Hippo, activité de voie à l’aide d’un biocapteur de suppresseur (LATS) axée sur la luciférase grande tumeur de signalisation de surveillance

Résumé

Nous présentons ici un biocapteur axée sur la luciférase afin de quantifier l’activité kinasique de suppresseur de tumeur grande (LAT)-une centrale kinase dans l’hippopotame voie de signalisation. Ce biocapteur a diverses applications en recherche fondamentale et translationnelle vise à déterminer l’Hippo voie régulateurs in vitro et in vivo.

Résumé

L’hippopotame, voie de signalisation est un régulateur conservé de la taille de l’organe et a un rôle important dans la biologie du développement et cancer. En raison de difficultés techniques, il reste difficile d’évaluer l’activité de cette voie de signalisation et de l’interpréter dans un contexte biologique. La littérature existante sur le suppresseur de tumeur grande (LATS) repose sur des méthodes qualitatives et ne peuvent pas facilement être mise à l’échelle en place pour le dépistage. Récemment, nous avons développé un biocapteur axée sur la bioluminescence pour surveiller l’activité de la kinase de la composante de LATS-a base de la cascade de kinase de Hippo. Nous décrivons ici les procédures pour comment ce biocapteur LATS (LATS-BS) peut être utilisé pour caractériser les régulateurs voie Hippo. Tout d’abord, nous fournissons un protocole détaillé pour étudier l’effet d’une protéine surexprimée candidate (par exemple, VEGFR2) sur l’activité LATS utilisant le LATS-BS. Ensuite, nous montrons comment le LATS-BS peut être utilisé pour un écran d’inhibiteur de la kinase à petite échelle. Ce protocole peut être facilement mis à l’échelle en place pour effectuer des écrans plus grands, sans aucun doute déceler les nouveaux régulateurs de la voie de l’hippopotame.

Introduction

L’hippopotame signalisation voie a été identifié chez la drosophile comme un nouveau régulateur de croissance cellulaire et animale taille^1,2. Depuis sa découverte initiale, montage des éléments de preuve convaincante démontre que la voie Hippo joue un rôle crucial dans le développement (p. ex., développement embryonnaire précoce, contrôle orgue de la taille et la morphologie tridimensionnelle [3D]), () tumorigenèse par exemple, le développement de tumeurs, métastases, angiogenèse, évasion immunitaire, instabilité génomique, réponse au stress et la résistance aux médicaments) et l’homéostasie tissulaire(par exemple, la régénération des cellules souches et différenciation et régénération des tissus après une blessure) ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. signalisation hippo est fréquemment dysrégulation dans divers cancers^{7,8,9,10,11,12}. Par conséquent, élucider les fonctions de la voie Hippo en biologie du cancer et de thérapeutique et de la médecine régénérative est devenue une des zones plus chaudes en recherche biomédicale.

En bref, dans la voie de l’hippopotame, lors de l’activation par les régulateurs en amont (p. ex., contact cellule-cellule, stress nutritif et la matrice extracellulaire [mec]), MST1/2 (MST ; des homologues chez les mammifères de Drosophila Hippo) kinases de sérine/thréonine (S/T) phosphoryler/activer adaptateur protéines hMOB1 et WW45, ainsi que les kinases LATS1/2 (LATS) qui, par la suite, phosphorylent l’activateur de la transcription co YAP et son paralogue TAZ à conservé HX(H/R/K)XX(S/T) (H, histidine ; R, arginine ; K, lysine ; S, sérine ; T, thréonine ; X, des acides aminés) motifs, y compris YAP-S127 et TAZ-S89^11,12. S127-phosphorylés YAP (YAP-pS127) et TAZ S89-phosphorylés (TAZ-pS89) sont dégradés par ubiquitination ou lient à la protéine cytoplasmique 14-3-3 et ne peuvent pas interagir avec les facteurs de transcription TEAD1-4 dans le noyau de transactiver en aval gènes impliqués dans la prolifération cellulaire et l’apoptose (Figure 1). Malgré l’intérêt énorme dans la voie de l’hippopotame, peu d’outils pour mesurer les Hippo de signalisation existe et ceux qui ont été historiquement limité à des journalistes de sortie transcriptionnelle YAP/TAZ/marchés DEAM. En effet, jusqu'à une date très récente, il n’y a pas d’outils pour mesurer la dynamique et l’activité de l’hippopotame signalisation composants de manière quantitative, en temps réel, haut débit et non invasif in vitro et in vivo.

Compte tenu de notre compréhension du rôle des interactions protéine-protéine en physiologie et en pathologie émergente, il y a beaucoup d’intérêt dans le développement d’outils qui peuvent servir à étudier ces interactions dans une manière quantitative et en temps réel^{13, 14,15,16}. En effet, il y a eu des progrès significatifs dans le développement de stratégies de bio-analytique, notamment la levure-hybride (Y2H)¹⁷, la surface plasmon resonance (SPR)¹⁸et Förster resonance energy transfert (FRET)¹⁹ essais, pour évaluer les interactions protéine-protéine. Cependant, ces approches portent la limitation des nécessitant une optimisation significative de l’orientation de la journaliste, tels que les nombreuses constructions seront essayées pour trouver un efficace. En outre, ces approches ont également un ratio signal-bruit relativement faible, telles que peut être difficile de discerner un vrai positif de signalisation.

Tests de complémentation protéique ont été développés afin de surmonter ces limitations. La première génération de tests de complémentation protéique reposait sur les protéines de fluorescence multicolore de split et ne résolut pas les limites susmentionnées²⁰. Protéines de fluorescence multicolore se composent d’un seul domaine, rendant difficile de diviser en deux fragments stables distinctes avec faible affinité et de bruit de fond²¹. Par la suite, luciférase firefly a été identifié comme un nouveau candidat pour une utilisation dans le développement de tests de complémentation protéique split. Dans cette approche, la luciférase firefly est divisé en deux fragments (luciférase [NLuc et CLuc] N-terminal et C-terminal) avec chaque fragment fusionné à une protéine cible d’intérêt. Si le NLuc et le CLuc sont mises en proximité sur l’interaction des protéines deux cibles, activité de la luciférase est reconstituée et lumière bioluminescente est généré en présence du substrat de la luciférine et ATP²². En 2001, en effectuant une projection combinatoire à l’aide d’une bibliothèque contenant des fragments NLuc et CLuc coupe à divers endroits et attaché aux protéines avec différents linkers, Paulmurugan et Garcin à l’Université Stanford mis au point un split-firefly optimisée système assisté par fragment complémentation luciférase d’interactions protéine-protéine²³. Dans ce système, luciférase firefly est coupé à l’acide aminé (aa) 398 pour former des NLuc et CLuc, qui sont attachés aux deux protéines d’intérêt en utilisant un linker flexible de huit résidus glycine et deux résidus sérine.

En utilisant une approche similaire, nous avons développé récemment un nouveau LATS-BS en fusionnant NLuc à 15 aa de YAP entourant le site de phosphorylation LATS à S127 (YAP15) et CLuc avec 14-3-3. La protéine pleine longueur de YAP n’était pas utilisée, pour éviter la confusion des signaux par des modifications post-traductionnelles de YAP (par exemple, la phosphorylation à d’autres sites et l’ubiquitination) par d’autres organismes de réglementation en amont. Le LATS-BS présenté ici peut surveiller non invasive Hippo activité de signalisation aussi bien in vitro dans les cellules vivantes et en vivo en souris^20,24 (Figure 2). Nous décrivons ici un protocole détaillé pour mesurer les LATS kinase activité in vitro en utilisant le LATS-BS. Tout d’abord, nous montrons comment le LATS-BS peut être utilisé pour étudier l’effet d’une protéine surexprimée sur l’activité LATS. Ensuite, nous montrons comment le biocapteur peut être utilisé pour surveiller l’activité de la voie Hippo après traitement avec des agents de régulation de la voie de l’hippopotame. Ce protocole peut être utilisé pour identifier et caractériser la signalisation des voies ou des stimuli réglementant l’activité kinase LATS.

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Protocole

1. enquête d’un organisme de réglementation putatif de Hippo signalisation utilisant le LATS-BS

1. Placage et transfection de cellules
   1. Préparation de culture cellulaire
      1. Chauffer 1 x PBS, DMEM contenant 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine et 0,25 % de trypsine-EDTA à 37 ° C au bain-marie pendant environ 30 min.
      2. Nettoyer à fond un meuble de biosécurité avec l’éthanol à 70 %.
      3. Placez les plats de culture tissulaire, pipettes Pasteur, pipettes sérologiques et pointes de pipette dans la hotte de culture de tissus selon les besoins.
      4. Retirez 1 x PBS, les médias et la trypsine-EDTA du bain-marie, nettoyez-les avec l’éthanol à 70 % et placez-les dans la hotte.
   2. Entretien et placage des cellules pour la transfection
      1. Choisissez une lignée cellulaire avec une efficacité de transfection élevé (p. ex., HEK293) pour l’expérience. Recherchez l’expression des composants de voie Hippo dans cette lignée cellulaire par western blot pour s’assurer que l’hippopotame de signalisation est active.
      2. La croissance de cellules HEK293 en DMEM en Pétri de 10 cm dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO₂. Surveiller les cellules au microscope chaque jour. Le passage des cellules tel que décrit ci-dessous, lorsqu’on observe de confluence de 80 à 90 %.
      3. Laver les cellules en ajoutant 5 mL de PBS 1 x dans une assiette, en agitant doucement la plaque et en aspirant les médias complètement.
      4. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA à la plaque. Agiter la plaque afin de s’assurer que la trypsine couvre uniformément les cellules.
      5. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO₂ pendant 5 min ou jusqu'à ce que toutes les cellules sont détachent.
      6. Ajouter 4 mL de médias (avec 10 % SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine) pour neutraliser la trypsine, de remettre en suspension les cellules en pipettant également monter et descendre plusieurs fois et répartir un dixième (0,5 mL) des cellules dans des nouvelles plaques de 100 mm (pour un rapport de passage de 01:10) contenant 9,5 mL de toutes les médias.
      7. Pour la transfection LATS-BS , compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et plaque 2 x 10⁵ éléments dans chaque puits d’une plaque de 12 puits 24h avant la transfection.
         Remarque : En utilisant des nombres plus élevés de cellules peut augmenter le signal de fond bioluminescentes comme Hippo signalisation activité est réglementée par la confluence de la cellule. À l’aide du plus faible nombre de cellules peut augmenter la sensibilité des cellules aux réactifs de transfection et augmenter la cellule mort²⁴.
   3. Transfection de LATS-BS seul ou ensemble avec le gène candidat
      1. Miniprep LATS-BS plasmides (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-Hygro et 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro), frais de culture liquide de bactéries DH5a (nécessaire pour obtenir une expression optimale de LATS-BS).
      2. 1 h avant la transfection, aspirer le milieu de la plaque, ajouter 500 µL de milieu de culture complet dans chaque loge des plaques de 12 puits et remettez les cellules dans l’incubateur.
         Remarque : Le protocole suivant décrit les méthodes de transfection utilisant un réactif de transfection de base de polymères commercialement disponible. Les autres réactifs de transfection peuvent également être adaptés pour la transfection ; Cependant, nous n’avons pas encore testé leur.
      3. Faire des solutions A et B tel que décrit dans le tableau 1. Pour transfections N, faire le (N + 0,5) x prémélange de solution B.
      4. Ajouter immédiatement le réactif dilué à base de polymère transfection (solution B) à l’ADN (solution A). Pipetter, doucement de haut en bas pour mélanger.
      5. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 15 minutes permettre à des complexes de transfection pour former.
      6. Ajouter le volume total (76 µL) de complexes de transfection goutte à chaque puits de la plaque de 12 puits agitant doucement.
      7. Incuber les cellules pendant la nuit (18 à 24 h) à 37 ° C.
         Remarque : Pour les cellules qui sont sensibles aux réactifs de transfection à base de polymères, le temps d’incubation peut être réduit à 5 h.
      8. Le jour après la transfection, retirez le support contenant de la transfection-complexe et remplacez-le par les supports complets neufs. La culture des cellules à 37 ° C pendant une autre journée pour effectuer l’analyse de luciferase.
2. Analyse de luciferase
   Remarque : Le système d’analyse de journaliste luciférase détection firefly et Renilla ensemble dans un seul test est utilisé pour les dosages de la luciférase. Si Renilla n’était pas utilisée comme témoin interne, effectuer de luciferase en une seule étape en ajoutant LARII sans ajouter le réactif de détection Renilla .
   1. Préparation des lysats cellulaires
      1. Diluer le tampon de lyse passive 5 x (PLB) avec de l’eau distillée comme suit :
      2. Volume total de 1 x PLB requis = N x (50 μL de 5 x PLB) + 200 μL de dH2O = N x 250 μL de 1 x PLB / puits des plaques 12 puits (N = nombre d’échantillons).
      3. Aspirer les médias complètement. Ajouter 1 mL de solution 1 PBS x dans chaque puits. Agiter la plaque doucement pour enlever détaché les cellules et les milieux de croissance résiduelle. Aspirer la solution de PBS 1 x complètement. N’Assurez-vous qu’aucun résiduel 1 x PBS reste avant l’addition de 1 x PLB.
      4. Ajouter 250 μL de 1 x PLB/puits.
      5. Placer les plaques de culture sur une plate-forme bascule avec balancement doux afin d’assurer une couverture complète et même de la monocouche cellulaire avec 1 x PLB. Balancer les plaques de culture à la température ambiante pendant 15 minutes permettre aux lyse des cellules.
      6. Transférer le lysat dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
   2. Mesurer le signal de bioluminescent
      1. Sortez le LARII (20 μL/échantillon) de-80 ° C et elle est proportionnelle à la température ambiante.
      2. Préparer le réactif de détection de Renilla pour des dosages de N : ajouter (N + 1) x 0,4 μL de 50 x substrat à (N + 1) x 19,6 μL de sa mémoire tampon.
      3. Predispense 10 μL de chaque cellule de lysat pour tubes de 1,5 mL.
      4. Programmer un luminomètre pour effectuer un retard premeasurement 2-s, suivi d’un point de mesure de 10 s pour chaque double de luciferase.
         Remarque : Les mesures des premières et la deuxième seront correspondant au signal LATS-BS et le signal de contrôle interne Renilla , respectivement. Un luminomètre compatible avec une luciférase simple ou double peut être utilisé.
      5. Transvaser avec soin 20 μl de réactif LARII dans un tube et Pipeter rapidement monter et descendre 3 x pour le mélanger.
      6. Immédiatement, placer le tube dans le luminomètre et lancer la lecture.
      7. Retirer le tube échantillon du luminomètre, immédiatement ajouter 20 μL de réactif Renilla et mélanger en pipettant également monter et descendre 3 x. Amener l’échantillon dans le luminomètre et initier la prochaine lecture. Enregistrer les mesures.
      8. Jeter le tube de réaction et de procéder à l’échantillon suivant.

2. un écran pour identifier Hippo voie régulateurs utilisant le LATS-BS

1. Culture de cellules et de transfections
   1. HEK293AD des cellules de culture tel que décrit à l’article 1.1.
      Remarque : HEK293AD est plus adhérent que les autres lignées de cellules HEK293, qui en fait une lignée de cellules bon pour une utilisation dans les écrans.
   2. Détacher les cellules comme décrit au paragraphe 1.1.2. Compter et blanc sur plaque de 2 x 10⁶ cellules en plaques de 100 mm 24h avant la transfection.
   3. 1 h avant la transfection, aspirer les médias de la plaque et les remplacer par 5 mL de milieu de culture complet frais.
   4. Faire des solutions A et B tel que décrit dans le tableau 2.
   5. Ajouter immédiatement le réactif dilué à base de polymère transfection (solution B) à l’ADN (solution A). Pipetter en haut et en bas pour mélanger.
   6. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 15 minutes permettre à des complexes de transfection pour former.
      1. Ajouter le volume total (500 µL) de complexes de transfection goutte à cellules agitant doucement.
      2. Incuber les cellules durant la nuit à 37 ° C.
      3. Le lendemain, trypsinize et compter les cellules non vides. Plaque de 1 x 10⁴ à 2 x 10⁴ cellules dans chaque puits d’une plaque de 96 puits en un volume total de 100 µL de médias par puits. Incuber pendant un autre jour.
   7. Le lendemain, ajouter les molécules des agents/petite réglementant la voie Hippo à une concentration finale de 10 µM à chaque puits, 1 – 4 h avant de procéder à l’analyse de luciferase.
      Remarque : Pour la plupart des petites molécules/agents, un traitement de 4 h à 10 µM n’affecte pas la viabilité des cellules. Si une concentration plus faible est utilisée, le traitement peut être prolongée pour une plus longue période de temps.
2. Analyse de luciferase
   1. In vitro de luciferase
      1. Aspirer les médias des cellules complètement. Laver les cellules avec 100 µL de solution de 1 PBS x dans chaque puits. Aspirer complètement.
      2. Ajouter 20 µL de 1 x PLB (préparé comme décrit dans étape 1.2.1.1) dans chaque puits des plaques 96 puits.
      3. Placer les plaques de culture sur une plate-forme bascule avec balancement doux à température ambiante pendant 15 min.
      4. Soigneusement, transférer 20 µL de réactif de LARII dans chaque puits et Pipeter haut et bas 3 x pour mélanger.
      5. Immédiatement, placer la plaque dans un luminomètre plaque-lecture et lancer la lecture.
   2. Analyse de luciferase cellule vivante
      1. Faire 11 x stock D-luciférine comme suit : dissoudre 1,5 mg de poudre D-luciférine dans 1 mL de milieux de culture normale.
      2. Transférer 10 µL de x 11 D-luciférine dans chaque puits et mélanger doucement avec les médias qui se trouve déjà dans le puits.
      3. Remplacer les cellules dans l’incubateur pendant 10 min.
      4. Placer la plaque dans le luminomètre et lancer la lecture.
         Remarque : Si l’intensité du signal n’est pas assez forte à cette concentration de D-luciférine, un autre 10 µL du stock D-luciférine peut être ajouté aux cellules.

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Résultats

Le LATS-BS a été cotransfecté avec différents gènes afin d’évaluer leur effet sur l’activité de LATS (Figure 3). Dans cette expérience, Renilla a été utilisée comme témoin interne. L’expression transitoire de YAP-5SA, une forme constitutive active de YAP, causes d’augmentation des niveaux de YAP transcriptionnelles cibles et une augmentation activité kinase LATS par une rétroaction établies voie²⁵. MST, ...

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Discussion

Alors que la voie Hippo joue un rôle important dans divers processus biologiques, et le dérèglement de la voie Hippo mène au cancer⁶, comment la voie Hippo est régulée en réponse à divers stimuli n’est pas complètement compris. En outre, il n’y a eu aucun système en temps réel et quantitative pour évaluer l’activité des éléments de base Hippo. Récemment, nous avons développé et validé un biocapteur roman pour mesurer l’activité kinase LATS dans la voie de Hippo

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin-EDTA	Life Technologies	2520056	0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F1051
DMEM	Sigma	D6429-500ml	DMEM with high glucose
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent	Signagen	SL100688.5
5x Passive lysis buffer	Promega	E194A	30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System	Promega	E2940	100 ml kit
20/20 luminometer	Turner Biosystems	998-2036	Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors	Promega	GM2010	96-well plates reader luminometer