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요약

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

초록

셀 감지 하 고 mechanotransduction를 호출 하는 과정에서 화학적 감지 신호에 기계적 자극을 변환 하 여 그들의 환경에서 실제 신호에 응답. Mechanotransduction에 중요 한 단계는 외부와 내부 환경 사이 힘의 전송 이다. 전송 세력, 지속적인된 끊어지지 물리적 결합 단백질-단백질 상호 작용의 일련에 의해 생성 되어야 합니다. 주어진된 단백질-단백질 상호 작용에 대 한 기계적 부하 중 상호 작용에 아무런 영향을 가질 수 있습니다, 그리고 상호 작용의 더 빠른 분열에 또는 안정화 상호 작용. 살아있는 세포에 있는 단백질 회전율 차례로 elucidating mechanotransduction에서의 역할, 단백질의 기계적 상태에 대 한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다 지시 어떻게 분자 부하를 이해 한다. 힘에 민감한 단백질 역학을 측정 하기 위한 기존의 기술 단백질 부하의 직접 측정을 부족 하거나 세포 컨텍스트 외부에서 수행 하는 측정에 의존 합니다. 여기, 우리는 photobleaching (무서 워 졸라) 기술, 살아있는 세포 내에서 힘에 민감한 단백질 역학의 측정을 가능 하 게 후 포스터 공명 에너지 전송 형광 복구에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 기술은 잠재적으로 다양 한 subcellular 구조와 다른 세포 유형 힘에 민감한 단백질 역학의 연구를 촉진 어떤 긴장 무서 워 기반 센서에 적용 됩니다.

서문

세포 외 셀 동작을 지정 하는 생 화 학적 및 물리적 단서의 풍부한 원천입니다. 특히,는 microenvironment의 물리적 특성 키 세포 기능, 세포 성장, 감 별 법1,2,3,4, 마이그레이션, 등 중재 수 있습니다. microenvironment의 역학의 Dysregulation 아직 없는 암5, 아 테 롬6, 섬유 증7등 적절 한 치료는 많은 질병에 중요 한 구성 요소입니다. 세포 화학적 감지 신호에 물리적 자극을 변환 하는 방법의 완벽 한 이해, 프로세스 mechanotransduction 되 나, 필요 힘 전송, 모두에 세포에서 중재 하는 분자 메커니즘의 해명 및 내 여러 subcellular 구조.

Subcellular 구조, 내부 단백질은 지속적으로 선회; 바인딩 고 강도 바인딩 파트너8와 그들의 상호 작용에 따라 바인딩. 물리적 거리에 걸쳐 성공적으로 전송 될 세력 단백질 단백질 상호 작용, 단백질의 매출 유지 하 고 그것의 바인딩 파트너9힘을 전송 하는 속도가 느린 해야 의미의 파손 되지 않는 사슬 해야 합니다. 상호 작용 다른 조건10, 에서 언바운드 상태로 전환 수 바인딩된 상태로 종종 개념 동안 단백질 단백질 상호 작용은 일반적으로의 여러 비-공유 결합 사이 단백질 도메인 구성, 11. 주어진된 단백질-단백질 상호 작용을 위해 힘 "이상적인 본드" 라고 하는 상호 작용의 수명에 영향을, "슬립 본드" 라고 하는 상호 작용의 수명을 감소 또는 상호 작용의 수명을 늘릴 수는 가능 하다 "캐치 본드"10로 알려진. 따라서, 단백질 로드와 힘 민감한 역학 지칭 단백질 역동성 사이 복잡 한 관계가 이다.

채권 역학에 부하의 영향을 이해, 향해 매우 유익한 실험의 수 단일 분자 수준에서 수행 되었습니다. 고립 된 단백질, 또는 단백질 및 조작 기술이 자기 핀셋, 광학 핀셋, 원자 힘 현미경 검사 법의 파편을 사용 하 여,이 학문은 설명 했다 힘에 민감한 단백질 단백질 상호 작용에 관련 단백질11,12. 두 integrins13 및 cadherins14이 막 횡단 단백질 형성 세포-매트릭스와 세포 세포 상호 작용, 각각에 대 한 중요 한, 역학 때문에 변경 로드 설명 했다. 셀 내에, vinculin 힘 종속 방식에서 모두 중부15 와 α-catenin16 보충 하 고 말라17, 초점 유착 (FAs)와 외화 접합 (AJs에서 vinculin에 대 한 중요 한 역할을 나타내는 캐치 유대를 형성 수 있습니다. ) 부하. 단일 분자 연구 특정 단백질-단백질 상호 작용의 격리에 대 한 허용 하 고 모호 하지 않은 결과, 하지만 그들은 세포 환경의 복잡성에 대 한 계정을 하지 않습니다.

획기적인 실험 시연 AJs, FAs 등 여러 subcellular 구조, mechanosensitive, 고 전시 내부적으로 생성 또는 외부 적용 부하18,19에 향상 된 어셈블리 20,,2122. 또한, 몇 가지 이론적 모델 mechanosensitive 어셈블리 힘에 민감한 단백질 역동성23,,2425에 의해 구동 될 수 있는 제안 했다. 살아있는 세포 내에서 이러한 힘 민감한 역학 검사, 몇 가지 간접 접근 촬영 되었습니다. FRAP 및 관련된 기술 셀26,27,,2829단백질 역학을 측정 하기 위한 비교적 간단한 방법론을 제공 합니다. 그러나, 단백질 부하의 측정 더 제한 되었습니다. 일반적인 방법은 셀 전체 세포 수축8,,3031을 줄이기 위해 사용 cytoskeletal 억제제에 노출 없이 단백질 역동성을 비교할 것입니다. 개념적으로, 이것은 높은 부하와 낮은 부하 상태 사이의 비교입니다. 그러나, 거기 아무 정량화 부하의 단백질에서 어느 상태에 이며 억제제, F 걸 필 라 멘 트에 따라 키 바인딩 사이트의 손실 등의 의도 하지 않은 생 화 확 적인 효과 있을 수 있습니다. 또 다른 방법은, FAs, 관련 FA 견인 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 분자 부하 대략적인 FA32내 단일 단백질의 역학 관계를 조사 하 여 기판에 총 힘 노력을 측정 하고있다. 총 힘의 부 량이 접근이 방식을 사용 하면, 그것은 분자로 특정 정보를 제공 하지 않습니다. FAs는 많은 부하33을 견딜 수 있는 200 개 이상의 서로 다른 단백질의 구성 되어 있습니다. 따라서, 잠재적으로 FA의 총 힘 출력을 측정 여러 힘 전송 경로 가능성을 가린다 고 안정적으로 부하의 측정을 특정 단백질에 제공 하지 않습니다.

Mechanobiology에 이전 접근, 달리 무서 워 기반 긴장 센서의 출현 수 직접 생활 안에 특정 단백질에 의해 발생 하는 부하의 측정 셀34,,3536. 여기, 선물이 FRAP 기반 측정 단백질 역동성의 긴장 초조해 기반 센서를 결합 하는 프로토콜. 우리 졸라 무서 워 서이 기술을 참조 하십시오. 이 방법은 단백질 부하 및 살아있는 세포 (그림 1)의 힘에 민감한 단백질 역학 평가 되므로 단백질 역동성의 동시 측정을 수 있습니다. 이미, 무서 워 졸라 기술 기계 링커 단백질 vinculin37의 힘-민감한 역학의 연구에 적용 되었습니다. 장력 센서 다양 한 subcellular 구조에에서 관련 된 수많은 단백질을 위해 개발 되었습니다. 예를 들어 센서 vinculin34 와 중부38,39 FAs, cadherins 및 AJs40,,4142, 복잡 한 핵 링컨에서 nesprin에에서 catenins에 개발 되었습니다. 43, α-actinin44 , filamin36 , 골격 및 MUC-1는 glycocalyx45, 다른 사람 사이에46. 마찬가지로, FRAP 초점 유착8,31, 외화 접속점47, 말라 피26, 및 핵48mechanosensitive 단백질에 일반적으로 사용 되는 기술 사용 되었습니다입니다. 이러한 기존의 센서 또는 새로 무서 워 졸라 기술에 광범위 하 게 적용 해야 앞으로, 이동 센서, 다양 한 subcellular 구조 및 상황에에서 힘 민감한 역학의 측정에 대 한 수 있도록 개발. 이 끝, 무서 워 졸라 기술 적용이 다른 시스템에 구현 하기 위한 상세한, 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다. 바라 건 대,이 다양 한 실험 elucidating 다양 한 mechanosensitive 단백질 힘 전송 규제 및 셀 행동 중재의 역할을 수 있게 된다.

프로토콜

1. 영상에 대 한 샘플을 생성 합니다.

  1. 원하는 셀에 안정적으로 빠른 긴장 센서 구성 합니다.
    1. PRRL 벡터 또는 다른 바이러스 성 식 플라스 미드로 긴장 센서 구조를 복제.
      참고: 여러 가지 분자 복제 도구 제한 효소의 사용을 포함 하 여이 단계를 달성, 확장, 및 깁슨 어셈블리35중복 사용할 수 있습니다. PRRL 벡터 lenti 바이러스 성 변환에 사용 되 고 인간의 세포 (CMV) 발기인의 사용을 통해 단백질 생산의 상당한 정도 수 있습니다. 다른 벡터는 특정 컨텍스트에 대 한 필요할 수 있습니다. 예를 들어, CMV 발기인은 일부 셀 유형49에 입 막 음. 또한,만 형광 단백질을 포함 하는 무서 워-기반 센서 금성 A206K, mTFP1 등 그 부족 강한 순서 상 동 사용할 수 있습니다 안정적인 셀 라인을 만들. 시안색 형광 단백질 및 노란 형광 성 단백질을 포함 하는 센서 동종 재결합50적용 됩니다.
    2. 인간 미 발달 신장 (HEK) 293T 세포 psPax2를 사용 하 여 표준 바이러스 생산 방법51를 사용 하 여 pMD2.G 포장 플라스 미드에에서 lentivirus를 생성 합니다.
      주의: Lentivirus만 biosafety 수준 2 실험실 환경에서 제대로 훈련 된 직원에 의해 처리 되어야 합니다.
      참고: 셀 및 포장 플라스 미드의이 조합은 pRRL와 함께 사용 하기 위해 적합 하다. 다른 시스템 다른 벡터와 필요할 수 있습니다.
    3. 표준 변환 프로토콜52 를 사용 하 여 바이러스와 원하는 셀 transduce 셀53 균질 인구 약 생 레벨37에 각 구문 표현 선택 정렬 cytometry 사용 하. 셀 선택 후 실험을 즉시 수행할 수 있습니다 또는 셀 저온 나중 사용을 위해 얼 수 있다. 주어진된 안정 셀 라인 2 freeze-thaw 주기를 초과 하지 마십시오.
      참고: 셀 라인 수 공부 (예를 들어, vinculin 긴장 센서와 함께 사용에 대 한 vinculin-/-MEFs) 단백질에서 결핍의 사용-식 아티팩트를 제한 뿐만 아니라 무서 워 실험에서 비 소음 신호를 높아집니다. 이러한 안정적인 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 라인 식의 중요 한 손실 전에 약 15 구절에 사용할 수 있습니다 또는 센서의 저하는 분명. 바이러스 성 기반된 방법을 적절 하지는 상업용 시 약의 과다 정도 긴장 센서 pcDNA3.1 같은 적절 한 플라스 미드에는 다양 한 종류의 세포 transfect에 제조 업체의 프로토콜에 따라 사용할 수 있습니다. 최적의 식 transfection 다음 24-48 h를 될 것입니다.
  2. 셀 시드 기판 준비.
    1. 4, 35 m m 유리 바닥 접시를 취득 합니다.
    2. 셀 문화 후드에서 working, 15 mL 정식 튜브 확인 4 mL 10 µ g/mL fibronectin의 인산 버퍼 (PBS) 염 살 균 PBS를 사용 하 여 셀 문화 후드에서에. 부드럽게 혼합 하 고 솔루션 셀 문화 후드에 5 분 동안 앉아 보자 한 번 튜브를 반전.
      참고: 농도 또는 ECM 단백질의 종류는 다른 세포 유형 대 한 조정 될 수 있을 수 있습니다. 제공 조건은 MEFs에 적합 합니다.
    3. 각 유리 바닥 접시에 fibronectin 솔루션의 1 mL 플라스틱
    4. 실 온에서 1 시간을 위한 요리에 fibronectin 솔루션을 떠나거나 4 ° c.에서 하룻밤
    5. Fibronectin 솔루션 발음, PBS로 한 번 헹 구 고 PBS의 1 mL를 추가 합니다.
  3. 준비 된 기판에 셀 씨입니다.
    1. 6 cm 문화 접시에 subcultivation에 대 한 적절 한 합류 비율에 관심사의 세포로 시작 합니다.
      참고: 다른 세포 유형 명료한 세포 문화 조건 및 subcultivation 프로토콜 필요 합니다. 이 섹션에서는 지침을 MEFs에 적합 합니다. 일반적으로, MEFs는 subcultivation 전에 85% 합류에 성장 된다.
    2. 셀 문화 후드 내에서 working 3 mL PBS의 한 번 셀 린스. 0.05%의 1 mL을 추가 트립 신-EDTA와 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
    3. 6 cm 접시에 완전 한 미디어의 3 mL를 추가, 셀, 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 배치.
      참고: 완전 한 미디어에 대 한 구성 사용 중인 셀 형식에 따라 달라 집니다. MEFs에 대 한 완전 한 미디어 매체로 높은 포도 당 Dulbecco의 수정이 글 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1%로 정의 항생제-Antimycotic (포함 암포 B, 페니실린, 고 스), 그리고 1% 비 필수 아미노산 (NEAA) 솔루션.
    4. 5 분 동안 1000 x g에서 셀 아래로 회전 합니다.
    5. 미디어를 발음 하 고 완전 한 미디어의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
    6. Fibronectin 코팅 유리 접시에서 PBS를 제거 합니다. 셀을 계산 하 고 1.5 mL의 최종 볼륨에 대 한 적절 한 완전 한 미디어와 각 fibronectin 코팅 유리 접시에 30000 셀 씨.
      참고:이 셀 밀도 MEFs에 적합 하 고 감동, 하지만 상당히 스파스 있지 않은 셀의 인구로 이어질 것입니다. 정확한 휴대폰 번호는 다른 세포 유형 또는 다른 이미징 챔버에 대 한 조정 될 필요가 있습니다.
    7. 4 h 시드 다음에 대 한 확산을 셀 수 있습니다. 확산의 2 h, 성장 매체를 발음 하 고 영상 미디어, 영상 미디어의 1.5 mL를 떠나로 한 번 씻어.
      참고:이 퍼지는 시간 MEFs에 적합 하지만 다른 셀에 대 한 변경 해야 할 수도 있습니다. 그러나, 부 화 기간 6-8 h 이상 이어질 것입니다 ECM 단백질의 중요 한 증 착 완전 한 미디어에 혈 청에서. 미디어 영상 완전 한 미디어로 서 같은 추가 포함 한다 그러나 광학 취소와 형광 영상 채널, flavins에서 어떤 화합물 포함 또는 형광, 페 놀 레드 등을 냉각 해야 한다. 일반적으로 유용한 이미징 미디어 DMEM gfp 라이브 셀 시각화 미디어 10 %FBS 1 %NEAA 솔루션과 보완 이다. 배경 autofluorescence 너무 높은 경우에, 혈 청의 양을 줄일 수 있습니다. 미디어 변경 불가능 초기 도금 후, 트립 신 억제제와 함께 보충 하는 미디어 영상 셀을 직접 resuspended 수 있습니다.

2. 설정 현미경 이미징

  1. 현미경을 켭니다.
    1. 첫 번째 아크 램프에 설정.
      참고: 아크 램프에 이미 있는 다른 장비를 손상 할 수 있는 전자기 펄스, 발표할 예정 이다.
    2. 필터 휠 컨트롤러, 자동된 스테이지 컨트롤러, 현미경-컴퓨터 인터페이스, 그리고 카메라를 켭니다.
    3. 레이저 위치 컨트롤러 및 FRAP 레이저를 켭니다.
      주의: 고성능 레이저 직접 볼 경우 눈에 손상 될 수 있습니다. 샘플을 향해 레이저를 반영 하 고 전송 방지를 표백 하는 동안 거울 FRAP 빔 경로에 이동 하 여 달성 될 수 있다 눈 조각에 향하기에서 레이저 자극을 차단 하는 현미경 시스템을 구성 하는 것이 좋습니다. 접 안 렌즈.
    4. 컴퓨터와 오픈 현미경 제어 소프트웨어 설정.
    5. 아크 램프 및 워밍업 FRAP 레이저에 대 일 분을 허용 합니다.
  2. FRAP 레이저 보정.
    1. 레이저 구성 창을 엽니다. 레이저 노출 샘플에 대 한 적절 한 FRAP 조명 설정 조명 설정 (펄스) 동안 설정 합니다. 수락자 fluorophore만 이미징에 대 한 적절 한 조명 설정 조명 설정 (영상) 동안을 설정 합니다.
    2. 좌표계 설정에서 보정 목표를 선택 합니다. 교정 포인트를 클릭 하는 수동으로 선택을 취소 하 고 교정 중 디스플레이 이미지를 확인 합니다.
    3. 100 펄스의 수와 10000 µs 유지 시간 을 설정 합니다.
    4. Ethidium 평범한 사람 유리 슬라이드와는 coverslip 사이 아래로 coverslip 측면과 무대 어댑터에 봉인 만든 교정 슬라이드를 놓습니다.
      주의: Ethidium 평범한 사람은 돌연 이며 글러브를 사용 하 여 처리 한다. 슬라이드 손상 되 면 기관의 지침에 따라 폐기 합니다.
    5. 수락자 조명 설정을 사용 하 여 슬라이드, 밝은 신호 초점 평면으로 식별의 표면에 초점. 작은 결함 코팅에 초점에 도움이 표시 됩니다.
    6. 영상 평면에 걸쳐 균일 한 형광으로 영역 슬라이드를 이동 합니다.
    7. 설정 만들기를 클릭 하십시오. 소프트웨어 자동으로 표백 하 고 표백된 포인트의 위치를 검출 보정 과정 초기화.
    8. 3 x 3 격자 균등 하 게 배포 해야 하는 표백 포인트와 초점에 있을 것입니다 최종 이미지를 평가 하 여 성공적인 교정을 확인 합니다. 나중에 참조할 수에 대 한 보정 이미지를 저장 합니다.
    9. 교정 슬라이드를 제거 하 고 안전 하 게 저장. 교정 각 실험을 시작 하기 전에 수행 되어야 하지만 샘플 사이 수행 될 필요가 없습니다.

3. 무서 워 이미징에 대 한 매개 변수를 선택

  1. 10 분 Paraformaldehyde 솔루션에 대 한 4 %paraformaldehyde 긴장 센서를 표현 하는 세포의 생성 된 샘플 중 하나 수정 메탄올 무료, EM-학년, 형광 단백질의 변성 시키기 방지 하 라고도 해야 합니다. 고정 후 PBS에 놓습니다.
    주의: Paraformaldehyde 솔루션은 유독 하다. 증기 두건에서이 단계를 수행 해야 하 고 솔루션의 기관 정책에 따라 폐기 해야 합니다.
    참고:이 최적화 단백질 역학에 의존 하지 않는 고 고정된 샘플 셀 건강에 대 한 걱정 없이 최대 이미징 시간 허용 합니다.
  2. PBS로 3 회 샘플을 헹 구 고 PBS에.
    참고: 가장 상용 설치 미디어를 사용 하 여 영향을 미칩니다 fluorophore 속성을 무서 워54이미징에 대 한 샘플을 부적 한 만드는. 이상적으로, 셀 즉시, 몇 군데는 하지만 하룻밤 4 ° c.에 남아 있을 수 있습니다. 샘플의 악화에 더 긴 대기 시간이 발생 합니다.
  3. 이미징에 대 한 현미경 단계 보유자에 샘플을 놓습니다.
  4. 다차원 수집 (MDA) 도구를 엽니다. 3 채널의 순차적 영상 설정: 수락자만 여기 및 방출 (수락자 채널), 기증자 여기 수락자 방출 (무서 워 채널), 기증자만 여기 고 방출 (기증자 채널).
    참고: 샘플 이미지 무서 워 하는 방법의 다양 한이 있습니다. 무서 워 효율 측정을 보정 시스템의 의미와 결합 하 여 화상의 3 채널 또는 "3-큐브" 방법 긴장 무서 워 기반 센서55,56에 대 한 것이 좋습니다. 이 방법은 빠르고, 간단 하 고, 비파괴만 표준 형광 현미경, 이미징 요구 이며 실험의 비교를 가능 하 게 다른 일 및 이미징 설정.
  5. 500 ms의 노출 시간과 10%의 중간 농도 (ND) 필터를 사용 하 여 샘플을 검색 합니다. 관심의 구조에 분명 지역화와 긴장 센서를 표현 하는 셀을 찾을.
  6. 500 밀리초 또는 각 이미지 채널에 대 한 원하는 길이의 노출 시간과 100%의 ND 필터를 선택 하 고 무서 워 이미지 시퀀스를 취득.
  7. 각 이미지 채널의 subcellular 구조는 센서의 평균 강도 추정 합니다. 낮은 신호 부적 절 한 수정 견적, 감지기, 또는 배경 신호의 상당한 기여에서 비선형 정확 하지 않은 결과가 발생할 수 있습니다. 대략적인 지침의 카메라의 동적 범위 10% 이상 농도 대 한 목표로 하는 (즉., 16-비트 카메라에 대 한 농도 6000 이상 이어야 합니다).
    참고: 동일한 광학 설정 (노출 시간, 필터, 목표, 및 카메라 이득 또는 binning 같은 다른 변수) 비교 될 것입니다 모든 무서 워 실험 사용 해야 합니다. 이러한 설정의 변경 금액 있는 중 생성 된 현미경 검사 법 체제에서 감지 마세요 변경 이어질 것입니다. 무서 워 효율 측정은 이러한 독립적인 설정, 하지만 보정 요인 무서 워 효율을 결정 하는 데 사용 되지 않습니다. 이론에서는, 보정 요인의 다양 한 세트 다른 광학 설정에서 무서 워 효율성을 생성 하는 데 사용할 수 있지만 권장 되지는 않습니다. 표백 또는 phototoxicity 가짜 결과 만드는 다양 한 설정, 사이 다 수 있습니다.
  8. 보기의 동일한 필드의 두 번째 무서 워 이미지 시퀀스를 취득 합니다. 각 이미지 채널에 센서의 평균 강도 비교 하 여 프레임 사이 photobleaching를 견적 한다. Photobleaching 신호의 1-5% 손실 보다는 더 적은 선호 최소한으로 유지 되어야 한다.
  9. Photobleaching를 최소화 하면서 강도 극대화 하기 위해 이미징 매개 변수를 조정 합니다. 조 악한 조정에 대 한 수집 하는 동안 사용 되 고 ND 필터를 변경 합니다. 미세한 조정에 대 한 250 ms의 단계에서 노출 시간을 변경 합니다.
  10. 3.5-3.8 단계를 반복 하 여 photobleaching을 최소화 하면서 적절 한 신호를 얻을 수 있습니다.
    참고: 일반적으로, vinculin 긴장 센서 vinculin-/-MEFs에 대 한 설정을 1500 ms, 1500 ms 및 기증자, 무서 워, 그리고 수락자 채널 1000 ms 각각. 최적의 값은 조명 시스템, 목표, 필터 집합 및 센서 식 수준 형식이 달라 집니다.

4. 선택 매개 변수를 졸라 이미징

  1. 주변 지역 표백 하거나 photodamage 않고 관심이 (수익 ROI)의 완전 한 표백 레이저 설정을 최적화 합니다.
    1. 10 분 동안 4 %paraformaldehyde 긴장 센서를 표현 하는 세포의 생성 된 샘플 중 하나를 수정 합니다.
      참고:이 최적화 단백질 역학에 의존 하지 않는 고 고정된 샘플 셀 건강에 대 한 걱정 없이 최대 이미징 시간 허용 합니다. 이것은 또한 모바일 단백질에 의해 표백, 급속 한, 보급 중재 형광 복구 표백의 부각 사이 발생에서 어떤 효과 피하고, 표백의 효과의 격리에 대 한 허용의 복구 방지는 첫 번째 게시물 표 백제 이미지입니다.
      주의: Paraformaldehyde 솔루션은 유독 하다. 증기 두건에서이 단계를 수행 해야 하 고 솔루션의 기관 정책에 따라 폐기 해야 합니다.
    2. PBS로 3 회 샘플을 헹 구 고 PBS에.
      참고: 가장 상용 설치 미디어를 사용 하 여 샘플 FRAP54이미징에 대 한 부적 한 만드는 fluorophore 속성에 적용 됩니다. 이상적으로, 셀 즉시, 몇 군데는 하지만 하룻밤 4 ° c.에 남아 있을 수 있습니다. 샘플의 악화에 더 긴 대기 시간이 발생 합니다.
    3. 이미징에 대 한 현미경 단계 보유자에 샘플을 놓습니다.
    4. 레이저 구성 창을 엽니다. 1000 µs 및 투자 수익에 걸쳐 스캔에서 각 자리 전체 전력 레이저의 10000 µs 받을 것입니다 의미 10 펄스의 레이저 망설임 시간 설정 시작
      참고: 500 mW, 515 nm 레이저는 표백을 위해 사용 되었다. 이 선택적으로 최대한의 효율으로 금성 A206K, vinculin 긴장 센서, 수락자를 표 백제를 선정 되었다. 다른 형광 단백질 무서 워 기반 긴장 센서를 사용 하는 경우 다른 유형의 레이저 고용 해야 합니다.
    5. 관심의 구조에 분명 지역화와 긴장 센서를 표현 하는 셀을 찾을 하 고 이미지를 확보.
    6. 표 백제 및 ROI 위치 저장 영역 개요 직사각형 ROI를 그립니다. 펄스 레이저입니다. 이 샘플의 또 다른 이미지를 스냅 합니다.
      참고: 크기 상자 전체 FA의 대략 크기 이어야 한다. 한다 주의 상자 크기 실험에서 크게 달라 지지 않습니다. 표백된 영역 단백질 보급의 영향을 받는 그 역학에에서 신중 하 게 모니터링 해야 합니다. 이것은 cadherins47, 같은 막 횡단 단백질 또는 단백질27,57천천히 확산에 잠재적인 관심사 이다.
    7. 전체 투자 수익 강도 배경 수준 근처는 표백은 확인 하 여 photobleaching의 품질을 확인 합니다. 또한, 투자 수익 밖에 없습니다 표백이 있는지 확인.
    8. ROI 내에서 유도 하는 중요 한 투자 수익에 밖으로 표백 하지 않고 표백의 상당한 금액을 달성 하는 데 필요한 레이저 설정을 조정 합니다. 조 악한 조정에 대 한 인상과 100 µs의 및 미세 조정 단계에서의 유지 시간을 낮은, 올리고 5 펄스의 단계에서 펄스의 수를 낮은.
    9. 단계 4.1.5-4.1.8는 투자 수익 완전히 오프 대상 photobleaching 없이 표백은 최소 설정에 도달할 때까지 반복 합니다.
      참고: FRAP 분석의 핵심 요소는 phototoxicity 유도 없이 상당한 초기 표백 값을 달성. 고정된 샘플에서 완전 한 표 백제에는 레이저 설정을 사용 합니다. 일반적으로, 원하는 표백 수준을 달성 하기 위해 광자의 최소 수를 사용 해야 합니다. 또한, 표백 프로토콜 유지 되어야 한다 실험, 동안 비교적 일관 된 변경 단백질 역동성58의 측정에 영향을 미칠 수 있습니다.
  2. Photobleaching를 최소화 하면서 관심사의 단백질의 역학을 완벽 하 게 잡으려고 시간 매개 변수를 최적화 합니다.
    1. 가령, CO2 제어 뿐만 아니라 온수 단계와 목표 라이브 셀 이미징에 대 한 현미경 검사 법 체제를 준비 합니다. 20 분 동안 equilibrate를 허용 합니다.
      참고: 이미지 셀의 건강을 유지 하기 위해 온도 pH 유지 되어야 합니다 이미징 선박. 열띤된 단계와 객관적인 히터의 다양 한 쉽게 37 ° c.에 셀 온도 유지할 수 있습니다. 많은 미디어 종류에 대 한 pH의 제어 달성 될 수 있다 통과 습도 5% CO2 연동 펌프의 사용에 의해 15 mL/분에서 샘플을 통해 또는, CO2 컨트롤은 사용할 수 없는, 라이브 이미징 HEPES 포함 된 미디어 사용 해야 합니다을 큰 pH 변화를 방지 합니다.
    2. 이미징에 대 한 현미경 단계 보유자에 긴장 센서를 표현 하는 세포의 생성 된 샘플 중 하나를 놓습니다. 10 분 동안 equilibrate를 허용 합니다.
    3. MDA 도구를 사용 하 여 설정 한 시간 경과 3-5 이미지 미리 표 백제, 투자 수익, 표 백제 및 10-60 이미지를 계속 확보 합니다.
      참고: FAs에서 vinculin에 대 한 이미징 모든 5 5 분 후 표 백제에 대 한 과도 한 표백31소개 없이 역학을 관찰 하는 것 충분 하다. 영상 비율에 대 한 유용한 시작 포인트와 다른 많은 단백질에 대 한 기간 문학47,,4859,60에서 찾을 수 있습니다.
    4. 수락자 이미징 충분 한 신호 대 잡음 비율, 이미지의 구조를 유지 하면서 빛, 샘플의 노출을 최소화 하는 설정을 사용 합니다. 좋은 출발점은 ND 필터 및 노출 시간 동안 무서 워 수락자의 이미징에 필요한의 절반 이다.
    5. 관심의 구조에 분명 지역화와 긴장 센서를 표현 하는 셀을 찾아서 이미지를 스냅.
    6. 표 백제 및 투자 수익 위치를 저장 위치를 강조 하기 위해 직사각형 ROI를 그립니다. 시작 하는 시간 경과.
    7. 잠재적인 문제에 대 한 이미지의 결과 집합을 검사 합니다.
      1. 상당한 점프 (초기 강도의 10% 보다 큰) 형광 복구에서 프레임 간의 경우 프레임 사이 시간 단계를 줄일 수 있습니다.
      2. (초기 강도의 5-10% 보다 큰) 시간이 지남에 형광의 중요 한 글로벌 손실 경우 게시물 표 백제를 촬영 한 이미지의 수 줄이거나 빛 샘플의 노출을 줄이기 위해 이미징 설정을 변경 합니다.
      3. 형광 복구 하지는 시간 경과의 끝에 의해 plateaued 있다, 하는 경우는 시간 경과의 총 길이 늘립니다.
    8. 시간 매개 변수를 적절 하 게 조정 하 고 단계 4.2.5-4.2.7 형광 복구 글로벌 사진-샘플에 손상 없이 캡처 적절 하 게 될 때까지 반복 합니다.

5. 무서 워 졸라 데이터 수집

  1. 가령, CO2 제어 뿐만 아니라 온수 단계와 목표 라이브 셀 이미징에 대 한 현미경 검사 법 체제를 준비 합니다. 20 분 동안 equilibrate를 허용 합니다.
    1. 이미지 셀의 상태를 확인 하기, 영상 실에서 37 ° C에 온도 유지 합니다. 통과 하는 연동 펌프를 사용 하 여 pH를 유지 하기 위해 15 mL/min에서 샘플을 통해 5% CO2 습도.
    2. 또는, CO2 제어를 사용할 수 없는 경우 큰 pH 변화를 방지 하기 위해 HEPES 포함 하 라이브 영상 미디어를 사용 합니다.
  2. MDA 도구 열고 무서 워 이미징 다른 필터 세트를 포함 하 여 매개 변수를 설정 합니다.
  3. 이 MDA를 MDA_FRET_Date의 이름으로 실험 폴더에 저장 합니다.
  4. 사전 표 백제 취득 후 레이저 펄스를 다른 MDA FRAP 이미징 다른 필터 세트, 시간 설정 및 저널을 포함 한 매개 변수를 설정 합니다.
  5. 이 MDA를 MDA_FRAP_Date의 이름으로 실험 폴더에 저장 합니다. MDA 창을 닫습니다.
  6. 화면 상단의 도구 모음에서 선택 저널 | 녹음을 시작.
  7. MDA 창을 열고, MDA_FRET_Date 상태를 로드 하 고 취득을 누릅니다. 그런 다음 MDA_FRAP_Date 상태를 로드 하 고 취득을 누릅니다.
  8. 화면 상단의 도구 모음에서 수집의 끝에서 저널을 선택 | 녹음 중지.
  9. FRETFRAP_Date 의 이름으로 실험 폴더에이 저널을 저장 하 고 쉽게 액세스할 수 있도록 도구 모음에 추가. MDA 창을 닫습니다.
  10. 이미징에 대 한 현미경 홀더에 긴장 센서를 표현 하는 세포의 생성 된 샘플 중 하나를 놓습니다. 10 분 동안 equilibrate를 허용 합니다.
  11. 취득 아래 이미지 수집을 사용 하 여 샘플 탐색 | 취득 최소한의 노출 시간과 ND 필터를 관심사의 세포를 식별.
  12. 연속 자동 초점 장치 로 이동 하 여 설정 | 포커스. 수동으로 올바른 이미징 비행기에 도달할 때까지 샘플에 초점.
  13. 연속 초점 설정, 조정, 시스템에 대 한 대기 누르고 시작 연속 초점.
    참고:이 필요 하지 않습니다 하지만 밖으로의 초점을 표류에서 샘플을 방지 하기 때문에 크게 FRAP 복구 곡선의 품질을 향상 시킵니다.
  14. 관심의 구조에 분명 지역화와 긴장 센서를 표현 하는 셀을 찾아서 이미지를 스냅.
  15. 어디에 표 백제를 강조 하기 위해 직사각형 ROI를 그립니다. 투자 수익 위치를 저장 합니다.
  16. 무서 워 이미지 FRAP 시간 경과의 초기화 뒤의 인수 예정 FRETFRAP_Date 저널을 초기화 합니다.
  17. 5.14-5.16 단계를 반복 하 여 10-15 이미지 세트를 인수.
    참고: 측정 동일한 셀에 반복 될 수 없습니다. Photobleaching가 발생 하면 무서 워 데이터는 신뢰할 수 없습니다.

6. 무서 워 졸라 데이터 분석

  1. 무서 워 이미지 선택의 소프트웨어를 사용 하 여 분석 합니다.
    참고: 이미지을 quantitate 무서 워61, 비율 무서 워62 와 무서 워 인덱스34,35를 포함 하 여 여러 가지 방법으로 있다. 그러나, 그것은 매우 무서 워 졸라 데이터의 해석에 대 한 무서 워 효율55,63 의 견적을 사용 하 고 좋습니다. 이 항목의 추가 탐사에 대 한 토론을 참조 하십시오. 민감하게 방출과 무서 워 효율의 계산에 대 한 사용자 정의 소프트웨어는 https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public에서 호프만 연구소에서 있습니다.
  2. 표백 된 각 subcellular 구조에 대 한 관련 매개 변수를 계량. 이 평균 무서 워 인덱스/효율성과 평균 초기 수락자 강도 (농도에 비례)를 포함 해야 하지만 ROI 크기와 같은 물리적 매개 변수를 포함할 수 있습니다.
  3. FRAP 이미지 선택의 소프트웨어를 사용 하 여 분석 합니다.
    참고: 여러 가지 방법으로 quantitate FRAP26,27,,2829있다. 주요 실험 우려 게시물 표 백제 이미징, 배경 농도 및 초점 유착 등 매우 역동적인 subcellular 구조의 전 좌에 변경 동안 표백에 대 한 회계를 포함 한다. 표백 수정 및 배경 조명 변화 하는 것은 이미지의 비 표백 및 비 형광 영역의 분석을 통해 수행할 수 있습니다. 높은 동적 subcellular 구조, 특히 그 과도 한 성장 또는 분해 역동성을 보여주는 표준 FRAP 분석와 호환 되지 않습니다 하 고 분석 해야 합니다. 또한, 다양 한 데이터를 정규화 하는 방법 있다. 제공 된 지침은 간단한 분석입니다.
  4. 표백 효과 대 한 복구 데이터를 수정 하 고 중 표 백제 농도를 정상화. 복구 및 다음 방정식28,34에 따라 모바일 분수의 하프 타임 계량:
    MF-(MF-Ro) e-kt
    MF 모바일 분수, Ro 가 초기 복구 이며 k 는 복구 속도. 복구의 하프 타임에 의해 결정 됩니다.
    Τ1/2 = ln 2/k.
    참고: 이러한 분석64 로 ImageJ 플러그인의 다양 한 완료를 위한 공개적으로 사용 가능한 소프트웨어 패키지의 다양 한이 있습니다. 사용자 정의 소프트웨어는 https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public에서 호프만 연구소에서 있습니다. 더 많은 분석 확산에 영향을 미치는, 관심사의 단백질의 역학 여러 시간의 척도 복구, 명백한 또는 비표준 표백 형상 사용 상황을 위해 사용 되어야 한다.

7. 무서 워 졸라 데이터 해석

  1. 포함 하 여 각 ROI에 대 한 관련 정보를 컴파일: 무서 워 인덱스/효율, 수락자 강도, FRAP 하프 타임, FRAP 모바일 분수.
    참고: 무서 워 인덱스 또는 효율 투자 수익 내 단백질에서 평균 부하를 확인 하는 데 사용 됩니다. 수락자 강도 단백질의 현지 농도 측정합니다. 복구의 하프 타임 단백질 역동성의 측정 이다. 작은 반 시간 더 빠른 회전율을 나타냅니다. FRAP 모바일 분수 적극적으로 선회 ROI 내에서 단백질의 양을 측정 합니다. 더 큰 모바일 분수 투자 수익 내 단백질의 더 큰 백분율은 선회 나타냅니다.
  2. 양과 단백질 회전율 비율에 현지 농도의 영향을, 초기 수락자 강도 대 한 FRAP 하프 타임 및 모바일 분수 플롯.
  3. 단백질 회전율 비율과 금액에 단백질 부하의 영향을, 무서 워 인덱스/효율성에 대 한 FRAP 하프 타임 및 모바일 분수 플롯.
    참고: 단백질 또는 구조에 따라 또한 수 있습니다 단백질 로드 또는 회전율에 구조 크기 또는 편심, 같은 실제 매개 변수들의 효과 검사 하는 재미 있는.

결과

무서 워 FRAP 두 형광 기술 조합 구성, 무서 워 및 FRAP. 우리가 단백질 부하의 효과에 초점을 맞춘, 우리 무서 워 기반 긴장 센서34,46을 사용 하 고. 이 센서는 종종 긴장의 mTFP1와 VenusA206K, flagelliform 링커 (그림 1A)로 연결 하 여 두 개의 형광 단백질으로 구성 된 모듈을 감지 기반으로 합니다. 모듈 단백질의 머?...

토론

무서 워 졸라 메서드 힘에 민감한 단백질 역동성, 살아있는 세포 내부 직접 조사 하기 어려운 속성의 직접 측정 하기 위한 수 있습니다. 분자 중에 단백질 역동성의 감도 힘 송신기 또는 변환기로 단백질의 기능에 중대 하다. 로드는 내부적으로 생성 된 둘 다의 전송에 대 한 필요 그리고 외부에서 적용 된 힘, mechanotransmission, 라는 화학적 감지 신호로 그 세력의 변환에 대 한 mechanotransduction 라는. 그...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품에서 미국 심장 협회 (16GRNT30930019) 및 건강의 국가 학회 (R01GM121739-01) 박사 Brenton 호프만 국민에 게 수 여 교부 금 뿐만 아니라 국립 과학 재단 경력 포상 (NSF-CMMI-14-54257)에 의해 지원 되었다 과학 재단 대학원 연구 장학금 Katheryn 다니는에 수 여. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 NSF 나 NIH의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher25300062
16% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences30525-89-4
60x Objective NA1.35OlympusUPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)Gibco15240-062
Automated StagePrior ScientificH117EIX3
Custom Dichroic MirrorChroma Technology CorpT450/514rpc
Custom mTFP1 Emission FilterChroma Technology CorpET485/20m
Custom mTFP1 Excitation FilterChroma Technology CorpET450/30x
Custom Venus Excitation FilterChroma Technology CorpET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization MediumSapphireMC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma AldrichD5796with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine SerumHyCloneSH30396.03
Fibronectin, HumanCorning47743-654
FRAPPA Calibration SlideAndorprovided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm LaserAndor
Glass-bottomed Fluoro DishesWorld Precision InstrumentsFD35
HEK293-T CellsATCCCRL-3216
Hexadimethrine Bromide, PolybreneSigma AldrichH9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigma AldrichD6429
Inverted Fluorescent MicroscopeOlympusIX83
JMP Pro SoftwareSAS
Lambda 10-3 Motorized Filter WheelsSutter InstrumentsLB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon BulbSutter InstrumentsLS/OF30
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027
MATLAB SoftwareMathworks
MEM Non-Essential Amino AcidsThermo Fisher11140050
MetaMorph for OlympusOlympus
Micro-Humidification SystemBioptechs130708
MoFlo Astrios EQ Cell SorterBeckman CoulterB25982
Objective Heater MediumBioptechs150819-13
OptiMEMThermo Fisher31985070
Phosphate Buffered SalineSigma AldrichD8537
pMD2.G Envelope PlasmidAddgene12259
pRRL Vectorgift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging PlasmidAddgene12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 CameraHamamatsu PhotonicsC11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF CentrifugeThermo Fisher75004505
Stable Z Stage WarmerBioptechs403-1926
Venus Emission FilterSemrockFF01-571/72

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