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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de ressonância Förster, sensores de tensão baseados na transferência de energia para medir proteína carga e fluorescência recuperação após fotobranqueamento para medir a dinâmica da proteína, permitindo a medição de força-sensível dinâmica da proteína dentro de células vivas.

Resumo

Células detetam e respondem às pistas físicas em seu ambiente, convertendo estímulos mecânicos em sinais bioquimicamente detectável em um processo chamado mechanotransduction. Um passo crucial no mechanotransduction é a transmissão de forças entre os ambientes internos e externos. Para transmitir forças, deve haver um enlace físico sustentado e contínuo, criado por uma série de interações da proteína-proteína. Para uma interação da proteína-proteína dada, carga mecânica ou não pode ter nenhum efeito sobre a interação, levar a uma dissociação mais rápida da interação, ou mesmo estabiliza a interação. Compreensão molecular como carga dita rotatividade de proteína em pilhas vivas pode fornecer informações valiosas sobre o estado mecânico de uma proteína, por sua vez, elucidar seu papel na mechanotransduction. Técnicas existentes para medição dinâmica força-sensível da proteína ou faltam de medições directas da carga de proteína ou dependem as medições realizadas fora do contexto celular. Aqui, descrevemos um protocolo para a recuperação de fluorescência-transferência de energia de ressonância de Förster depois fotobranqueamento (FRET-FRAP) técnica, que permite a medição da dinâmica de força-sensível da proteína dentro de células vivas. Esta técnica é potencialmente aplicável a qualquer sensor de tensão baseado no traste, facilitando o estudo da dinâmica de proteínas sensíveis à força em uma variedade de estruturas subcelulares e em diferentes tipos de células.

Introdução

O ambiente extracelular é uma rica fonte de sinais bioquímicos e físicos que ditar o comportamento da célula. Em particular, a natureza física do microambiente pode mediar principais funções celulares, incluindo o crescimento celular, migração e diferenciação1,2,3,4. Desregulação da mecânica do microambiente é um componente crítico para muitas doenças que ainda não dispõem de tratamentos adequados, tais como câncer5, aterosclerose6e fibrose7. Uma compreensão completa de como as células convertem a estímulos físicos em sinais bioquimicamente detectável, um processo denominado mechanotransduction, requer a elucidação dos mecanismos moleculares mediando a transmissão de força, tanto dentro e fora das células e dentro de várias estruturas subcelulares.

Dentro de estruturas subcelulares, proteínas estão constantemente ligados; vinculação e desvinculação baseado na força de suas interações com parceiros8de vinculação. Para as forças ser transmitida com sucesso através de uma distância física, devem haver uma cadeia ininterrupta de interações proteína-proteína, significa que o volume de negócios de uma proteína deve ser lenta o suficiente para sustentar e transmitir a força de sua vinculação parceiro9. Enquanto as interações da proteína-proteína geralmente consistem de vários não-covalentes entre os domínios da proteína, a interação é muitas vezes conceituada como um estado ligado que pode a transição para um estado desacoplado sob diferentes condições10, 11. para uma interação da proteína-proteína dada, é possível que a força pode ter n efeito sobre o tempo de vida da interação, conhecido como um vínculo"ideal", reduzir o tempo de vida da interação, conhecido como uma "ligação de deslizamento" ou aumentar o tempo de vida da interação , conhecido como um "laço de captura"10. Assim, há uma intrincada relação entre carga de proteína e proteína dinâmica, que nos referimos como sensíveis à força dinâmica.

Para compreender o efeito da carga sobre a dinâmica do vínculo, uma série de experimentos altamente informativos foram realizada no nível único-molécula. Usando proteínas isoladas, ou fragmentos de proteínas e de técnicas de manipulação como uma pinça magnética, pinça óptica e microscopia de força atômica, estes estudos têm demonstrado as interações da proteína-proteína de força-sensível para vários relevantes proteínas11,12. Ambas as integrinas13 caderinas e14, que são proteínas transmembrana importantes para a formação de interações célula-matriz e célula-célula, respectivamente, demonstraram alterações na dinâmica devido ao carregar. Dentro da célula, vinculina é recrutada para ambos talin15 e α-catenina16 de forma dependente da força e pode formar um vínculo de capturas com actina17, indicando um papel crucial para vinculina aderências focais (FAs) e entroncamentos adherens (AJs ) sob carga. Único-molécula estudos permitem o isolamento de interações proteína-proteína específica e produzem resultados ambíguos, mas eles não representam a complexidade do ambiente celular.

Experimentos de Marco demonstraram que várias estruturas subcelulares, incluindo FAs e AJs, são mechanosensitive e apresentam montagem reforçada em resposta às cargas geradas internamente ou externamente aplicado18,19, 20,21,22. Além disso, vários modelos teóricos sugeriram que mechanosensitive montagem poderia ser movida pela força-sensível proteína dinâmica23,24,25. Para examinar essas dinâmicas de força-sensível dentro de células vivas, foram tomadas algumas abordagens indiretas. FRAP e técnicas relacionadas fornecem uma metodologia relativamente simples para medir a dinâmica da proteína em células26,,27,28,29. No entanto, a medição da carga de proteína tem sido mais limitada. Uma abordagem típica é comparar a dinâmica da proteína nas células com e sem a exposição a um inibidor do citoesqueleto, usado para reduzir o total celular contratilidade8,30,31. Conceitualmente, esta é uma comparação entre uma carga alta e baixa carga de estado. No entanto, há não há quantificação da carga em toda a proteína em nenhum dos Estados, e pode haver efeitos bioquímicos não intencionais do inibidor, tal a perda dos sítios de ligação chave ao longo de um filamento de F-Actina. Uma outra abordagem, específica para FAs, tem sido para medir a força total de esforço sobre o substrato pela FA usando microscopia de força de tração para aproximar a carga molecular e examinar a relação com a dinâmica de uma única proteína dentro da FA32. Enquanto essa abordagem permite a quantificação da força total, ele não fornece informação molecular específica. FAs são constituídos por mais de 200 diferentes proteínas, muitas das quais podem suportar carga33. Assim, medindo a força total de saída de um FA potencialmente obscurece a possibilidade de vários caminhos de transmissão de força e não confiável fornece uma medida da carga em uma proteína específica.

Ao contrário de abordagens anteriores em mechanobiology, o advento dos sensores de tensão baseado em FRET permite direto34,35,36células de medição de cargas vivida por proteínas específicas dentro da vida. Aqui, apresentamos um protocolo que combina sensores de tensão baseado em FRET com medida FRAP-baseado da dinâmica da proteína. Nos referimos a esta técnica como FRET-FRAP. Esta abordagem permite a medição simultânea de carga de proteína e proteína dinâmica, permitindo assim a avaliação da dinâmica força-sensível proteína em células vivas (Figura 1). Já, a FRET-FRAP técnica foi aplicada para o estudo da dinâmica da mecânica vinculador proteína vinculina37força-sensível. Sensores de tensão foram desenvolvidos por inúmeras proteínas que são relevantes em uma variedade de estruturas subcelulares. Por exemplo, os sensores foram desenvolvidos para vinculina34 e talin38,39 no FAs, as caderinas e catenins em AJs40,41,42, nesprin no LINC nuclear complexo 43, α-actinin44 e FBLIM136 no citoesqueleto e MUC-1 nos glicocálix45, entre outros46. Da mesma forma, FRAP é que uma técnica comumente utilizada tem sido utilizada em proteínas mechanosensitive dentro as aderências focais8,31, aderente junções47, actina córtex26e núcleo48. Seguindo em frente, que a técnica de FRET-FRAP deve ser amplamente aplicável a qualquer destes sensores existente ou recém desenvolvido sensores, permitindo as medições de força-sensível dinâmica em uma ampla variedade de contextos e estruturas subcelulares. Nesse sentido, nós fornecemos um protocolo detalhado, generalizado para implementar a técnica FRET-FRAP aplicável nestes sistemas diferentes. Esperemos que isto irá permitir uma grande variedade de experimentos para elucidar o papel de várias proteínas mechanosensitive na regulação da transmissão de força e na mediação do comportamento celular.

Protocolo

1. gerar amostras para a imagem latente

  1. Construção de sensor tensão estàvel expressa no tipo de célula desejada.
    1. Clone construção de sensor de tensão em vetor pRRL ou outro plasmídeo de expressão viral.
      Nota: Várias ferramentas de clonagem moleculares diferentes estão disponíveis para realizar essa etapa, incluindo o uso de enzimas de restrição, se sobrepõem a extensão e montagem Gibson35. O vetor pRRL é usado na transdução viral lenti e permite um elevado grau de produção de proteínas através da utilização do promotor humana citomegalovírus (CMV). Diferentes vetores podem ser necessários para um determinado contexto. Por exemplo, o promotor CMV é silenciado em alguns tipos de célula49. Além disso, somente sensores baseados em FRET contendo proteína fluorescente que falta a sequência forte homologia, como mTFP1 e A206K de Venus, pode ser usada para criar linhas de célula estável. Sensores que contém proteína fluorescente ciana e amarela fluorescente proteína provavelmente será sujeito a recombinação homóloga50.
    2. Gere lentivirus em células de rim embrionário humano (HEK) 293T usando psPax2 e plasmídeos de empacotamento de pMD2.G usando de métodos de produção de vírus padrão51.
      Cuidado: Lentivirus só devem ser manuseadas por pessoal devidamente treinado em um ambiente de laboratório de nível 2 de biossegurança.
      Nota: Esta combinação de células e plasmídeos de empacotamento é apropriada para uso com pRRL. Outros sistemas podem ser exigidos com outros vetores.
    3. Transduce desejadas células com vírus usando protocolos de transdução padrão52 e usar citometria de fluxo para classificar células53 selecionando uma população homogénea, expressando cada construção em níveis endógenos aproximadamente37. Após a seleção de células, experimentos podem ser realizados imediatamente, ou células podem ser criogenicamente congeladas para uso posterior. Não exceda 2 ciclos de congelamento e descongelamento de uma linha determinada célula estável.
      Nota: O uso de linhas de células deficientes na proteína a ser estudado (por exemplo, MEFs vinculina- / - para o uso com o sensor de tensão vinculina) aumentará o sinal para ruído proporção em experimentos de traste, bem como limitar artefatos sobre-expressão. Tais linhas de fibroblasto embrionário (MEF) estável do mouse podem ser usadas para aproximadamente 15 passagens antes de perda significativa de expressão ou degradação dos sensores é aparente. Se viral baseado em métodos não são desejados, uma infinidade de reagentes comerciais pode ser usada de acordo com o protocolo do fabricante para transitoriamente, transfect uma variedade de tipos de células com sensores de tensão em um plasmídeo adequado, tais como pcDNA3.1. Expressão ideal será 24-48 h, seguindo do transfection.
  2. Prepare substratos para semeadura de célula.
    1. Adquira 4, pratos de 35mm com fundo de vidro.
    2. Trabalhando em uma capa de cultura celular, em um tubo de 15 mL canônico, faça 4 mL de 10 µ g/mL de fibronectina em tampão fosfato (PBS) fisiológico usando PBS estéril do capuz de cultura de células. Inverta suavemente o tubo de uma vez para misturar e deixe a solução descansar por 5 minutos do bairro de cultura de células.
      Nota: A concentração ou o tipo de proteína de ECM pode ter de ser ajustado para outros tipos de células. As condições fornecidas são apropriadas para MEFs.
    3. Pipete 1 mL da solução de fibronectina em cada prato com fundo de vidro.
    4. Deixe a solução de fibronectina sobre os pratos por 1h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
    5. Aspirar a solução de fibronectina, lave uma vez com PBS e adicione 1 mL de PBS.
  3. As células para substratos preparados de semente.
    1. Comece com as células de interesse a uma percentagem de confluência apropriada para subcultura em um prato de cultura de 6 cm.
      Nota: Diferentes tipos de células exigirá condições de cultura celular distinta e protocolos de subcultura. Esta seção fornece diretrizes apropriadas para MEFs. Normalmente, MEFs são cultivadas para a confluência de 85% antes de subcultura.
    2. Trabalhando dentro de um capuz de cultura celular, enxágue as células uma vez com 3 mL de PBS. Adicionar 1 mL de 0.05% Trypsin-EDTA e incubar durante 5 min a 37 ° C.
    3. Adicionar 3 mL de mídia completa para o prato de 6cm, recolher as pilhas e coloque em um tubo cônico de 15 mL.
      Nota: Composição para mídia completa dependerá do tipo de célula a ser usado. Por MEFs, mídia completa é muitas vezes definida como meio a glicose alta Dulbecco Eagle modificado com 10% de soro bovino fetal, 1% antibiótico-antimicótico (contendo anfotericina B, penicilina e estreptomicina) e uma solução de aminoácidos não-essenciais (timina) 1%.
    4. Gire as células para baixo a 1000 x g por 5 min.
    5. Aspirar a mídia e ressuspender as células em 1 mL de mídia completa.
    6. Remova o PBS de pratos de vidro revestido de fibronectina. Contar as células e 30.000 células para cada prato de vidro fibronectina revestido com a mídia adequada e completa para um volume final de 1,5 mL de semente.
      Nota: Esta densidade celular é apropriada para MEFs e conduzirá a uma população de células que não estão tocando, mas não excessivamente esparsas. O número exato de célula talvez precise ser ajustado para outros tipos de célula ou outra câmara de imagens.
    7. Permitir que as células a se espalhar para 4h após a semeadura. A 2 h de propagação, aspirar a mídia de crescimento e lave uma vez com a mídia, deixando 1,5 mL de mídia de imagem de imagem.
      Nota: Este tempo de propagação é apropriado para MEFs, mas talvez precise ser alterado para outras células. No entanto, períodos de incubação de mais de 6-8 h levará à deposição significativa de proteína de ECM do soro na mídia completa. Mídia de imagem deve conter as mesmas adições como mídia completa mas deve ser opticamente clara e não conter quaisquer compostos que fluorescem em canais de imagem, tais como flavinas ou saciar a fluorescência, como o vermelho de fenol. Uma mídia de imagem geralmente útil é DMEM-gfp viver célula visualização mídia suplementada com solução de timina FBS e 1% de 10%. Se o fundo autofluorescência é inaceitavelmente elevada, a quantidade de soro pode ser reduzida. Se não for possível uma mudança de mídia após o chapeamento inicial, as células podem ser resuspended diretamente em meios suplementados com um inibidor de tripsina por imagens.

2. configurar microscópio para a imagem latente

  1. Ligue o microscópio.
    1. Ligue a lâmpada de arco primeiro.
      Nota: Uma lâmpada de arco irá lançar um pulso eletromagnético, que pode danificar outros equipamentos que já vem.
    2. Ligue o filtro roda controller, controlador de palco automatizado, interface do microscópio-computador e câmera.
    3. Ligue o FRAP laser e laser controladores de posição.
      Cuidado: Lasers de alta potência podem ser prejudicial para os olhos se visualizado diretamente. Recomenda-se configurar o sistema de microscópio para bloquear a excitação do laser de ser dirigido para as peças do olho, que podem ser feitas movendo-se um espelho para o caminho do feixe FRAP durante o branqueamento para refletir o laser em direção a amostra e prevenir a transmissão para a ocular.
    4. Ligue o computador e o software de controle aberto microscópio.
    5. Permitir que 15 min para a lâmpada de arco e FRAP laser para aquecer.
  2. Calibre o laser FRAP.
    1. Abra a janela de configuração do laser. Definir Configuração de iluminação (durante o pulso) para as configurações de iluminação FRAP apropriadas para exposição do laser para a amostra. Definir a Configuração de iluminação (durante a imagem latente) para as configurações de iluminação apropriado para apenas o fluoróforo aceitador de imagem.
    2. Selecione o objetivo de calibrar na Configuração de sistema de coordenadas. Desmarque a opção Manualmente clique em pontos de calibração e verificar exibir imagens durante a calibração.
    3. Defina o tempo de interrupção para 10.000 µs e o número de pulsos de 100.
    4. Coloque o slide de calibração, feito de brometo de etídio selado entre uma lâmina de vidro e uma lamela, no adaptador de estágio com o lamela de lado para baixo.
      Atenção: O brometo de etídio é um agente mutagénico e deve ser manuseado usando luvas. Se o slide estiver comprometido, descarte de acordo com as diretrizes da instituição.
    5. Use as configurações de iluminação do aceitador para concentrar-se na superfície da lâmina, identificável como o plano focal com o sinal mais brilhante. Pequenos defeitos no revestimento será visíveis para auxiliar em foco.
    6. Deslocar o carro para uma área com fluorescência uniforme em todo o plano de imagem.
    7. Clique em criar a configuração. O software irá inicializar o processo de calibração, branqueamento e automaticamente detectar a posição do ponto de celulose branqueada.
    8. Garantir uma calibração bem sucedida avaliando a imagem final, que será uma grade de 3x3 de celulose branqueados pontos que devem ser distribuídos uniformemente e em foco. Salve a imagem de calibração para referência futura.
    9. Retirar a lâmina de calibração e armazenar com segurança. Calibração deve ser realizada antes do início de cada experimento, mas não precisa ser executada entre as amostras.

3. escolher parâmetros para a imagem latente de FRET

  1. Que uma das amostras de células expressando o sensor de tensão com paraformaldeído 4% durante 10 min. solução de paraformaldeído geradas deve ser metanol livre, muitas vezes referida como EM-grade, para evitar a desnaturação das proteínas fluorescentes. Coloque em PBS após a fixação.
    Cuidado: Paraformaldehyde soluções são tóxicas. Esta etapa deve ser executada em uma coifa e a solução deve ser eliminada segundo políticas institucionais.
    Nota: Essa otimização não depende de dinâmica da proteína, e uma amostra fixa permite tempo máximo de imagens sem se preocupar com a saúde da célula.
  2. Enxagúe a amostra três vezes com PBS e deixe em PBS.
    Nota: Uso de meios de montagem mais comercialmente disponíveis afetará o fluoróforo Propriedades, tornando a amostra inadequada para FRET imagem54. Idealmente, as células vão ser fotografadas imediatamente, mas podem ser deixadas durante a noite a 4 ° C. Tempos de espera mais tempo irão resultar em deterioração da amostra.
  3. Coloque a amostra no suporte de palco do microscópio para a imagem latente.
  4. Abra a ferramenta de aquisição de multi-dimensional (MDA). Estabelecer uma imagem sequencial de três canais: excitação única aceitador e emissão (canal aceitador), excitação de doador e aceitador de emissão (FRET canal) e excitação único doador e emissão (canal de doador).
    Nota: Há uma variedade de maneiras para amostras de imagem FRET. O método de três canais ou "três-cubo" da imagem latente emparelhado com meios de calibrar o sistema para medir a eficiência FRET é recomendado para sensores de tensão baseado em FRET55,56. Esta abordagem é rápido, simples, não-destrutiva, requer apenas uma fluorescência padrão de imagem de microscópio e permite a comparação de experimentos em dias diferentes e configurações de imagem.
  5. Examinar a amostra usando o tempo de exposição de 500 ms e um filtro de densidade neutra (ND) de 10%. Encontre uma célula expressando o sensor de tensão com a clara localização para uma estrutura de interesse.
  6. Selecione o tempo de exposição de 500 ms ou o comprimento desejado para cada canal de imagem e um filtro ND de 100% e adquirir uma sequência de imagens de traste.
  7. Estime a intensidade média do sensor em estruturas subcelulares de interesse em cada canal da imagem latente. Sinais de baixa podem levar a resultados imprecisos devido a estimativas de correção inadequada, não-linearidades em detectores ou contribuição significativa dos sinais de fundo. Uma orientação aproximada é de apontar para as intensidades acima de 10% do intervalo dinâmico da câmera (i. e., para uma câmera de 16 bits, intensidades devem estar acima de 6.000).
    Nota: Configurações ópticas idênticas (tempos de exposição, filtros, objectivos e outras variáveis tais como o ganho da câmera ou binning) devem ser usadas para todos os experimentos de traste que serão comparados. Alterar qualquer uma dessas configurações, conduzirá a uma alteração no montante de traste que é gerada ou detectado na confi guração do microscopia. FRET medições de eficiência são independentes desses configuração, mas não são os fatores de calibração utilizados para determinar a eficiência de traste. Em teoria, vários conjuntos de fatores de calibração poderiam ser usados para gerar eficiências FRET entre diferentes configurações de ópticas, mas isso não é recomendado. Branqueamento ou fototoxicidade pode ser diferente entre os vários ajustes, criando resultados espúrios.
  8. Adquira uma segunda sequência de imagens de traste do mesmo campo de visão. Estimativa fotobranqueamento entre quadros, comparando a intensidade média do sensor em cada canal da imagem latente. Fotobranqueamento deve ser mantido a um mínimo, de preferência inferior a 15% de perda de sinal.
  9. Ajuste os parâmetros de imagem para maximizar a intensidade minimizando fotobranqueamento. Para ajustes grosseiros, mude o filtro ND, sendo usado durante a aquisição. Para ajustes mais finos, altere o tempo de exposição em etapas de 250 ms.
  10. Repita as etapas de 3.5 – 3.8 até sinal adequado pode ser obtido minimizando fotobranqueamento.
    Nota: Normalmente, as configurações para o sensor de tensão vinculina vinculina- / - MEFs são 1.500 ms, ms 1.500 e 1.000 ms para os doador, FRET e aceitador canais respectivamente. Os valores óptimos variará com o tipo de sistema de iluminação, objetivo, conjuntos de filtros e nível de expressão do sensor.

4. escolha de parâmetros para FRAP Imaging

  1. Otimize as configurações de laser para garantir a completa clareamento da região de interesse (ROI) sem branqueamento a área circundante ou causando Fotodano.
    1. Fixe uma das amostras geradas das células expressando o sensor de tensão com paraformaldeído 4% por 10 min.
      Nota: Essa otimização não depende de dinâmica da proteína, e uma amostra fixa permite tempo máximo de imagens sem se preocupar com a saúde da célula. Isto impedirá também a recuperação de branqueamento por proteínas móveis, permitindo o isolamento do efeito de clareamento, evitando os efeitos da recuperação de fluorescência rápida, mediada por difusão, ocorrendo entre a incidência de branqueamento e levando o primeira imagem do post-alvejante.
      Cuidado: Paraformaldehyde soluções são tóxicas. Esta etapa deve ser executada em uma coifa e a solução deve ser eliminada segundo políticas institucionais.
    2. Enxagúe a amostra 3 vezes com PBS e deixe em PBS.
      Nota: O uso dos meios de montagem mais comercialmente disponíveis afetará fluoróforo Propriedades, tornando a amostra inadequada para FRAP imagem54. Idealmente, as células vão ser fotografadas imediatamente, mas podem ser deixadas durante a noite a 4 ° C. Tempos de espera mais tempo irão resultar em deterioração da amostra.
    3. Coloque a amostra no suporte de palco do microscópio para a imagem latente.
    4. Abra a janela de configuração do laser. Começar com a criação de um tempo de interrupção do laser de 10 pulsos, significando que cada ponto no scan do outro lado o ROI receberá 10.000 µs de laser de energia plena e 1.000 µs
      Nota: Um 500 mW, 515 nm do laser foi utilizado para o branqueamento. Isto foi escolhido para branquear seletivamente Venus A206K, o aceitador em vinculina sensor de tensão, com máxima eficiência. Se os sensores de tensão baseado em FRET com outras proteínas fluorescentes são usados, outro tipo de laser pode ter que ser empregado.
    5. Encontrar uma célula expressando o sensor de tensão com a clara localização para uma estrutura de interesse e adquirir uma imagem.
    6. Desenha um Retangular ROI delineando a área para branquear e armazenar a localização de ROI. O laser de pulso. Encaixe a outra imagem da amostra.
      Nota: O tamanho da caixa deve ser aproximadamente o tamanho da FA toda. Cuidado deve ser tomado que o tamanho da caixa não varia drasticamente através de experimentos. A área branqueada deve ser cuidadosamente monitorizada em proteínas cuja dinâmica é afetada por difusão. Esta é uma preocupação potencial em proteínas transmembrana, tais como as caderinas47, ou proteínas que difundem lentamente27,57.
    7. Verifica a qualidade de fotobranqueamento, verificando que o ROI inteiro é descorado, tal que a intensidade é perto de níveis de plano de fundo. Além disso, certifique-se de não há nenhum clareamento fora o ROI.
    8. Ajuste as configurações do laser conforme necessário para atingir uma quantidade significativa de branqueamento dentro o ROI sem induzir clareamento significativo fora o ROI. Para ajustes grosseiros, aumentar e diminuir o tempo de interrupção em passos de 100 µs e para ajustes finos, aumentar e diminuir o número de pulsos em passos de 5 pulsos.
    9. Repita as etapas 4.1.5 – 4.1.8 até atingir as configurações mínimas a que o ROI é totalmente branqueado sem fotobranqueamento fora do alvo.
      Nota: Alcançar um valor substancial de branqueamento inicial sem induzir fototoxicidade é um aspecto-chave de análise FRAP. Use as configurações do laser que resultam em um alvejante completo nas amostras fixas. Em geral, o número mínimo de fótons deve ser usado para atingir o nível desejado de branqueamento. Além disso, o protocolo clareador deve ser mantido relativamente consistente durante as experiências, como alterações podem afetar as medições de proteína dinâmica58.
  2. Otimize os parâmetros de lapso de tempo para capturar totalmente a dinâmica da proteína de interesse, minimizando o fotobranqueamento.
    1. Prepare a afinação de microscopia para a imagem latente de células vivas, de preferência com uma fase aquecida e objectivo, bem como controle de CO2 . Permitem equilibrar por 20 min.
      Nota: Para manter a saúde das células de imagem, temperatura e pH devem ser mantidos no vaso de imagem. Uma variedade de fases aquecidas e aquecedores objetivas prontamente pode manter a temperatura da célula a 37 ° C. O controle do pH para muitos tipos de mídia pode ser realizado através da utilização de uma bomba peristáltica para pass humedecida 5% CO2 da amostra em 15 mL/min. como alternativa, se CO2 controle estiver indisponível, ao vivo de imagens mídia contendo HEPES devem ser usado para impedir alterações de pH grande.
    2. Lugar dentre as amostras geradas das células expressando o sensor de tensão no suporte de palco do microscópio para a imagem latente. Permitem equilibrar por 10 min.
    3. Usando a ferramenta MDA, configure um lapso de tempo para adquirir imagens pre-bleach, bleach o ROI e continuam a tomar 10-60 imagens de 3-5.
      Nota: Para vinculina no FAs, imagem a cada 5 s para pós-lixívia 5 min é suficiente para observar a dinâmica sem introduzir clareamento excessivo31. Pontos de partida útil para taxa de geração de imagens e duração para muitas outras proteínas podem ser encontrados na literatura47,,48,59,60.
    4. Use o aceitador de imagem configurações que minimizam a exposição da amostra à luz, mantendo uma relação sinal / ruído suficiente, para a estrutura de interesse da imagem. Um bom ponto de partida é a metade do ND filtro e exposição tempo necessário para a imagem latente do aceitador durante FRET.
    5. Encontrar uma célula expressando o sensor de tensão com a clara localização para uma estrutura de interesse e ajustar uma imagem.
    6. Desenha um Retangular ROI para destacar onde branquear e armazenar a localização de ROI. Inicie o lapso de tempo.
    7. Examine o conjunto resultante de imagens para possíveis problemas.
      1. Se não houver substanciais saltos (maiores que 10% da intensidade inicial) na recuperação de fluorescência entre quadros, reduza o tempo-passo entre os quadros.
      2. Se houver uma perda global significativa de fluorescência ao longo do tempo (maior que 5-10% da intensidade inicial), reduzir o número de imagens tiradas pós-água sanitária e/ou alterar as configurações de imagem para reduzir a exposição da amostra à luz.
      3. Se a recuperação de fluorescência não estacionou no final do lapso de tempo, aumente o comprimento total do lapso de tempo.
    8. Ajustar os parâmetros de lapso de tempo da mesma forma e repita etapas 4.2.5 – 4.2.7 até a recuperação de fluorescência é capturada adequadamente sem foto-dano global para a amostra.

5. adquirir dados FRET-FRAP

  1. Prepare a afinação de microscopia para a imagem latente de células vivas, de preferência com uma fase aquecida e objectivo, bem como controle de CO2 . Permitem equilibrar por 20 min.
    1. Para garantir a saúde das células de imagem, manter a temperatura a 37 ° C, na câmara de imagens. Uso uma bomba peristáltica para passar humedecidas 5% CO2 da amostra a 15 mL/min para manter o pH.
    2. Alternativamente, se CO2 controle não estiver disponível, use mídia de imagens ao vivo, contendo HEPES para impedir alterações de pH grande.
  2. Abra a ferramenta MDA e configurar com FRET parâmetros, incluindo os conjuntos de diferentes filtros de imagem.
  3. Salve este MDA experimental na pasta com o nome de MDA_FRET_Date.
  4. Configure outro MDA com FRAP parâmetros, incluindo os conjuntos de filtro diferente, as configurações de lapso de tempo e o diário de imagem para o laser de pulso após aquisição pré-alvejante.
  5. Salve este MDA experimental na pasta com o nome de MDA_FRAP_Date. Feche a janela do MDA.
  6. Na barra de ferramentas na parte superior da tela, selecione Journal | Iniciar gravação.
  7. Abra a janela MDA, carregar o estado de MDA_FRET_Date e clique em Acquire. Então carregar o estado de MDA_FRAP_Date e clique em Acquire.
  8. No final da aquisição, na barra de ferramentas na parte superior da tela, selecione Journal | Parar a gravação de.
  9. Salvar este jornal experimental na pasta com o nome de FRETFRAP_Date e adicioná-lo para uma barra de ferramentas para facilitar o acesso. Feche a janela do MDA.
  10. Lugar dentre as amostras geradas das células expressando o sensor de tensão no suporte do microscópio para a imagem latente. Permitem equilibrar por 10 min.
  11. Navegue a amostra usando a aquisição de imagem sob adquirir | Adquirir com exposição mínima de tempo e ND filtram para identificar as células de interesse.
  12. Definir o autofocus contínuo navegando para dispositivos | Foco. Manualmente o foco sobre a amostra até atingir o avião de imagem correto.
  13. Clique em Definir foco contínuo, aguarde o sistema ajustar e clique em Iniciar o foco contínuo.
    Nota: Isto não é necessário, mas melhora significativamente a qualidade das curvas de recuperação FRAP porque impede que a amostra à deriva fora de foco.
  14. Encontrar uma célula expressando o sensor de tensão com a clara localização para uma estrutura de interesse e ajustar uma imagem.
  15. Desenha um Retangular ROI para destacar onde a lixívia. Armazene a localização de ROI.
  16. Inicialize o jornal FRETFRAP_Date , que começará a aquisição de imagens FRET seguido a inicialização de lapso de tempo o FRAP.
  17. Repita as etapas 5.14-5.16 até 10-15 conjuntos de imagens são adquiridos.
    Nota: A medida não pode ser repetida na mesma cela. Uma vez que ocorre fotobranqueamento, FRET dados não são confiáveis.

6. analisar os dados do FRET-FRAP

  1. Analise as imagens FRET usando o software de escolha.
    Nota: Existem várias maneiras para a imagem e dosar FRET61, incluindo ratiometric FRET62 e FRET índice34,35. No entanto, é altamente recomendável usar as estimativas de FRET eficiência55,63 para a interpretação dos dados FRET-FRAP. Consulte a discussão para maior exploração deste tópico. Para emissão sensibilizada e cálculo da eficiência FRET, software personalizado está disponível do laboratório Hoffman no https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. Quantificar os parâmetros relevantes para cada estrutura subcelular que foi descorado. Isto deve incluir FRET índice/eficiência e média aceitador inicial intensidade média (proporcional à concentração), mas também poderia incluir parâmetros físicos tais como tamanho do ROI.
  3. Analise as FRAP imagens usando o software de escolha.
    Nota: Existem várias maneiras para dosar FRAP26,,27,28,29. Chave experimental incluem contabilidade para branqueamento durante pós-alvejante imaging, alterações na intensidade de fundo e translocação de estruturas subcelulares altamente dinâmicas, como aderências focais. Branqueamento, correções e variações na iluminação de fundo pode ser realizado através da análise das regiões não-branqueada e não-fluorescente das imagens. Altamente dinâmicas estruturas subcelulares, particularmente aqueles mostrando a dinâmica de crescimento ou desmontagem excessiva são incompatíveis com o padrão FRAP análises e não devem ser analisados. Além disso, há uma variedade de maneiras para normalizar os dados. As orientações fornecidas são para a análise mais simples.
  4. Corrigir a recuperação de dados para efeitos de branqueamento e depois normalizar para pre-branquear intensidades. Quantificar o tempo de recuperação e a fração móvel de acordo com a seguinte equação28,34:
    MF - (MF - Ró) e-kt
    onde MF é a fração móvel, Ró é a recuperação inicial, e k é a taxa de recuperação. O intervalo de recuperação é determinado por:
    Τ1/2 = ln 2/k.
    Nota: Há uma variedade de pacotes de software disponíveis publicamente para completar estas análises64 , bem como uma variedade de plugins ImageJ. Software personalizado está disponível a partir do laboratório de Hoffman, em https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. Análises mais devem ser usadas para as situações onde a difusão afeta a dinâmica da proteína de interesse, de múltiplas escalas de tempo são aparentes na recuperação, ou geometrias de branqueamento não-padrão são usadas.

7. interpretar dados FRET-FRAP

  1. Compilar informações relevantes para cada ROI incluem: FRET índice/eficiência, fração móvel FRAP intensidade aceitador, FRAP meia-hora.
    Nota: FRET índice ou eficiência é usada para determinar a carga média através da proteína dentro o ROI. Intensidade de aceitador mede a concentração local da proteína. A metade do tempo de recuperação é uma medida da dinâmica da proteína. Um intervalo menor indica o volume de negócios mais rápido. FRAP fração móvel mede a quantidade de proteína dentro do ROI que ativamente está virando. Uma fração maior móvel indica que uma porcentagem maior da proteína dentro o ROI está virando.
  2. Para investigar o efeito da concentração local na taxa de rotatividade de proteínas e quantidade, plotar FRAP fração de meia-hora e móvel contra intensidade aceitador inicial.
  3. Para investigar o efeito da carga de proteína na taxa de rotatividade de proteínas e quantidade, plotar FRAP fração de meia-hora e móvel contra FRET índice/eficiência.
    Nota: Dependendo da proteína ou estrutura, também pode ser interessante examinar os efeitos de parâmetros físicos, tais como o tamanho da estrutura ou excentricidade, na carga de proteína ou volume de negócios.

Resultados

FRET-FRAP é feito da combinação de duas técnicas fluorescentes, FRET e FRAP. Como enfocamos os efeitos da carga de proteína, usamos sensores de tensão baseado em FRET34,46. Estes sensores baseiam-se frequentemente uma tensão de sensoriamento módulo constituído por duas proteínas fluorescentes, tais como mTFP1 e VenusA206K, ligados por um vinculador flagelliform (figura 1A). Quando o módulo ...

Discussão

O método FRET-FRAP permite a medida direta da dinâmica de força-sensível da proteína, uma propriedade que tem sido difícil sondar diretamente dentro de células vivas. A sensibilidade da dinâmica de proteínas de carga molecular é fundamental para a função da proteína, como uma força transmissor ou transdutor. Carregamento é necessário para a transmissão de ambos gerado internamente e forças aplicadas externamente, chamado mechanotransmission e para a conversão dessas forças em sinais detectáveis por b...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por um prêmio da National Science Foundation carreira (NSF-CMMI-14-54257), bem como subvenções do American Heart Association (16GRNT30930019) e do National Institutes of Health (R01GM121739-01), atribuído ao Dr. Brenton Hoffman e nacional Ciência Foundation Graduate Research Fellowship atribuído a Katheryn Rothenberg. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial da NSF ou NIH.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher25300062
16% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences30525-89-4
60x Objective NA1.35OlympusUPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)Gibco15240-062
Automated StagePrior ScientificH117EIX3
Custom Dichroic MirrorChroma Technology CorpT450/514rpc
Custom mTFP1 Emission FilterChroma Technology CorpET485/20m
Custom mTFP1 Excitation FilterChroma Technology CorpET450/30x
Custom Venus Excitation FilterChroma Technology CorpET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization MediumSapphireMC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma AldrichD5796with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine SerumHyCloneSH30396.03
Fibronectin, HumanCorning47743-654
FRAPPA Calibration SlideAndorprovided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm LaserAndor
Glass-bottomed Fluoro DishesWorld Precision InstrumentsFD35
HEK293-T CellsATCCCRL-3216
Hexadimethrine Bromide, PolybreneSigma AldrichH9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigma AldrichD6429
Inverted Fluorescent MicroscopeOlympusIX83
JMP Pro SoftwareSAS
Lambda 10-3 Motorized Filter WheelsSutter InstrumentsLB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon BulbSutter InstrumentsLS/OF30
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027
MATLAB SoftwareMathworks
MEM Non-Essential Amino AcidsThermo Fisher11140050
MetaMorph for OlympusOlympus
Micro-Humidification SystemBioptechs130708
MoFlo Astrios EQ Cell SorterBeckman CoulterB25982
Objective Heater MediumBioptechs150819-13
OptiMEMThermo Fisher31985070
Phosphate Buffered SalineSigma AldrichD8537
pMD2.G Envelope PlasmidAddgene12259
pRRL Vectorgift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging PlasmidAddgene12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 CameraHamamatsu PhotonicsC11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF CentrifugeThermo Fisher75004505
Stable Z Stage WarmerBioptechs403-1926
Venus Emission FilterSemrockFF01-571/72

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