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  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine Luciferase-basierten Biosensor zur Quantifizierung der Kinase-Aktivität von großen Tumorsuppressor (LATS)-einer zentralen Kinase in den Signalweg Hippo. Diese Biosensor hat vielfältige Anwendungen in Grundlagen- und Translationale Forschung zur Hippo Weg Regulierungsbehörden in Vitro und in Vivozu untersuchen.

Zusammenfassung

Das Nilpferd Signalweg ist eine konservierte Regulator der Orgel Größe und hat eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Krebs Biologie. Aufgrund der technischen Herausforderungen bleibt es schwierig zu beurteilen, die Aktivität dieser Signalweg und in einem biologischen Kontext zu interpretieren. Die vorhandene Literatur zu großen Tumorsuppressor (LATS) stützt sich auf Methoden, die qualitative und können nicht leicht werden skaliert-Up für das Screening. Vor kurzem, entwickelten wir eine Biolumineszenz-basierten Biosensor um die Kinase-Aktivität des LATS-ein zentraler Bestandteil der Hippo-Kinase-Kaskade zu überwachen. Hier beschreiben wir Verfahren für die Verwendung von diesem Biosensor LATS (LVL-BS) Hippo Weg Regulierungsbehörden zu charakterisieren. Erstens bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung der Wirkung eines Protein überexprimieren Kandidaten (z.B.VEGFR2) auf LATS-Aktivität unter Verwendung der LATS-BS. Dann zeigen wir, wie die LATS-BS für einen kleine Kinase-Inhibitor-Bildschirm verwendet werden kann. Dieses Protokoll kann durchaus realistisch skaliert bis zu größere Bildschirmen, durchführen, die zweifellos neuartige Regulatoren des Hippo-Signalwegs identifiziert werden.

Einleitung

Das Nilpferd Signaltechnik Weg zuerst in Drosophila als ein neuartiger Regulator von Zellwachstum und Tiergröße1,2identifiziert wurde. Seit seiner ersten Entdeckung Montage Beweise hat überzeugend nachgewiesen, dass die Hippo-Weg entscheidende Rolle spielt bei der Entwicklung (z.B.frühe embryonale Entwicklung, Orgel Größe Kontrolle und dreidimensionale [3D] Morphologie), Tumorgenese () z.B., Tumorentstehung, Metastasen, Angiogenese, immun ausweichen, genomische Instabilität, Stressantwort und Resistenzen), und Gewebe Homöostase (z.B., Stammzellen Erneuerung und Differenzierung und Geweberegeneration nach Verletzung) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Hippo-Signalisierung ist häufig Dysregulated in verschiedenen Krebsarten7,8,9,10,11,12. Daher ist eines der heißesten Gebiete verdeutlichend Funktionen des Hippo-Signalwegs in Krebsbiologie und Therapeutika und regenerative Medizin in der biomedizinischen Forschung geworden.

In Kürze in der Hippo-Pfad, bei Aktivierung durch vorgelagerte Regler (z.B., Zell-Zell-Kontakt, Nährstoff Stress und extrazelluläre Matrix [ECM]), MST1/2 (MST, Säugetier-Homologe von Drosophila Hippo) (S/T)-Serin/Threonin-Kinasen phosphorylieren/aktivieren Adapter Proteine hMOB1 und WW45, sowie LATS1/2 (LATS) Kinasen, die anschließend transkriptionelle Coaktivator YAP und seine Paralog TAZ an konservierten HX(H/R/K)XX(S/T) (H, Histidin phosphorylieren; R, Arginin; K, Lysin; S, Serin; T, Threonin; X, alle Aminosäuren) Motive, darunter YAP-S127 und TAZ-S8911,12. S127 phosphoryliert YAP (YAP-pS127) und S89 phosphoryliert TAZ (TAZ-pS89) sind durch Ubiquitination abgebaut oder binden an zytoplasmatischen Protein 14-3-3- und werden daran gehindert, Interaktion mit TEAD1-4 Transkriptionsfaktoren im Zellkern zu nachgeschalteten transactivate Gene, die in der Zellproliferation und Apoptose (Abbildung 1). Trotz des enormen Interesses an den Hippo-Weg, existieren nur wenige Instrumente zur Messung der Hippo-Signalisierung und diejenigen, die historisch auf Reporter von YAP/TAZ/TEAD transkriptionelle Ausgabe beschränkt gewesen zu tun. In der Tat, bis vor kurzem gab es keine Instrumente zur Messung der Dynamik und Aktivität der das Nilpferd signalisieren Komponenten in einer quantitativen, in Echtzeit, Hochdurchsatz- und nicht-invasive Weise sowohl in Vitro und in Vivo.

Angesichts unserer aufstrebenden Verständnis der Rolle von Protein-Protein-Interaktionen in Physiologie und Pathologie, gibt es großes Interesse an der Entwicklung der Werkzeuge, die verwendet werden können, um diese Wechselwirkungen in quantitativer und Echtzeit-Art13zu studieren, 14,15,16. In der Tat gab es bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung von Bio-analytische Strategien, einschließlich der Hefe zweimischling (Y2H)17, der Surface Plasmon Resonance (SPR)18und Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)19 Assays, Protein-Protein-Wechselwirkungen zu bewerten. Diese Ansätze tragen jedoch die Begrenzung des erforderns signifikante Optimierung der Reporter Orientierung, so dass viele Konstrukte getestet werden müssen, um effizient zu finden. Darüber hinaus haben diese Ansätze auch eine relativ geringe Signal-Rausch-Verhältnis, so dass anspruchsvolle eine wahre positive Signalisierung kann eine Herausforderung sein.

Protein-Ergänzung-Assays wurden entwickelt, um diese Einschränkungen zu überwinden. Die erste Generation der Protein-Ergänzung-Assays basierte auf Split multicolor Fluoreszenz Proteine und die vorstehenden Haftungsbeschränkungen20nicht lösen konnte. Multicolor Fluoreszenz Proteine bestehen aus nur einer Domain, macht es schwierig, sie in zwei separaten stabilen Fragmente mit geringer Affinität und Hintergrund Lärm21aufgeteilt. Firefly Luciferase wurde anschließend als einen neuen Kandidaten für den Einsatz bei der Entwicklung von Split-Protein-Ergänzung-Assays identifiziert. Bei diesem Ansatz gliedert sich in zwei Fragmente (N-terminale und das C-terminale Luciferase [NLuc und CLuc]) mit jedem Fragment verschmolzen zu einem Zielprotein des Interesses Firefly Luciferase. Wenn die NLuc und CLuc in Nähe auf das Zusammenspiel von zwei Zielproteine gebracht werden, Luciferase-Aktivität wird wiederhergestellt und Biolumineszenz Licht wird im Beisein von Luciferin Substrat und ATP22erzeugt. Im Jahr 2001 durch Ausführen eine kombinatorische Screening mit einer Bibliothek von NLuc und CLuc Fragmente geschnitten an verschiedenen Standorten und beigefügt sind Proteine mit unterschiedlichen Linker, Paulmurugan und Gambhir an der Stanford University entwickelt eine optimierte Split-firefly Luciferase Komplementierung Fragment-gestützte System für Proteinprotein Interaktionen23. In diesem System ist Firefly Luciferase Aminosäure (aa) 398 NLuc und CLuc, die an zwei Proteine mit einer flexiblen Linker acht Glycin Rückstände zu bilden und zwei Serin Rückstände schneiden.

Mit einem ähnlichen Ansatz, wir vor kurzem einen neuen LATS-BS durch die Verschmelzung von NLuc bis 15 aa von YAP rund um den LATS Phosphorylierung Ort bei S127 (YAP15) und CLuc mit 14-3-3. Das Full-Length YAP-Protein wurde nicht verwendet, um zu vermeiden, verwirrende Signale von Post-translationalen Modifikationen von YAP (z.B. Phosphorylierung an anderen Standorten und Ubiquitination) von anderen vorgeschalteten Regulatoren. Die hier vorgestellten LATS-BS kann nicht-invasiv Hippo signalisiert Aktivität sowohl in Vitro in lebenden Zellen und in Vivo in Mäusen20,24 (Abbildung 2) überwachen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Messung LATS Kinase Aktivität in Vitro mit der LATS-BS. Zunächst zeigen wir, wie LATS-BS verwendet werden kann, um die Wirkung eines überexprimieren Proteins auf LATS Aktivität zu untersuchen. Dann zeigen wir, wie der Biosensor verwendet werden kann, um die Aktivität des Hippo-Signalwegs nach der Behandlung mit Mitteln zur Regelung des Hippo-Weges zu überwachen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, zu identifizieren und zu charakterisieren, Signalisierung Wege oder Reize regulieren LATS-Kinase-Aktivität.

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Protokoll

1. Untersuchung eines vermeintlichen Regulators der Hippo-Signal mit der LATS-BS

  1. Beschichtung und Transfektion von Zellen
    1. Vorbereitung der Zellkultur
      1. 1 X PBS, DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,25 % Trypsin-EDTA auf 37 ° C in einem Wasserbad für ca. 30 min. warm.
      2. Reinigen Sie gründlich einen Biosafety-Schrank mit 70 % Ethanol.
      3. Platzieren Sie Gewebekultur Gerichte, Pasteur-Pipetten, serologische Pipetten und Pipettenspitzen in der Gewebekultur Haube nach Bedarf.
      4. 1 x PBS, die Medien und die Trypsin-EDTA aus dem Wasserbad herausnehmen Sie, reinigen Sie sie mit 70 % Ethanol und legen Sie sie in die Haube.
    2. Wartung und Beschichtung der Zellen zur Transfektion
      1. Wählen Sie eine Zell-Linie mit einer hohen Transfection Leistungsfähigkeit (z.B.HEK293) für das Experiment. Überprüfen Sie für den Ausdruck von Hippo Weg Komponenten in dieser Zelllinie von western-Blot, um sicherzustellen, dass Hippo Signalisierung aktiv ist.
      2. Wachsen Sie HEK293 Zellen in DMEM in 10 cm Petrischalen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2. Überwachen Sie die Zellen unter dem Mikroskop jeden Tag. Durchgang der Zellen, wie unten beschrieben, wenn 80 – 90 % Konfluenz beobachtet wird.
      3. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 5 mL 1 X PBS in einer Platte, sanft Schwenken der Plattenrandes und die Medien vollständig absaugen.
      4. Fügen Sie 1 mL Trypsin-EDTA, bis auf den Teller. Schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die Trypsin gleichmäßig die Zellen umfasst.
      5. Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einem CO-2 -Inkubator für 5 min oder bis alle Zellen gelöst werden.
      6. Neutralisieren die Trypsin, Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren nach oben und unten mehrmals 4 mL der Medien (mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin) hinzu, und ein Zehntel (0,5 mL) der Zellen zu verzichten, in neue 100 mm Platten (für eine Weitergabe Verhältnis von 01:10) mit 9,5 mL komplette Medien.
      7. LATS-BS Transfection zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer und Platte 2 x 105 Zellen in jede Vertiefung eine 12-Well-Platte 24 h vor Transfektion.
        Hinweis: Verwenden der höhere Zellzahlen kann erhöhen Biolumineszenz Hintergrundsignal als Hippo signalisieren, dass die Aktivität von Zellen Konfluenz geregelt ist. Mit niedrigeren Zellzahlen kann Zelle Empfindlichkeit zur Transfektion Reagenzien erhöhen und Zelle Tod24erhöhen.
    3. Transfektion der LATS-BS allein oder zusammen mit dem Kandidaten-gen
      1. Miniprep LATS-BS Plasmide (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-Hygro und 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) frisch vom DH5a Bakterien Flüssigkultur (notwendig, um eine optimale LATS-BS-Ausdruck zu erreichen).
      2. 1 h vor Transfektion, Aspirieren Sie das Medium aus der Platte, geben 500 µL kompletten Wachstumsmedium in jeder der 12-Well-Platten und die Zellen in den Inkubator zurück.
        Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt Transfektion Methoden mit einem handelsüblichen Polymer-basierten Transfection Reagens. Anderen Transfektion Reagenzien können auch zur Transfektion geeignet; Allerdings haben wir noch nicht diese getestet.
      3. Stellen Sie Lösungen A und B wie in Tabelle 1beschrieben. Für N Transfektionen machen (N + 0,5) x Lösung B Premix.
      4. Sofort hinzufügen des verdünnten Polymer-basierten Transfection Reagens (Lösung B) an der DNA (Lösung A). Pipette oben und unten vorsichtig mischen.
      5. Inkubation der Probe bei Raumtemperatur für 15 min zur Transfektion komplexe Form zu ermöglichen.
      6. Geben Sie das Gesamtvolumen (76 µL) der Transfektion komplexe tropfenweise in jeder 12-Well-Platte mit sanften Wirbeln.
      7. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht (18 – 24 h) bei 37 ° c
        Hinweis: Für Zellen, die empfindlich auf Polymerbasis Transfektion Reagenzien sind, kann die Inkubationszeit bis 5 h reduziert werden.
      8. Am Tag nach der Transfektion, entfernen Sie die Transfektion-Komplex-haltigen Medien und ersetzen Sie es mit frischen komplette Medien. Kultur der Zellen bei 37 ° C für einen weiteren Tag Luciferase Assay durchzuführen.
  2. Luciferase assay
    Hinweis: Die Luciferase Reporter Testsystem Erkennung von Firefly und Renilla zusammen in einem Assay dient für die Luciferase-Assays. Wenn Renilla nicht als interne Kontrolle verwendet wurde, führen Sie einstufige Luciferase Assay durch Zugabe von LARII ohne Zugabe von Renilla -Erkennung-Reagenz.
    1. Vorbereitung der Zelle lysates
      1. Verdünnen Sie 5 X passive Lyse Puffer (PLB) mit destilliertem Wasser wie folgt:
      2. Gesamtvolumen von 1 X PLB erforderlich = N x (50 μL 5 x PLB) + 200 μL der dH2O = N X 250 μL 1 X PLB pro Bohrloch 12-Well-Platten (N = Anzahl der Proben).
      3. Die Medien komplett abzusaugen. Fügen Sie 1 mL 1 X PBS in jede Vertiefung. Schwenken Sie die Platte vorsichtig zu entfernen, die losgelöst Zellen und passives Wachstumsmedien. 1 X PBS vollständig abzusaugen. Stellen Sie sicher keine verbleibende 1 x PBS bleibt vor der Zugabe von 1 X PLB.
      4. Fügen Sie 250 μl 1 x PLB/gut.
      5. Legen Sie die Kultur-Platten auf eine rockende Plattform mit sanftes Schaukeln um vollständige und sogar die Zelle Monolage mit 1 abzudecken X PLB. Rock-Kultur-Platten bei Raumtemperatur 15 Minuten damit die Zellen lysiert.
      6. Übertragen Sie die lysate auf einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
    2. Die Biolumineszenz Messsignal
      1. Nehmen Sie den LARII (20 μL/Probe) von-80 ° C und Raumtemperatur equilibrate.
      2. N-Assays Renilla Erkennung Reagenz vorbereiten: hinzufügen (N + 1) x 0.4 μl 50 x Substrat (N + 1) x 19,6 μL der seinen Puffer.
      3. Predispense 10 μL jeder Zelle lysate, 1,5 mL Röhrchen.
      4. Programmieren Sie ein Luminometer, eine 2-s Zustandes Verzögerung, gefolgt von einer 10-s Messperiode für jedes dual Luciferase Assay durchzuführen.
        Hinweis: Die ersten und zweiten Messungen werden der LATS-BS und Renilla interne Kontrollsignal, bzw. entsprechend sein. Jede Luminometer kompatibel mit einfacher oder doppelter Luciferase kann verwendet werden.
      5. Sorgfältig 20 μL LARII Reagenz in eine Röhre und pipette schnell nach oben und unten 3 X zu mischen.
      6. Sofort setzen Sie das Rohr in die Luminometer und initiieren Sie die Lesung zu.
      7. Entfernen Sie das Probenröhrchen aus der Luminometer, sofort fügen Sie 20 μl der Renilla Reagenz hinzu und mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 3 X pipettieren. Bringen Sie die Probe in die Luminometer und initiieren Sie die nächste Messung. Notieren Sie die Maße.
      8. Verwerfen Sie das Reaktionsgefäß zu und fahren Sie mit der nächsten Probe.

(2) ein Bildschirm mit identifizieren Hippo Pathway Regulatoren der LATS-BS

  1. Zellkultur und Transfektionen
    1. Kultur-HEK293AD-Zellen, wie in Abschnitt 1.1 beschrieben.
      Hinweis: HEK293AD ist mehr Anhänger als andere HEK293-Zell-Linien, macht es eine gute Zell-Linie für den Einsatz in den Bildschirmen.
    2. Zellen zu trennen, wie im Abschnitt 1.1.2 beschrieben. Zählen und Platte 2 x 106 Zellen in 100 mm Platten 24 h vor Transfektion.
    3. 1 h vor Transfektion, Aspirieren Sie die Medien von der Platte und mit 5 mL frisches komplette Wachstumsmedien zu ersetzen.
    4. Stellen Sie Lösungen A und B wie in Tabelle 2beschrieben.
    5. Sofort hinzufügen des verdünnten Polymer-basierten Transfection Reagens (Lösung B) an der DNA (Lösung A). Pipette rauf und runter um zu mischen.
    6. Inkubation der Probe bei Raumtemperatur für 15 min zur Transfektion komplexe Form zu ermöglichen.
      1. Fügen Sie das Gesamtvolumen (500 µL hinzu) der Transfektion komplexe tropfenweise Zellen mit sanften Wirbeln.
      2. Die Zellen über Nacht bei 37 ° c inkubieren
      3. Am nächsten Tag trypsinize und die Zellen zu zählen. Platte 1 x 104 bis 2 x 104 Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte in einem Gesamtvolumen von 100 µL der Medien pro Bohrloch. Inkubieren Sie für einen anderen Tag.
    7. Fügen Sie am nächsten Tag Agenten/kleine Moleküle regulieren den Hippo-Weg auf eine Endkonzentration von 10 µM in jede Vertiefung, 1 – 4 h vor der Durchführung der Luciferase Assay hinzu.
      Hinweis: Für die meisten kleine Moleküle/Agenten, eine 4 h-Behandlung bei 10 µM nicht Zellviabilität wirkt. Wenn eine geringere Konzentration verwendet wird, kann die Behandlung für einen längeren Zeitraum verlängert werden.
  2. Luciferase assay
    1. In-vitro- Luciferase assay
      1. Die Medien aus den Zellen vollständig abzusaugen. Waschen Sie die Zellen mit 100 µL 1 X PBS in jede Vertiefung. Aspirieren Sie vollständig.
      2. Fügen Sie 20 µL 1 X PLB (zubereitet wie in beschrieben Schritt 1.2.1.1) in jede Vertiefung der 96-Well-Platten.
      3. Legen Sie die Kultur-Platten auf eine rockende Plattform mit sanftes Schaukeln bei Raumtemperatur 15 Minuten.
      4. Vorsichtig übertragen 20 µL LARII Reagenz in jede Vertiefung und pipette nach oben und unten 3 X zu mischen.
      5. Sofort die Platte in eine Platte-Lesung Luminometer und initiieren Sie die Lesung zu.
    2. Lebende Zelle Luciferase assay
      1. 11 x D-Luciferin Lager wie folgt machen: 1,5 mg D-Luciferin Pulver in 1 mL normale Nährmedien zu lösen.
      2. 10 µL 11 X D-Luciferin in jedem gut und mischen Sie es sanft mit den Medien, die bereits in den Brunnen zu übertragen.
      3. Ersetzen Sie die Zellen in den Brutkasten für 10 Minuten.
      4. Die Platte in die Luminometer und initiieren Sie die Lesung zu.
        Hinweis: Wenn die Signalstärke nicht stark genug, in dieser Konzentration von D-Luciferin ist, kann ein weiterer 10 µL der D-Luciferin bestand die Zellen hinzugefügt werden.

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Ergebnisse

Der LATS-BS war cotransfected mit verschiedenen Genen, deren Wirkung auf die LATS Aktivität (Abbildung 3) zu bewerten. In diesem Experiment wurde Renilla als interne Kontrolle verwendet. Die transiente Expression von YAP-5SA, ein konstitutiv aktive Form von YAP, Ursachen, die Erhöhung von YAP transkriptionelle Ziele und eine nachträgliche Erhöhung in LATS-Kinase-Aktivität durch einen etablierten Feedback Weg25. MST, die v...

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Diskussion

Während die Hippo-Signalweg wichtige Rollen in verschiedenen biologischen Prozessen spielt und Dysregulation des Hippo-Signalwegs zu Krebs6 führt, ist wie der Hippo-Weg in Reaktion auf verschiedene Reize reguliert wird nicht vollständig verstanden. Darüber hinaus gab es keine quantitativen und Echtzeit-System zur Bewertung der Tätigkeit von Hippo Kernkomponenten. Vor kurzem haben wir entwickelt und validiert ein neuartiges Biosensor zur Messung der LATS-Kinase-Aktivität in der Hippo Weg

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von Canadian Institute of Health Research (CIHR #119325, 148629) und der kanadischen Brust Krebs-Stiftung (CBCF) nach XY. TA wird von Vanier Canada Graduate Scholarship und das Ontario International Graduate Stipendium unterstützt. HJJVR wird von Königin Elizabeth II Graduate Stipendium in Wissenschaft und Technologie unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Trypsin-EDTA Life Technologies25200560.25%
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF1051
DMEMSigmaD6429-500mlDMEM with high glucose 
Penicillin StreptomycinLife Technologies15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent SignagenSL100688.5
5x Passive lysis bufferPromegaE194A30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay SystemPromegaE2940100 ml kit
20/20 luminometerTurner Biosystems998-2036Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectorsPromegaGM201096-well plates reader luminometer

Referenzen

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