
      3. Fazer soluções A e B, conforme descrito na tabela 1. Para transfections N, fazer (N + 0,5) x pré-mistura de solução B.
      4. Imediatamente adicione o reagente de transfeccao baseado em polímero diluído (solução B) DNA (solução A). Pipete acima e para baixo suavemente para misturar.
      5. Incube a amostra em temperatura ambiente por 15 min permitir que os complexos de Transfeccao para formulário.
      6. Adicione o volume total (76 µ l) de complexos de transfeccao gota a gota a cada poço da placa 12-poços com agitação suave.
      7. Incubar as células durante a noite (18-24 h) a 37 ° C.
         Nota: Para as células que são sensíveis aos reagentes de transfecção baseado em polímero, o tempo de incubação pode ser reduzido a 5 h.
      8. O dia depois de transfeccao, remova a mídia do transfection-complexo-contendo e substituí-lo com mídia completa fresca. Cultura das células a 37 ° C por mais um dia realizar o ensaio de luciferase.
2. Ensaio do luciferase
   Nota: O sistema de ensaio de repórter Luciferase detectando firefly e Renilla juntos em um ensaio é usado para os ensaios de luciferase. Se Renilla não foi usado como um controle interno, realizar ensaio de uma etapa do luciferase adicionando LARII sem adicionar o reagente de detecção Renilla .
   1. Preparação dos lisados celulares
      1. Dilua 5 x passiva do lysis (PLB) com água destilada, como segue:
      2. Volume total de 1 x PLB necessário = N x (50 μL de 5 x PLB) + 200 μL de dH2O = μL N x 250 de 1 x PLB por alvéolo das placas 12-poços (N = número de amostras).
      3. Aspire a mídia completamente. Adicione 1 mL de 1X PBS em cada poço. A placa suavemente para remover desanexado células e mídia de crescimento residual do redemoinho. A PBS 1x Aspire completamente. Não certifique-se de nenhum residual 1X PBS restos antes da adição de 1 x PLB.
      4. Adicionar 250 μL de 1 x PLB/bem.
      5. Colocar as placas de cultura em uma plataforma de balanço com rock suave para assegurar uma cobertura completa e até mesmo da monocamada de células com 1 x PLB. As placas de cultura à temperatura ambiente por 15 min permitir que as células para lyse é demais.
      6. Transfira o lisado para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
   2. Medindo o sinal bioluminescente
      1. Tirar a LARII (20 μL/amostra) de-80 ° C e -equilibrar a temperatura ambiente.
      2. Preparar o reagente de detecção de Renilla para ensaios N: Adicionar (N + 1) x 0,4 μL de 50 x substrato para (N + 1) x 19,6 μL de seu Buffer.
      3. Predispense 10 μL de cada célula lisada para tubos de 1,5 mL.
      4. Programe um luminómetro para executar um atraso de premeasurement 2-s, seguido de um período de medição 10-s para cada ensaio dual luciferase.
         Nota: As medições de primeiras e segunda vão ser correspondente ao sinal o LATS-BS e o sinal de controle interno de Renilla , respectivamente. Pode ser usado qualquer luminómetro compatível com um único ou duplo do luciferase.
      5. Transferir com cuidado 20 µ l de reagente LARII para um tubo e pipetar rapidamente e descer 3 x misturá-la.
      6. Coloque o tubo no luminómetro imediatamente e iniciar a leitura.
      7. Retirar o tubo de amostra do luminómetro, imediatamente adicionar 20 µ l de reagente Renilla e misture por pipetagem e descer 3 x. Levar a amostra no luminómetro e iniciar a próxima leitura. Grave as medições.
      8. Descartar o tubo de reação e prossiga para a próxima amostra.

2. uma tela para identificar hipopótamo Pathway reguladores usando o LATS-BS

1. Cultura celular e transfections
   1. Células de cultura HEK293AD conforme descrito na seção 1.1.
      Nota: É mais aderente do que outras linhas de células HEK293, HEK293AD que o torna uma linha de celular bom para uso em telas.
   2. Separe células conforme descrito na seção 1.1.2. A contagem e placa de 2 x 10⁶ células em placas de 100 mm 24 h antes do transfection.
   3. 1 h antes do transfection, aspirar a mídia da placa e substituí-los com 5 mL de meio fresco crescimento completo.
   4. Fazer soluções A e B, conforme descrito na tabela 2.
   5. Imediatamente adicione o reagente de transfeccao baseado em polímero diluído (solução B) DNA (solução A). Pipete para cima e para baixo para misturar.
   6. Incube a amostra em temperatura ambiente por 15 min permitir que os complexos de Transfeccao para formulário.
      1. Adicione o volume total (500 µ l) de complexos de transfeccao gota a gota para células com agitação suave.
      2. Incubar as células durante a noite a 37 ° C.
      3. No dia seguinte, trypsinize e contar as células. Placa 1 x 10⁴ a 2 x 10⁴ pilhas em cada poço de uma placa de 96 poços em um volume total de 100 µ l de mídia por bem. Incube durante mais um dia.
   7. No dia seguinte, adicione moléculas de agentes/pequeno regulando o percurso de hipopótamo em uma concentração final de 10 µM para cada poço, 1 – 4 h antes de executar o ensaio de luciferase.
      Nota: Para a maioria das pequenos moléculas/agentes, um tratamento de 4 h a 10 µM não afeta viabilidade celular. Se for usada uma concentração mais baixa, o tratamento pode ser prorrogado por um longo período de tempo.
2. Ensaio do luciferase
   1. Em vitro ensaio luciferase
      1. Os meios de comunicação das células Aspire completamente. Lave as células com 100 µ l de 1X PBS em cada poço. Aspire completamente.
      2. Adicionar 20 µ l de 1 x PLB (preparado como descrito no passo 1.2.1.1) em cada poço das placas de 96 poços.
      3. Coloca as placas de cultura em uma plataforma de balanço com balanço suave na temperatura ambiente por 15 min.
      4. Com cuidado transferir 20 µ l de reagente LARII em cada poço e pipetar e descer 3 x para misturar.
      5. Imediatamente, coloque a placa em um placa-leitura luminómetro e iniciar a leitura.
   2. Ensaio de luciferase de células vivas
      1. Fazer 11 x estoque D-luciferina como segue: dissolver 1,5 mg de pó de D-luciferina em 1 mL de meio de cultura normal.
      2. Transferência de 10 µ l de 11 x D-luciferina em cada bem e misture suavemente com a mídia que já está no poço.
      3. Substitua as células em incubadora para 10 min.
      4. Colocar a placa no luminómetro e iniciar a leitura.
         Nota: Se a intensidade do sinal não é forte o suficiente para esta concentração de D-luciferina, outro 10 µ l do estoque de luciferina-D podem ser adicionadas às células.

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Resultados

O LATS-BS foi cotransfected com genes diferentes para avaliar seu efeito sobre a atividade de LATS (Figura 3). Neste experimento, Renilla foi usado como um controle interno. A expressão transiente de YAP-5SA, uma forma ativa constitutiva de YAP, causas de aumento dos níveis de YAP alvos transcricionais e um subsequente aumento na atividade da quinase LATS através de um percurso de gabarito estabelecido²⁵. MST, o ativador do...

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Discussão

Enquanto via o hipopótamo tem um papel crítico em diversos processos biológicos, e desregulação da via hipopótamo leva ao câncer⁶, como o caminho de hipopótamo é regulamentado em resposta a vários estímulos não é completamente compreendido. Além disso, não houve nenhum sistema em tempo real e quantitativo para avaliar a atividade dos componentes principais do hipopótamo. Recentemente, temos desenvolvido e validado um romance biosensor para medir a atividade da quinase LATS no hipop...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin-EDTA	Life Technologies	2520056	0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F1051
DMEM	Sigma	D6429-500ml	DMEM with high glucose
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent	Signagen	SL100688.5
5x Passive lysis buffer	Promega	E194A	30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System	Promega	E2940	100 ml kit
20/20 luminometer	Turner Biosystems	998-2036	Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors	Promega	GM2010	96-well plates reader luminometer