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要約

ここでは、プロトコルを提案フェルスター共鳴の同時使用のため力感受性の測定を有効にするタンパク質ダイナミクスを測定するため退色後蛋白質負荷と蛍光の回復を測定するエネルギー転送ベースのテンション センサー細胞内蛋白質の原動力。

要約

細胞感覚し、機械的刺激をメカノトランスダクションと呼ばれるプロセスで生化学的に検出可能な信号に変換することによって、環境内の物理的な手がかりに対応します。メカノトランスダクションの重要なステップは、外部と内部の環境の間の力の伝達です。強制的に送信する、一連の蛋白質蛋白質の相互作用によって作成された持続的な切れ目のない物理的なリンケージがあります。特定の蛋白質蛋白質の相互作用の機械的負荷いずれかがない場合の相互作用に及ぼす影響、相互作用の高速化解除につながる、あるいは安定の相互作用。どのように分子の負荷についての生きている細胞の蛋白質の転換は順番メカノトランスダクションにおけるその役割の解明蛋白質の力学状態に関する貴重な情報を提供できるが決まります。力感受性タンパク質ダイナミクスを測定するための既存の技術か蛋白質負荷の直接測定を欠いている、携帯電話のコンテキストの外部で実行する測定に依存します。ここでは、生きた細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定を可能にする (フレット FRAP) フォトブリーチング法後蛍光共鳴エネルギー伝達蛍光回復のためのプロトコルについて述べる。この手法は、潜在的力感受性タンパク質ダイナミクス細胞レベル下の構造の様々 な異なる種類の細胞の研究を促進する任意のフレット ベース張力センサーに適用されます。

概要

細胞外の環境は、細胞のふるまいを指示する生化学的および物理的な手がかりの豊富なソースです。特に、微小環境の物理的性質はキーの細胞などの細胞の増殖、移行、および分化1,2,3,4を仲介することができます。制御の仕組みの不全、癌5、アテローム性動脈硬化の6、および線維症7などの適切な治療をしていない多くの病気に重要なコンポーネントです。細胞が物理的な刺激を生化学的に検出可能な信号に変換する方法を完全に理解、プロセス メカノトランスダクションと呼ばれる、力の伝達、細胞の内外の両方に関わる分子メカニズムの解明が必要ですし、複数細胞内構造体。

細胞レベル下の構造の中タンパク質は常に裏返し;バインドとバインドのパートナー8との相互作用の強さに基づいてバインド解除。物理的な距離間で正常に送信される力の蛋白質蛋白質の相互作用、タンパク質の代謝回転が維持し、そのバインディング パートナー9に力を伝達できるほど低速である必要があることを意味の切れ目のない連鎖があります。相互作用はしばしば異なる条件10,の下で非連結状態に移行できるバインド済み状態として概念化蛋白質蛋白質の相互作用は一般のいくつか非共有結合性タンパク質のドメイン間をで構成、11します特定の蛋白質蛋白質の相互作用の力がなし「理想的な絆」として知られている相互作用の寿命に影響を及ぼす、「スリップの絆」として知られている相互作用の有効期限を短縮または相互作用の寿命を延ばすことが可能だ。、「キャッチ絆」10として知られています。したがって、蛋白質負荷と我々 は敏感なダイナミクスとして参照する蛋白質ダイナミクスの複雑な関係があります。

結合ダイナミクスに及ぼす荷重の解明、分子レベルで非常に有益な実験の数を行った。孤立したタンパク質やタンパク質の原子間力顕微鏡光ピンセットや磁気ピンセットなど操作技術の断片を使用して、これらの研究は関連性の高いいくつかの敏感なタンパク質間相互作用を実証しています。タンパク質11,12。両方インテグリン13とカドヘリン14、膜貫通タンパク質細胞マトリックスと細胞間の相互作用をそれぞれ形成のために重要であるロードによるダイナミクスの変化を示しています。細胞内ビンキュリンが15と α-カテニン16をタリンと両方に力依存的に募集し、アクチン17, ストレスファイバー (FAs)、アドヘレンスジャンクション (AJs ビンキュリンの重要な役割を示すキャッチ結合を形成することができます。) 負荷の下で。単一分子の研究特定タンパク質-タンパク質相互作用の分離を可能にする、彼らは細胞の環境の複雑さを考慮しない、明確な結果をもたらします。

画期的な実験実証 FAs、AJs を含む、いくつかの細胞内構造を受容が内部的に生成または外部から適用荷重18,19への応答で強化されたアセンブリを展示、 20,21,22。さらに、いくつかの理論的モデルは、力感受性タンパク質ダイナミクス23,24,25機械アセンブリを運転できることを示唆しています。生きた細胞内でこれらの敏感なダイナミクスを調べるいくつかの間接的なアプローチが取られています。縛ると関連技術は、細胞26,27,28,29タンパク質の動態を測定するため比較的単純な方法論を提供します。ただし、蛋白質負荷の測定はより制限されています。典型的なアプローチは、タンパク質の動態と全体的な細胞収縮8,30,31を減らすために使用される細胞骨格阻害剤への露出なしのセルを比較することです。概念的には、これは高負荷と低負荷の状態の比較です。ただし、いずれかの状態で蛋白質間で負荷の定量化がないと阻害剤, F-アクチン フィラメントに沿ってキー結合部位のような損失の生化学的な効果を意図しない可能性があります。別のアプローチは、FAs に固有は、分子の負荷を概算し、FA32内の単一蛋白質の動態との関係を調べる牽引力顕微鏡を用いた FA による基板上の合計の力運動を測定してきました。このアプローチは、合計の力の定量化により、分子固有の情報は提供されません。FAs はロード33を耐えることができる多くの以上の 200 の異なるタンパク質から成っています。したがって、可能性のある FA の力の合計出力の測定力伝送経路の複数の可能性が不明瞭、特定のタンパク質では負荷の測定を確実に提供されません。

フレット ベース張力センサーの出現により直接、メカノバイオロジーで従来のアプローチとは異なり細胞34,35,36生活の中の特定のタンパク質によって発生する負荷の測定。タンパク質ダイナミクスの FRAP ベース メジャーとフレット ベース張力検出器を組み合わせたプロトコルを紹介します。我々 はフレット FRAP としてこの技法を参照してください。この方法は、蛋白質負荷と細胞 (図 1) の力感受性タンパク質ダイナミクスの評価をこのように蛋白質の原動力の同時測定できます。既に、フレット FRAP テクニックは機械的リンカー蛋白質ビンキュリン37の敏感なダイナミクスの研究に適用されています。張力検出器は、様々 な細胞内構造に関連している多数の蛋白質のために開発されています。たとえば、センサーはビンキュリン タリンと34 38,39 FAs、カドヘリンと AJs40,41,42, 複雑な核のバイオスで nesprin でカテニン発現で開発されています。43α-アクチニン44フィラミン36骨格と、糖衣45、他の中の MUC 146。同様に、FRAP は一般的に使用される手法は、焦点接着斑8,31、単接合47、アクチン皮質26、および核48内の機械受容蛋白質で使用されています。今後は、これらの既存のセンサーまたは新しくフレット FRAP 技術はいずれかに広く適用する必要がありますさまざまな細胞レベル下の構造およびコンテキストの敏感な現象の測定を可能にするセンサーを開発しました。この終わりに向かってフレット FRAP 手法適用これらの異なるシステムでの実装の詳細、一般化されたプロトコルを提供します。うまくいけば、これはさまざまな力の伝達を調節する、細胞の挙動を媒介に様々 な機械受容タンパク質の機能解明の実験になります。

プロトコル

1. イメージングのためのサンプルを生成します。

  1. 目的のセル型で安定高速張力センサー構造です。
    1. PRRL ベクトルまたは他のウイルスの発現プラスミドに張力センサー構造を複製します。
      注: いくつかの異なる分子クローニング ツール、拡張子とギブソン アセンブリ35重複制限酵素の使用を含むこのステップを達成するために利用できます。PRRL ベクトル遺伝子導入ウイルス伝達で使用でき、人間サイトメガロ ウイルス (CMV) のプロモーターを使用して蛋白質の生産の相当な程度。別のベクトルは、特定のコンテキストで必要ことがあります。例えば、CMV プロモーターはいくつかの細胞のタイプの49で黙らせた。さらに、のみ蛍光蛋白質を含んでいるフレット ベース センサーに不足なシーケンス相同性、mTFP1、金星 A206K など使用できます安定したセルラインを作成します。シアンの蛍光タンパク質と黄色い蛍光蛋白質を含むセンサーは相同組換え50対象でしょう。
    2. PsPax2 と標準ウイルス生産方法51を使用して pMD2.G パッケージ プラスミドを用いた人間胚性腎臓 (HEK) 293 t 細胞のレンチ ウイルスを生成します。
      注意: レンチ ウイルスは、バイオ セーフティ レベル 2 の実験室環境で適切に訓練された人員によってのみ処理する必要があります。
      注: このセルと包装プラスミドの組み合わせは pRRL で使用する適切です。他のシステムでは、, 他のベクトルが必要。
    3. 標準伝達プロトコル52を使用してウイルスの任意のセルを変換し、フローサイトメトリーを使用して並べ替えるセル53約内因性レベル37で各構成要素を表現する同種の人口を選択します。セル選択後、すぐに実験を行うことができるまたはセルを後で使用するため低温固定できます。与えられた安定したセルライン 2 凍結融解サイクルを超えないようにします。
      メモ: セルライン研究 (例えば、ビンキュリン張力センサー使用のため-/- ビンキュリン MEFs) するタンパク質の欠乏の使用は過剰発現アーティファクトを制限し同様、ノイズ比実験でフレットに信号を増加します。このような安定したマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) の行に使える表現の重要な損失の前に約 15 通路またはセンサーの劣化は明らか。ウイルスに基づく手法が必要ない場合は試薬の茄多は、一過性 pcDNA3.1 などの適切なプラスミッドの張力検出器のさまざまな種類の細胞を使って製造元のプロトコルに従って使用できます。最適な表現は、次のトランスフェクション 24-48 h になります。
  2. 細胞の播種のための基板を準備します。
    1. 4、35 mm ガラス底皿を取得します。
    2. 細胞文化フードで働いて、15 mL の標準管には、10 μ G/ml フィブロネクチンの 4 mL 細胞文化フード滅菌 PBS を使用したリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ソリューション。優しくミックスして解決策は細胞文化フードで 5 分間座ってみましょう一度チューブを反転します。
      注: 濃度またはタイプの ECM 蛋白質は他の細胞型の調整があります。提供条件は MEFs に適しています。
    3. 各ガラス底皿にフィブロネクチン溶液 1 mL のピペットします。
    4. 室温で 1 時間の料理にフィブロネクチン ソリューションを残したり、4 ° C で一晩
    5. フィブロネクチン ソリューションを吸引、PBS で一度洗い、1 mL の PBS を追加します。
  3. 準備された基板上に細胞を播きます。
    1. 6 cm の培養皿で継代培養に適した合流割合で興味のセルの開始します。
      メモ: 異なる種類の細胞細胞培養条件および継代培養のプロトコルが必要になります。MEFs に適したガイドラインを説明します。通常、MEFs は継代培養する前に 85% の合流点に成長しました。
    2. 細胞文化フード内での作業、3 mL の PBS で 1 回細胞をすすいでください。0.05 %1 mL を加えてトリプシン-EDTA と 37 ° C で 5 分間インキュベート
    3. 6 cm の皿に 3 mL の完全培地を追加、細胞を収集し、15 mL の円錐管に配置。
      注: 完全なメディアの構成、使用しているセルの種類によって異なります。MEFs、完全なメディアは、多くの場合 10% 牛胎児血清 1% と高グルコース ダルベッコ変更イーグル媒体として定義抗生物質真菌 (含むアムホテリシン B、ペニシリンとストレプトマイシン)、および 1% の非本質的なアミノ酸 (NEAA) ソリューション。
    4. 5 分 1000 x g でセルを回しなさい。
    5. メディアを吸引し、完全なメディアの 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
    6. フィブロネクチン コーテッド ガラス皿から PBS を削除します。セルをカウントで 1.5 mL の最終的なボリュームの適切な完全なメディア各フィブロネクチン コーティング ガラスの皿に 30,000 セルをシードします。
      注: このセル密度 MEFs に適して、感動的、しかしない非常に疎ではない細胞の人口に 。正確なセル数は、他の細胞型またはその他のイメージングの商工会議所の調整する必要があります。
    7. 細胞の播種後 4 h の広がりを許可します。広がりの 2 h は、成長媒体を吸引、イメージング メディア、画像メディアの 1.5 mL のままで一度すすいでください。
      注: 今回は拡散は MEFs に適切ですが、他のセルを変更する必要があります。ただし、6 ~ 8 h より長い潜伏期間は、完全なメディアの血清から ECM タンパク質の重要な沈着に します。イメージング メディア完全なメディアとして同じ変更を含める必要がありますが、光学的クリアしない画像チャンネル、フラビンなどの任意の化合物を含んで中または蛍光、フェノールレッドなどを消すべき。一般的に有用なイメージング メディア 10 %fbs と 1 %neaa 溶液を添加した DMEM gfp 生きているセルの視覚化メディアです。バック グラウンド蛍光が許容できないほど高い場合は、血清の量を減らすことが。初期のめっき後のメディアの変更ができない場合、セルすることができます直接イメージング トリプシン阻害剤を添加したメディアで再停止。

2. イメージングのための顕微鏡を設定します。

  1. 顕微鏡を入れます。
    1. 最初、ランプをオンにします。
      注: アーク ランプは電磁パルスで、上にある他の機器に損傷を与えることができますをリリースします。
    2. フィルター ホイール コント ローラー、自動ステージ コント ローラー、顕微鏡とコンピューターのインターフェイス、およびカメラをオンにします。
    3. FRAP レーザーおよびレーザーの位置コント ローラー。
      注意: ハイパワー レーザーは、直接表示した場合、目が損傷します。サンプルに向かってレーザーを反映し、感染を防ぐ漂白中 FRAP ビームパスに鏡を移動することによって達成することができます目の部分に指示されてからレーザー励起をブロックする顕微鏡システムを構成するのにはお勧め固定観念に捕らわれています。
    4. コンピューターとオープン顕微鏡制御ソフトウエアを入れます。
    5. ランプのウォーム アップに縛るレーザー 15 分を許可します。
  2. FRAP レーザーを調整します。
    1. レーザーの設定ウィンドウを開きます。サンプルにレーザー露光に適した FRAP 照明設定する (パルス) の中に照明の設定を設定します。アクセプター分子蛍光のみをイメージングに適した照明の設定を (イメージング) の中に照明の設定を設定します。
    2. [設定] で座標系を調整する目的を選択します。校正ポイントを手動でをクリックしてをオフ、校正中に画像を表示を確認します。
    3. 10,000 μ s、100 パルス数に滞留時間を設定します。
    4. 臭化エチジウム coverslip 側を下とステージ アダプターにスライド ガラスと観察間で封の校正スライドを配置します。
      注意: エチジウム ブロマイド、変異原物質は、手袋を使用して処理する必要があります。スライドが侵害された場合、金融機関のガイドラインに従って処分します。
    5. アクセプタ照明設定を使用して、スライド、明るい信号で焦点面が特定の面に焦点を当てます。塗膜の小さな欠陥は、焦点を支援するため表示されます。
    6. 画像平面の間で制服蛍光領域にスライドを移動します。
    7. 設定を作成するをクリックします。ソフトウェアは、自動的に漂白剤と漂白のポイントの位置を検出、校正プロセスを初期化します。
    8. 3 x 3 グリッド フォーカスで均等に分散する必要があります漂白のポイントのである最終的なイメージを評価することによって成功した校正を確認します。今後の参考のため校正画像を保存します。
    9. 校正スライドを取り出して、安全に保管します。校正は各実験を開始する前に実行する必要がありますが、サンプル間で実行する必要はありません。

3. FRET イメージングのパラメーターを選択します。

  1. 10 分パラホルムアルデヒド ソリューション 4% パラホルムアルデヒドでテンション センサーを発現する細胞の生成されたサンプルの 1 つ修正しなければならないメタノール無料、蛍光タンパク質の変性を防ぐために、EM グレードと呼ばれます。固定後の PBS を場所します。
    注意: パラホルムアルデヒド ソリューション、有毒です。発煙のフードでこの手順を実行する必要があります、ソリューション制度ポリシーに従って処分すべき。
    注: この最適化はタンパク質ダイナミクスに依存しないし、固定サンプルは、細胞の健康を気にせず最大の撮像時間のことができます。
  2. すすぎ 3 回 PBS でサンプルし、PBS に残します。
    注: 最も商業的利用可能なメディアをマウントの使用がプロパティに影響 fluorophore、FRET イメージング54の不適切なサンプルを作るします。理想的には、セル、すぐにイメージ化が、4 ° C で一晩残される可能性があります。長い待ち時間は、サンプルの劣化になります。
  3. イメージングのための顕微鏡ステージ ホルダーにサンプルを配置します。
  4. 多次元買収 (MDA) ツールを開きます。3 つのチャネルの連続したイメージングの確立: アクセプターのみ励起と発光 (受容体チャネル)、ドナー励起とアクセプター発光 (フレット チャンネル) とドナーのみ励起発光 (ドナー チャネル)。
    注: さまざまなフレットの画像サンプルする方法があります。フレット ベース張力センサー55,56にはイメージング システムのキャリブレーションの FRET 効率を測定するための手段とペアの 3 チャネルまたは「3 キューブ」方法をお勧めします。このアプローチは、高速、簡単に非破壊、のみ標準的な蛍光顕微鏡をイメージングを必要としで、別の日やイメージング設定実験の比較を可能します。
  5. 500 ms の露光時間と 10% の中立的な密度 (ND) フィルターを使用してサンプルをスキャンします。興味の構造に明確な定位と張力センサーを表現する細胞を見つけます。
  6. 照射時間 500 ms またはイメージング チャネルごとに必要な長さと 100% の ND フィルターを選択し、フレット イメージ シーケンスを取得します。
  7. 各画像のチャンネルに興味の細胞レベル下の構造のセンサーの平均強度を推定します。低信号は、不適切な補正の見積もり、探知器、またはバック グラウンド信号の重要な貢献の非線形性により不正確な結果につながる可能性があります。おおよその指針をカメラのダイナミック レンジの 10% 以上の強度の目的 (すなわち。、16 ビット カメラ強度は 6,000 の上にする必要があります)。
    注: 同一光設定 (露光時間、フィルター、目標、およびカメラのゲインやビンなどの他の変数) が比較されますすべてのフレット実験のため使用する必要があります。これらの設定のいずれかを変更すると、フレットは、生成および/または顕微鏡のセットアップで検出された量の変化に します。FRET 効率測定、設定すると、これらの独立したが、FRET 効率を決定するために使用する校正要因ではありません。理論では、光のさまざまな設定から FRET 効率を生成する較正係数の様々 なセットをされる可能性がありますが、これは推奨されません。漂白または光毒性は誤った結果を作成する、さまざまな設定の異なることがあります。
  8. ビューの同じフィールドの 2 番目のフレット イメージ シーケンスを取得します。各画像のチャンネルのセンサーの平均強度を比較することでフレーム間の退色を推定します。退色を最小限、できれば少ない信号の 1-5% の損失よりも保管してください。
  9. 退色を最小限に抑えながら、強度を最大化する撮像パラメーターを調整します。粗調整で、集録時に使用している ND フィルターを変更します。細かい調整は、250 ms の手順で露光時間を変更します。
  10. 3.5 3.8 の手順を繰り返して、退色を最小限に抑えながら、十分な信号を得ることができます。
    注: 通常、ビンキュリン-/- MEFs ビンキュリン張力センサーの設定、1,500 ms、1,500 ミリ秒と 1,000 ms ドナー、フレット、および受容体チャネルのそれぞれ。最適な値は、照明システム、目的、フィルター セット、およびセンサー式レベルの型と異なります。

4. 選択のパラメーター FRAP イメージング

  1. 周辺を漂白または光損傷を原因とせず利益 (率 ROI) の地域の完全な漂白ようにレーザーの設定を最適化します。
    1. 10 分の 4% パラホルムアルデヒドでテンション センサーを発現する細胞の生成されたサンプルの 1 つを修正します。
      注: この最適化はタンパク質ダイナミクスに依存しないし、固定サンプルは、細胞の健康を気にせず最大の撮像時間のことができます。これはまたモバイル タンパク質による漂白、漂白しての発生率との間に発生する急速な拡散性の蛍光回復から任意の影響を避けること、漂白の効果の分離を可能にする回復を防ぐため、最初の後ブリーチ画像。
      注意: パラホルムアルデヒド ソリューション、有毒です。発煙のフードでこの手順を実行する必要があります、ソリューション制度ポリシーに従って処分すべき。
    2. PBS で 3 回サンプルをリンスし、PBS に残します。
      注意: 最も商業的利用可能なメディアをマウントの使用はイメージング54FRAP の不適切なサンプルを作って、fluorophore プロパティを影響します。理想的には、セル、すぐにイメージ化が、4 ° C で一晩残される可能性があります。長い待ち時間は、サンプルの劣化になります。
    3. イメージングのための顕微鏡ステージ ホルダーにサンプルを配置します。
    4. レーザーの設定ウィンドウを開きます。1,000 μ s と ROI 全体スキャン内の各スポットがフルパワー レーザーの 10,000 μ s を受け取ることを意味 10 パルス レーザー ドウェル時間の設定と開始します。
      注: 500 mW、515 nm レーザー漂白のため使用されました。これは、選択的に最大の効率で金星 A206K、受容体ビンキュリン張力センサーをブリーチに選ばれました。他の蛍光タンパク質を用いたフレット ベース張力検出器を使用している場合、採用する別タイプのレーザーがあります。
    5. 興味の構造に明確な定位と張力センサーを表現する細胞を見つけるし、イメージを取得します。
    6. 長方形の投資収益率のブリーチし、ROI の位置を格納する領域のアウトラインを描画します。パルス レーザー。サンプルの別のイメージをスナップします。
      注: ボックスのサイズは約全体の FA のサイズをする必要があります。ボックスのサイズが、実験の間で大幅に変化しないことに注意する必要があります。漂白のエリアは、タンパク質ダイナミクスが、拡散を受けます慎重に監視する必要があります。カドヘリン47, などの膜貫通タンパク質または徐々 に拡散する27,57蛋白質の潜在的な問題では。
    7. 強度がバック グラウンド レベルの近くに全体の投資収益率を漂白するをチェックすることによって退色の品質を確認してください。また、ROI 外漂白されていないことを確認します。
    8. ROI 外重要な漂白を引き起こすことがなく漂白 ROI 内のかなりの量を達成するために必要に応じて、レーザーの設定を調整します。粗調整のため上げるとステップ 100 μ s のと微調整のための滞留時間を下げる、上げる手順 5 パルスのパルスの数を減らします。
    9. 4.1.5-4.1.8 で投資収益率を完全に漂白してオフのターゲット退色せず最低限の設定に到達するまでの手順を繰り返します。
      注: FRAP 解析の重要な側面は、光毒性を引き起こすことがなく実質的な初期漂白値を達成します。固定サンプルで完全な漂白剤は、レーザーの設定を使用します。一般に、光子の最小数を使用して、所望の漂白レベルを達成するためにください。また、漂白プロトコルおく実験中に比較的一貫した変化はタンパク質ダイナミクス58の測定に影響を与える。
  2. 退色を最小限に抑えながら興味の蛋白質のダイナミクスを完全にキャプチャするための時間経過のパラメーターを最適化します。
    1. 生細胞イメージング、できれば加熱ステージ目的と CO2管理のため顕微鏡のセットアップを準備します。20 分間平衡することができます。
      注: イメージの細胞の健康を維持するために温度および pH 保持されなければなりませんイメージングの容器で。さまざまな加熱ステージと客観的ヒーターが 37 ° C で細胞の温度を維持することが容易に多くのメディア タイプのための pH の制御によって実現できますを加湿パス 5% CO2蠕動ポンプの使用 15 mL/分でサンプル上またはに HEPES を含むメディアをイメージングを使用する必要があります CO2コントロールが使用できない、ライブの場合大規模な pH の変化を防ぐため。
    2. イメージングのための顕微鏡ステージ ホルダーにテンション センサーを発現する細胞の生成されたサンプルの 1 つを配置します。10 分間平衡することができます。
    3. 取得 3-5 画像事前ブリーチ ブリーチ ROI、10-60 画像を撮り続けて、時間経過を設定 MDA ツールを使用して。
      注: ビンキュリン FAs で、イメージングのすべての 5 の 5 分後漂白剤 s は過度の漂白31を導入することがなく、ダイナミクスを観察するのに十分です。文学47,48,59,60ではイメージング速度のための有用な出発点と他の多くの蛋白質のための期間があります。
    4. 受容体イメージング興味の構造をイメージする、十分な信号対雑音比を維持しながらサンプルの光への露出を最小化する設定を使用します。良い出発点は、フレットの間に受容体のイメージングに必要な ND フィルターと露出時間の半分です。
    5. 興味の構造に明確な定位と張力センサーを表現するセルを見つけて、画像をはめ込みます。
    6. ブリーチし、ROI の位置を格納する場所を強調する長方形 ROI を描画します。コマ撮りを開始します。
    7. 潜在的な問題のイメージの結果セットを確認します。
      1. フレーム間の蛍光回復で (初期強度の 10% より大きい) 相当なジャンプが存在する場合は、フレーム間の時間ステップを減らします。
      2. ある場合 (初期強度の 5-10% を超える) 場合は、時間をかけて蛍光の重要なグローバルな損失後漂白剤を撮影した画像の数を減らすまたは光にサンプルの露出を減らすために画像の設定を変更します。
      3. コマ撮りの終わりによって頭打ちの蛍光回復しないに場合、は、コマ撮りの合計の長さを増やします。
    8. コマ撮りのパラメーターを調整し、4.2.5-4.2.7 蛍光回復はサンプルにグローバル フォト損傷することがなく取り込むまでの手順を繰り返します。

5 フレット FRAP データを取得します。

  1. 生細胞イメージング、できれば加熱ステージ目的と CO2管理のため顕微鏡のセットアップを準備します。20 分間平衡することができます。
    1. イメージ セルの状態を確認するには、イメージングの商工会議所で 37 ° c 温度を維持します。通過する蠕動性ポンプの使用は、15 mL/分、pH を維持するためにサンプルを 5% CO2を加湿しました。
    2. また、CO2コントロールを使用できない場合は、大規模な pH の変化を防ぐために HEPES を含むライブ イメージング メディアを使用します。
  2. MDA ツールを開き、FRET イメージングなど別のフィルター セットのパラメーターを設定します。
  3. この MDA をMDA_FRET_Dateの名前の実験のフォルダーに保存します。
  4. FRAP パラメーター、別のフィルター セット、時間経過の設定、仕訳帳などのイメージングと別の MDA 事前ブリーチ買収後レーザーをパルスに設定します。
  5. この MDA をMDA_FRAP_Dateの名前の実験のフォルダーに保存します。MDA のウィンドウを閉じます。
  6. 画面の上部のツールバーで、[選択ジャーナル |録音を開始。
  7. MDA ウィンドウを開きMDA_FRET_Date状態を読み込む取得を押します。MDA_FRAP_Dateの状態を読み込み、取得を押します。
  8. ジャーナルを選択、画面の上部にあるツールバーで、買収の終わり |録画を停止。
  9. FRETFRAP_Dateの名で実験のフォルダーにこの雑誌を保存し、簡単にアクセスできるツールバーに追加します。MDA のウィンドウを閉じます。
  10. イメージングのための顕微鏡ホルダーにテンション センサーを発現する細胞の生成されたサンプルの 1 つを配置します。10 分間平衡することができます。
  11. 取得の下の画像の取得を使用してサンプルを移動 |取得興味のセルを識別するために時間と ND フィルターの最小限の露出で。
  12. デバイスへの移動によって連続的なオート フォーカスを設定 |フォーカス。手動で正しい画像平面に到達するまで、サンプルに焦点を当てます。
  13. 継続的なフォーカスの設定] をクリックし、調整するシステムを待機連続的なフォーカスを開始をクリックします。
    注: これは必須ではありませんが、サンプルがアウト フォーカスを漂うを防ぐため FRAP 回復曲線の品質が大幅に向上します。
  14. 興味の構造に明確な定位と張力センサーを表現するセルを見つけて、画像をはめ込みます。
  15. ブリーチする場所を強調する長方形 ROI を描画します。投資収益率の場所を格納します。
  16. FRETFRAP_Dateジャーナルは、コマ撮りの FRAP の初期化に続いてフレット画像の取得が開始されますを初期化します。
  17. 10-15 画像セットが得られるまで、手順 5.14 5.16.
    注: 同じセルに測定を繰り返すことができません。退色が発生すると、フレットのデータは信頼できません。

6. フレット FRAP のデータを分析します。

  1. 選択したソフトウェアを使用してフレットのイメージを分析します。
    注: イメージを作成し、量的に表わすフレット61、62レシオ メトリック フレットとフレット インデックス34,35を含むいくつかの方法があります。ただし、フレット FRAP データの解釈のための FRET 効率55,63の見積もりを使用することを強くお勧めします。このトピックのさらなる探鉱のための議論を参照してください。鋭敏化の排出と FRET 効率の計算、カスタム ソフトウェア、https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public ホフマン研究室から利用できます。
  2. 漂白されたそれぞれの細胞内構造に関連するパラメーターを定量化します。これは平均フレット インデックス/効率性と平均初期受容体強度 (濃度に比例) を含める必要がありますが、また ROI サイズなどの物理パラメーターを含めることができます。
  3. 選択したソフトウェアを使用して縛る画像を分析します。
    注意: FRAP26,27,28,29を量的にいくつかの方法があります。実験的で重要な課題には、イメージング、バック グラウンド強度と焦点接着斑などの非常に動的な細胞内構造の転流の変化後の漂白剤の中に漂白のため会計が含まれます。修正と背景の照明のばらつきを漂白は、画像の非漂白および非蛍光性地域の分析から実行できます。非常に動的な細胞内構造特に過度な成長や分解ダイナミクスを示すものは標準 FRAP 解析と互換性がないと分析する必要があります。さらに、さまざまなデータを正規化する方法があります。提供されているガイドラインは、最も簡単な分析です。
  4. 漂白効果の回復データを修正し、強度をあらかじめブリーチを正規化します。回復と次方程式28,34によると携帯電話一部の半分の時間を定量化します。
    オス-メス - (MF - Ro) e-kt
    最初の回復は、 MFがモバイルの分数、 Ro k回収率。回復の半分の時間は、によって決定されます。
    Τ1/2 = ln 2/k。
    注意: これら解析64として ImageJ プラグインの様々 なを完了するための公に利用可能なソフトウェア パッケージのさまざまながあります。カスタム ソフトウェアは、ホフマン研究所 https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public から可能です。拡散影響を与える複数のタイム スケールは、回復の見かけ、興味の蛋白質のダイナミクス、あるいは標準漂白ジオメトリが使用される状況のより多くの分析を使用してください。

7. フレット FRAP データを解釈します。

  1. 各投資収益率などの関連情報をコンパイル: フレット インデックス/効率、アクセプター強度、FRAP ハーフタイム、FRAP モバイル分数。
    メモ: フレット インデックスまたは効率 ROI 内タンパク質全体の平均負荷を決定する使用されます。受容体強度は、蛋白質の局所濃度を測定します。回復の半分の時間は、蛋白質の原動力の指標です。小さい半分の時間より急速な売り上げ高を示します。FRAP モバイル分数は、積極的にめくり ROI 内の蛋白質の量を測定します。大きいモバイル分数は、ROI 内蛋白質の大きい割合が裏返しになっていることを示します。
  2. ローカル濃度タンパク質離職率と量に及ぼす影響を調べるため、初期受容体強度に対して FRAP 半分時間と携帯電話一部をプロットします。
  3. タンパク質の離職率と量に及ぼす蛋白質負荷をプローブするには、フレット インデックス/効率に対して FRAP 半分時間と携帯電話一部をプロットします。
    注: によってタンパク質や構造、それことも蛋白質負荷または売り上げ高の構造体のサイズや、偏心などの物理的なパラメーターの影響を調べるは興味深い。

結果

フレット FRAP は、2 つの蛍光技術の組み合わせから成っている、フレットと縛る。我々 は蛋白質負荷の影響に焦点を当てて、フレット ベース張力センサー34,46を使用しました。これらのセンサーはセンシング モジュール mTFP1 と flagelliform リンカー (図 1 a) によって接続されている VenusA206K などの 2 つ?...

ディスカッション

フレット FRAP メソッドを力感受性タンパク質ダイナミクス、生きた細胞の内部を直接調べることは困難されているプロパティの直接計測できます。分子の負荷をタンパク質ダイナミクスの感度力送信機またはトランスデューサーとして蛋白質の機能に不可欠です。読み込みが内部的に生成された両方の伝送に必要なして生化学的検出信号にそれらの力の変換、メカノトランスダクションと呼?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、アメリカ心臓協会 (16GRNT30930019)、国立衛生研究所 (R01GM121739-01) ブレントン ホフマン博士と国民に授与されるからの補助金だけでなく、国立科学財団のキャリア賞 (NSF-CMMI-14-54257) によって支えられました。科学財団大学院研究奨学金キャサリン ・ ローゼンバーグに授与します。内容は著者の責任と NSF や NIH の公式見解を必ずしも表さない。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher25300062
16% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences30525-89-4
60x Objective NA1.35OlympusUPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)Gibco15240-062
Automated StagePrior ScientificH117EIX3
Custom Dichroic MirrorChroma Technology CorpT450/514rpc
Custom mTFP1 Emission FilterChroma Technology CorpET485/20m
Custom mTFP1 Excitation FilterChroma Technology CorpET450/30x
Custom Venus Excitation FilterChroma Technology CorpET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization MediumSapphireMC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma AldrichD5796with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine SerumHyCloneSH30396.03
Fibronectin, HumanCorning47743-654
FRAPPA Calibration SlideAndorprovided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm LaserAndor
Glass-bottomed Fluoro DishesWorld Precision InstrumentsFD35
HEK293-T CellsATCCCRL-3216
Hexadimethrine Bromide, PolybreneSigma AldrichH9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigma AldrichD6429
Inverted Fluorescent MicroscopeOlympusIX83
JMP Pro SoftwareSAS
Lambda 10-3 Motorized Filter WheelsSutter InstrumentsLB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon BulbSutter InstrumentsLS/OF30
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027
MATLAB SoftwareMathworks
MEM Non-Essential Amino AcidsThermo Fisher11140050
MetaMorph for OlympusOlympus
Micro-Humidification SystemBioptechs130708
MoFlo Astrios EQ Cell SorterBeckman CoulterB25982
Objective Heater MediumBioptechs150819-13
OptiMEMThermo Fisher31985070
Phosphate Buffered SalineSigma AldrichD8537
pMD2.G Envelope PlasmidAddgene12259
pRRL Vectorgift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging PlasmidAddgene12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 CameraHamamatsu PhotonicsC11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF CentrifugeThermo Fisher75004505
Stable Z Stage WarmerBioptechs403-1926
Venus Emission FilterSemrockFF01-571/72

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