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Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer-basierte Spannung Sensoren zur Messung der Belastung und Fluoreszenz Proteingewinnung nach Immunofluoreszenz Proteindynamik ermöglichen die Messung der Kraft-und Kleinschreibung messen Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen.

Zusammenfassung

Zellen spüren und reagieren auf körperliche Signale in ihrer Umgebung durch die Umwandlung der mechanischen Reize in biochemisch nachweisbar Signale in einem Prozess namens Mechanotransduktion. Ein entscheidender Schritt in Mechanotransduktion ist die Übertragung der Kräfte zwischen den internen und externen Umgebungen. Kräfte zu übertragen, muss eine nachhaltige, ungebrochen körperliche Verbindung erstellt durch eine Reihe von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Für ein gegebenes Protein-Protein-Interaktion mechanischer Belastung haben entweder keine Auswirkungen auf die Interaktion, zu schneller Distanzierung der Interaktion führen oder sogar stabilisieren die Interaktion. Verstehen, wie molekulare Last diktiert, dass Protein-Umsatz in lebenden Zellen wertvolle Informationen über den mechanischen Zustand eines Proteins, im Gegenzug seine Rolle bei der Mechanotransduktion Aufklärung liefern kann. Bestehende Techniken zur Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik fehlen direkte Messungen des Proteins Last oder verlassen Sie sich auf die Messungen außerhalb des zellulären Kontexts. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Förster Resonanz Energie Transfer-Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz (Bund-FRAP) Technik, ermöglicht die Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen. Diese Technik gilt möglicherweise für jeden Bund-basierte Spannung Sensor erleichtern das Studium der Kraft-Sensitive Proteindynamik in unterschiedlichsten subzellulären Strukturen und in verschiedenen Zelltypen.

Einleitung

Die extrazelluläre Umgebung ist eine reiche Quelle von biochemischen und physikalischen Signale, die ihr Verhalten der Zelle bestimmen. Insbesondere kann die physische Beschaffenheit der Mikroumgebung wichtige Zellfunktionen einschließlich Zellwachstum, Migration und Differenzierung1,2,3,4vermitteln. Dysregulation der Mechanik von der Mikroumgebung ist eine kritische Komponente für viele Krankheiten, die noch nicht ausreichende Behandlungen, wie z. B. Krebs5, Atherosklerose6und Fibrose7verfügen. Ein vollständiges Verständnis der wie Zellen physikalischen Reize in biochemisch nachweisbar Signale umwandeln, ein Prozess Mechanotransduktion bezeichnet, erfordert die Aufklärung der molekularen Mechanismen vermitteln Kraftübertragung, sowohl in als auch außerhalb der Zellen und in mehreren subzelluläre Strukturen.

Im Inneren der subzellulären Strukturen sind Proteine ständig umdrehen; Bindung und loslösen, basierend auf der Stärke ihrer Interaktionen mit verbindlichen Partner8. Für Kräfte erfolgreich über eine räumliche Distanz hinweg übertragen werden muss eine ununterbrochene Kette von Protein-Protein-Interaktionen, was bedeutet, dass ein Protein-Umsatz langsam genug, um aufrecht zu erhalten und Kraft zu seinen verbindlichen Partner9übertragen werden muss. Während Protein-Protein-Interaktionen in der Regel von mehreren nicht-kovalente Bindungen zwischen den Protein-Domänen bestehen, ist die Interaktion häufig als gebundenen Staat konzipiert, die in einem ungebundenen Zustand unter verschiedenen Bedingungen10, übergehen kann 11. für ein gegebenes Protein-Protein-Interaktion ist es möglich, dass Kraft keine Wirkung auf die Dauer der Interaktion haben, bekannt als eine "ideale Bond", reduzieren die Lebensdauer der Interaktion, bekannt als "Slip-Bond", oder erhöhen die Lebensdauer der Interaktion , bekannt als ein "Fang Bond"10. So gibt es eine komplizierte Beziehung zwischen Protein Last und Proteindynamik, die wir als Kraft-Sensitive Dynamik bezeichnen.

Zum Verständnis der Auswirkungen der Belastung auf die Anleihe Dynamik, wurden eine Reihe von hochinformativen Experimente auf der Einzelmolekül-Ebene durchgeführt. Mit isolierten Proteine oder Fragmente von Proteinen und Manipulationstechniken wie magnetische Pinzette, optische Pinzette und Rasterkraftmikroskopie, zeigten diese Studien Kraft-Sensitive Protein-Protein-Interaktionen für mehrere relevante Proteine-11,-12. Beide Integrine13 und Cadherine14, die transmembranen Proteine wichtig zur Bildung Zellmatrix und Zell-Zell-Interaktionen, bzw. sind, zeigten Veränderungen in der Dynamik durch geladen. Innerhalb der Zelle Vinkulin wird auf beide Talin15 und α-Catenin16 in einer Kraft-abhängigen Weise eingestellt, und bilden eine Fang-Anleihe mit Aktin17, zeigt eine entscheidende Rolle für Vinkulin bei fokalen Adhäsionen (FAs) und Adherens Junctions (AJs ) unter Last. Einzelmolekül-Studien für die Isolierung von spezifischen Protein-Protein-Interaktionen zu ermöglichen und eindeutige Ergebnisse liefern, aber sie nicht die Komplexität der zellulären Umgebung entfallen.

Landmark Experimente zeigten, dass mehrere subzelluläre Strukturen, einschließlich FAs und AJs, Mechanosensitive und verbesserte Montage als Reaktion auf intern generierten oder äußerlicher Anwendung Lasten18,19aufweisen, 20,21,22. Darüber hinaus haben mehrere theoretische Modelle vorgeschlagen, dass Mechanosensitive Montage durch Kraft-Sensitive Protein Dynamics23,24,25gefahren werden konnte. Um diese Kraft-Sensitive Dynamiken innerhalb von lebenden Zellen zu untersuchen, wurden einige indirekte Ansätze unternommen. FRAP und verwandte Techniken bieten eine relativ einfache Methode zur Messung von Proteindynamik Zellen26,27,28,29. Jedoch wurde die Messung von Protein Last mehr beschränkt. Ein typisches Vorgehen soll Proteindynamik in Zellen mit und ohne Exposition gegenüber einem Zellskelett Inhibitor verwendet, um allgemeine Zelle Kontraktilität8,30,31zu vergleichen. Im Prinzip handelt es sich um einen Vergleich zwischen einer hohen Belastung und niedrigen Lastzustand. Allerdings gibt es keine Quantifizierung der Last über das Protein in keinem der Staaten, und möglicherweise gibt es biochemische Nebeneffekte des Inhibitors, so den Verlust von wichtigen Bindestellen entlang einer F-Aktin-Filament. Ein weiterer Ansatz, speziell für FAs, wurde zur Messung der Gesamtkraft Anstrengung auf dem Substrat durch das FA mit Traktion Rasterkraftmikroskopie um ungefähre molekulare Last und untersuchen Sie die Beziehung mit der Dynamik eines einzigen Proteins innerhalb der FA32. Während dieser Ansatz die Quantifizierung der Gesamtkraft ermöglicht, bietet es keine molekular spezifische Informationen. FAs bestehen aus mehr als 200 verschiedene Proteine, von die viele Last33tragen können. So Messausgang die Gesamtkraft von einem FA möglicherweise verdeckt die Möglichkeit, mehrere Kraft Übertragungswege und zuverlässig liefert ein Maß für die Belastung auf ein bestimmtes Protein.

Im Gegensatz zu früheren Ansätzen in Mechanobiology, das Aufkommen der Bund-basierte Spannung Sensoren ermöglicht die direkte Messung von Lasten erlebt durch bestimmte Proteine in lebenden Zellen34,35,36. Hier präsentieren wir eine Protokoll, die Bund-basierte Spannung Sensoren mit FRAP Maß Proteindynamik verbindet. Wir bezeichnen diese Technik als Bund FRAP. Dieser Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Messung von Protein Last- und Proteindynamik, so dass die Bewertung der Kraft-Sensitive Proteindynamik in lebenden Zellen (Abbildung 1). Bereits, hat die Bund FRAP-Technik für die Untersuchung von Kraft-und Kleinschreibung Dynamik der mechanischen Linker Protein Vinkulin37angewendet. Spannung-Sensoren wurden für zahlreiche Proteine entwickelt, die in einer Vielzahl von subzellulären Strukturen relevant sind. Zum Beispiel sind Sensoren für Vinkulin34 und Talin38,39 in FAs, Cadherine und Catenins in AJs40,41,42, Nesprin in der nuklearen LINC Komplex entwickelt worden 43, α-Actinin44 und Filamin36 in dem Zytoskelett und MUC-1 in der Glycocalyx45, unter anderem46. In ähnlicher Weise ist FRAP eine häufig verwendete Technik auf Mechanosensitive Proteine innerhalb der fokalen Adhäsionen8,31, Adherens Junctions47Aktin Kortex26und Kern48verwendet worden ist. Voran, die Bund-FRAP Technik breit anwendbar zu sein sollte dieser vorhandenen Sensoren oder neu entwickelte Sensoren zur Messung von Kraft-und Kleinschreibung Dynamik in einer Vielzahl der subzellulären Strukturen und Zusammenhänge ermöglicht. Zu diesem Zweck bieten wir eine detaillierte, generalisierte Protokoll für die Umsetzung der Bund-FRAP-Technik in diese unterschiedlichen Systeme anwendbar. Hoffentlich wird dies eine Vielzahl von Experimenten, die Aufklärung der Rollen der verschiedenen Mechanosensitive Proteine bei der Regulierung der Kraftübertragung und bei der Vermittlung Zelle Verhalten ermöglichen.

Protokoll

1. erzeugen Sie Proben für die Bildgebung

  1. Stabil ausdrückliche Spannung Sensor Konstrukt in gewünschten Zelltyp.
    1. Klonen Sie Spannung Sensor Konstrukt in pRRL Vektor oder anderen viralen Expressionsplasmid.
      Hinweis: Verschiedene molecular cloning Tools stehen zu erreichen diesen Schritt, einschließlich der Verwendung von Restriktionsenzymen, überlappen, Erweiterung und Gibson Montage35. Der pRRL Vektor wird in Lenti virale Transduktion verwendet und ermöglicht ein hohes Maß an Protein-Produktion durch den Einsatz der menschlichen Cytomegalovirus (CMV) Veranstalter. Verschiedene Vektoren können für einen bestimmten Kontext erforderlich sein. Zum Beispiel ist die CMV-Promotor in einige Zelle Arten49zum Schweigen gebracht. Darüber hinaus kann nur FRET-basierte Sensoren mit fluoreszierenden Proteins, dass fehlende starke Sequenzhomologie, wie mTFP1 und Venus A206K, verwendet werden, stabilen Zelllinien zu schaffen. Sensoren mit Cyan fluoreszierenden Proteins und gelb fluoreszierenden Proteins werden wahrscheinlich homologe Rekombination50.
    2. Generieren Sie Lentivirus in menschliche embryonale Nieren (HEK) 293T Zellen unter Verwendung von psPax2 und pMD2.G Verpackung Plasmide mit standard Virus Produktion Methoden51.
      Achtung: Lentivirus sollte nur von entsprechend geschultem Personal in einer Laborumgebung Biosafety Level 2 gehandhabt werden.
      Hinweis: Diese Kombination aus Zellen und Verpackung Plasmide ist geeignet für den Einsatz mit pRRL. Andere Systeme sein mit anderen Vektoren erforderlich.
    3. Gewünschte Zellen mit Viren mit standard Transduktion Protokolle52 transduzieren und Durchflusszytometrie Zellen53 eine homogene Bevölkerung mit dem Ausdruck jedes Konstrukt um etwa endogenen Ebenen37Auswahl sortieren verwenden. Nach Zellenauswahl Experimente können sofort durchgeführt werden, oder Zellen tiefkalt für den späteren Gebrauch eingefroren werden können. Überschreiten Sie nicht 2 Gefrier-Tau-Zyklen für eine gegebene stabile Zelllinie.
      Hinweis: Die Verwendung von Zelllinien, die einen Mangel an Protein sein Studium (z.B.Vinkulin- / - MEFs für die Verwendung mit dem Vinkulin Spannung Sensor) erhöht das Signal-noise-Verhältnis im Bund Experimente sowie die Überexpression Artefakte zu begrenzen. Solche stabilen Mauslinien embryonalen Fibroblasten (MEF) eignet sich für ca. 15 Passagen vor erheblichen Verlust des Ausdrucks oder Verschlechterung der Sensoren ist offensichtlich. Wenn virale basierte Methoden nicht erwünscht sind, eine Fülle von kommerziellen Reagenzien gemäß Protokoll des Herstellers lässt sich vorübergehend eine Vielzahl von Zelltypen transfizieren mit Spannung Sensoren in einem entsprechenden Plasmid, z. B. pcDNA3.1. Optimalen Ausdruck werden 24-48 h nach Transfektion.
  2. Substrate für die Zelle Saat vorzubereiten.
    1. 4, 35 mm Glasboden-Gerichte zu erwerben.
    2. Arbeiten in einer Zelle-Kultur-Haube, in einem 15 mL kanonische Rohr machen Sie 4 mL 10 µg/mL Fibronektin in Phosphat gepuffert (PBS) Kochsalzlösung mit sterilen PBS in der Zelle-Kultur-Haube. Invertieren Sie sanft die Röhre einmal zu mischen und lassen die Lösung für 5 min in der Zelle-Kultur-Haube zu sitzen.
      Hinweis: Die Konzentration oder die Art des ECM-Proteins eventuell für andere Zelltypen angepasst werden. Die Voraussetzungen sind für MEFs geeignet.
    3. Pipette 1 mL der Fibronektin-Lösung auf jedem Glasboden-Gericht.
    4. Lassen Sie die Fibronektin-Lösung auf dem Geschirr für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
    5. Aspirieren der Fibronektin-Lösung, einmal Spülen mit PBS, und fügen Sie 1 mL PBS.
  3. Samen der Zellen auf vorbereiteten Untergründen.
    1. Beginnen Sie mit den Zellen des Interesses am Zusammenfluss Prozentsatz für Zellfläche in der Kulturschale 6 cm.
      Hinweis: Verschiedene Zelltypen erfordert unterschiedliche Zelle Kulturbedingungen und Zellfläche Protokolle. Dieser Abschnitt enthält Richtlinien für MEFs geeignet. In der Regel werden MEFs bis 85 % Zusammenfluss vor Zellfläche angebaut.
    2. Arbeiten innerhalb einer Zelle Kultur Kapuze, spülen Sie die Zellen einmal mit 3 mL PBS. Fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA und 5 min bei 37 ° c inkubieren
    3. 6 cm Schüssel 3 mL komplette Medien hinzu, sammeln Sie die Zellen, und legen Sie in einem 15 mL konische Rohr.
      Hinweis: Komposition für komplette Medien hängt von den Zelltyp verwendet wird. Für MEFs, komplette Medien werden oft definiert als hohe Glukose Dulbecco geändert Eagle Medium mit 10 % fötalen Rinderserum, 1 % Antibiotikum-Antimykotikums (mit Amphotericin B, Penicillin und Streptomycin) und nicht-essentielle Aminosäure (NEAA) eine 1 % ige Lösung.
    4. Drehen Sie die Zellen nach unten mit 1000 X g für 5 min.
    5. Aspirieren Sie die Medien und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL der komplette Medien.
    6. Fibronektin-beschichtete Glasschalen PBS herausnehmen. Zählen der Zellen und 30.000 Zellen auf jeder Fibronektin-beschichtete Glasschale mit den entsprechenden komplette Medien für ein Endvolumen von 1,5 mL Samen.
      Hinweis: Diese Zelldichte eignet sich für MEFs und führt zu einer Bevölkerung der Zellen, die nicht berühren, aber nicht äußerst spärlich. Die exakte Zellzahl kann für andere Zelltypen oder anderen bildgebenden Kammer angepasst werden müssen.
    7. Lassen Sie die Zellen, für 4 h nach Aussaat zu verbreiten. Aspirieren Sie um 2 Uhr zu verbreiten die Wachstumsmedien, und spülen Sie einmal mit bildgebenden Medien, 1,5 mL der bildgebenden Medien verlassen.
      Hinweis: Diesmal Verbreitung eignet sich für MEFs aber möglicherweise für andere Zellen geändert werden müssen. Jedoch führt Inkubationszeiten von mehr als 6-8 h, die erhebliche Ablagerung von ECM Protein von Serum in die kompletten Medien. Imaging-Medien sollte sollte die gleichen Ergänzungen als komplette Medien enthalten jedoch optisch klar und nicht enthalten Substanzen, die in bildgebenden Kanäle wie Flavinen, fluoreszieren oder Fluoreszenz, wie Phenol rot zu stillen. Eine allgemein nützlichen bildgebenden Medien sind DMEM-Gfp Live Cell Visualisierung Medien mit 10 % FBS und 1 % NEAA Lösung ergänzt. Wenn Hintergrund Autofluoreszenz unannehmbar hoch ist, kann die Menge an Serum reduziert werden. Wenn ein Medienwechsel nach der anfänglichen Beschichtung nicht möglich ist, können die Zellen direkt im Bereich der bildgebenden Medien ergänzt mit einem Trypsin-Inhibitor Nukleinsäuretablette werden.

2. richten Sie Mikroskop für die Bildgebung

  1. Schalten Sie das Mikroskop.
    1. Schalten Sie die Bogenlampe zuerst.
      Hinweis: Eine Bogenlampe veröffentlichen ein elektromagnetischen Impulses, das andere Ausrüstung, das bereits beschädigen können auf.
    2. Schalten Sie das Rad Filtersteuerung, automatisierte Bühne Controller, Mikroskop-Computer-Interface und Kamera.
    3. Schalten Sie die FRAP-Laser und laser-Positions-Controller.
      Achtung: High-Power-Laser können Augen schädlich sein, wenn direkt angezeigt. Es wird empfohlen, konfigurieren Sie das Mikroskopsystem blockieren Laseranregung aus geleitet, die Auge-Stücke, die durch Verschieben eines Spiegels in den Strahlengang FRAP während bleichen reflektieren den Laser auf die Probe und verhindern die Übertragung erreicht werden kann um das Okular.
    4. Schalten Sie den Computer und offene Mikroskop-Steuerungs-Software.
    5. 15 min für die Bogenlampe und FRAP Laser zum Aufwärmen zu ermöglichen.
  2. Kalibrieren des FRAP-Lasers.
    1. Das Laser-Konfigurationsfenster zu öffnen. Stellen Sie Beleuchtung (bei Puls) auf die entsprechenden FRAP-Beleuchtung-Einstellungen für Laserbelichtung auf die Probe. Legen Sie Beleuchtung Einstellung (während der Bildgebung) auf die Beleuchtung Einstellungen für imaging nur den Akzeptor Fluorophor geeignet.
    2. Wählen Sie das Ziel, unter Koordinatensystem Einstellungzu kalibrieren. Deaktivieren Sie die Option Manuell klicken Kalibrierungspunkte und Anzeigen von Bildern während der Kalibrierungzu überprüfen.
    3. Die Verweilzeit auf 10.000 µs und die Anzahl der Impulse bis 100 einstellen.
    4. Ort der Kalibrierungs-Dias von Interkalation Bromid versiegelt zwischen einem Objektträger und einem Deckgläschen in den Phase-Adapter mit dem Deckglas Seite nach unten.
      Achtung: Interkalation Bromid ist ein Mutagen und mit Handschuhen behandelt werden sollen. Wenn die Folie gefährdet ist, nach der Institution Richtlinien entsorgen.
    5. Verwenden Sie die Akzeptor Beleuchtung Einstellungen sich auf der Oberfläche der Folie, als der Brennebene mit dem hellsten Signal erkennbar. Kleine Fehler in der Beschichtung ist in der Fokussierung Hilfe sichtbar.
    6. Bewegen Sie den Schlitten zu einem Gebiet mit einheitlichen Fluoreszenz in der Abbildungsebene.
    7. Klicken Sie auf die Einstellung zu schaffen. Die Software wird die Kalibrierung automatisch bleich- und Erkennung der Position des gebleichten Punktes initialisieren.
    8. Erfolgreiche Kalibrierung durch das endgültige Bild, werden eine 3 x 3-Raster von gebleichtem Punkten, die gleichmäßig verteilt werden sollen und im Fokus der Beurteilung zu gewährleisten. Speichern Sie die Kalibrierung Bild zum Nachschlagen.
    9. Die Kalibrierungs-Dias zu entfernen und sicher zu verstauen. Kalibrierung vor Beginn jedes Experiment durchgeführt werden, aber nicht zwischen Proben durchgeführt werden müssen.

3. Wählen Sie Parameter für die Bund-Bildgebung

  1. Update einer der generierten Proben der Zellen mit dem Ausdruck des Spannung Sensors mit 4 % Paraformaldehyd für 10 min. Paraformaldehyd Lösung sollte Methanol frei, werden oft als EM-Klasse, um zu verhindern, Denaturierung von fluoreszierenden Proteinen. Legen Sie mit PBS-Puffer nach der Fixierung.
    Achtung: Paraformaldehyd Lösungen sind giftig. Dieser Schritt sollte in einem Abzug durchgeführt werden und die Lösung sollte nach institutionellen Richtlinien entsorgt werden.
    Hinweis: Diese Optimierung hängt nicht von Proteindynamik und eine feste Probe ermöglicht maximale bildgebenden Zeit ohne sich Gedanken über Zellgesundheit.
  2. Spülen Sie die Probe dreimal mit PBS und lassen in PBS.
    Hinweis: Die meisten kommerziell verfügbaren Montage Mediennutzung Fluorophor Eigenschaften wirken machen die Probe ungeeignet für Bund imaging-54. Im Idealfall die Zellen werden sofort abgebildet werden, sondern können bei 4 ° c über Nacht bleiben Längere Wartezeiten führt zu Verschlechterung der Probe.
  3. Legen Sie die Probe in den Mikroskop-Bühne-Halter für die Bildgebung.
  4. Öffnen Sie das Tool Multi-Dimensional Erwerb (MDA). Eine sequentielle Bildgebung der drei Kanäle zu etablieren: Akzeptor einzige Anregung und Emission (Akzeptor-Kanal), Spender Erregung und Akzeptor Emission (Bund Kanal), und Geber nur Anregung und Emission (Geber-Kanal).
    Hinweis: Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten, um Bild-FRET-Proben. Die 3-Kanal oder "drei-Cube" Methode der Bildgebung gepaart mit Mitteln der Kalibrierung des Systems zur Messung der FRET-Effizienz empfiehlt sich für Bund-basierte Spannung Sensoren55,56. Dieser Ansatz ist schnell, einfach, zerstörungsfreien und erfordert nur eine standard Fluoreszenz imaging Mikroskop ermöglicht den Vergleich von Experimenten über verschiedene Tage und imaging-Setups.
  5. Scannen Sie die Probe mit einer Belichtungszeit von 500 ms und eine neutrale Dichte (ND) Filter von 10 %. Eine Zelle mit dem Ausdruck des Spannung Sensors mit klaren Lokalisierung eine Struktur von Interesse zu finden.
  6. Wählen Sie eine Belichtungszeit von 500 ms oder die gewünschte Länge für jede imaging Channel und ein ND-Filter von 100 % und erwerben Sie ein Bund Bildsequenz zu.
  7. Schätzen Sie die durchschnittliche Intensität des Sensors auf der subzellulären Strukturen von Interesse in jedem bildgebenden Kanal. Geringe Signale führen zu ungenauen Ergebnissen aufgrund unsachgemäßer Korrektur Schätzungen, Nichtlinearitäten in Detektoren oder bedeutenden Beitrag von Hintergrund-Signalen. Eine ungefähre Richtlinie für Intensitäten über 10 % von den Dynamikbereich der Kamera Ziel ist (zB., für eine 16-Bit-Kamera sollte Intensitäten über 6.000).
    Hinweis: Identische optische Einstellungen (Belichtungszeiten, Filter, Ziele und andere Variablen wie Kameraverstärkung oder binning) müssen für alle Bund-Experimente verwendet werden, die verglichen werden. Änderung dieser Einstellungen führen zu einer Änderung in der Höhe Bund, die entweder generiert und/oder in der Mikroskopie-Setup erkannt. FRET-Effizienz-Messungen sind unabhängig von dieser Einstellung, die Kalibrierfaktoren zur Bestimmung der FRET-Effizienz jedoch nicht. In der Theorie verschiedene Sätze von Kalibrierfaktoren FRET-Effizienz aus verschiedenen optischen Einstellungen generieren verwendet werden könnten, aber dies wird nicht empfohlen. Bleaching oder Phototoxizität kann zwischen den verschiedenen Einstellungen erstellen falsche Ergebnisse unterschiedlich sein.
  8. Erwerben Sie einen zweiten Bund Bildsequenz der gleichen Sichtfeld. Immunofluoreszenz zwischen Frames durch den Vergleich durchschnittlichen Intensität des Sensors in jedem bildgebenden Kanal zu schätzen. Immunofluoreszenz sollte auf ein Minimum, vorzugsweise weniger als 1-5 % Verlust des Signals gehalten werden.
  9. Passen Sie die bildgebenden Parameter um die Intensität zu maximieren bei gleichzeitiger Minimierung der Immunofluoreszenz. Für grobe Einstellungen ändern des ND-Filters während der Akquisition verwendet wird. Für feinere Einstellungen ändern Sie die Belichtungszeit in Schritten von 250 ms.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 3,5 – 3,8 bis ausreichende Signal erreicht werden kann, bei gleichzeitiger Minimierung der Immunofluoreszenz.
    Hinweis: In der Regel sind Einstellungen für die Vinkulin Spannung Sensor in Vinkulin- / - MEFs 1.500 ms, 1.500 ms und 1000 ms für den Spender, Bund und Akzeptor Kanal bzw.. Die optimalen Werte variiert mit der Art der Beleuchtung, Objektive, Filtersätze und Ausdruck Sensorebene.

4. Wählen Sie Parameter für die Bildgebung FRAP

  1. Optimieren Sie die Lasereinstellungen, um sicherzustellen, komplette Bleichen der Region of Interest (ROI) ohne lichtbedingten verursachen oder Bleichen der näheren Umgebung.
    1. Einer der generierten Proben der Zellen mit dem Ausdruck des Spannung Sensors mit 4 % Paraformaldehyd für 10 min zu beheben.
      Hinweis: Diese Optimierung hängt nicht von Proteindynamik und eine feste Probe ermöglicht maximale bildgebenden Zeit ohne sich Gedanken über Zellgesundheit. Dies verhindert auch die Rückgewinnung von Bleichen durch mobile Proteine, so dass für die Isolierung von Bleachings, Vermeidung von Nebenwirkungen von rapid, Diffusion-vermittelten Fluoreszenz Erholung zwischen der Inzidenz von Bleichen und nehmen die erste Bild wird nach dem Bleichen.
      Achtung: Paraformaldehyd Lösungen sind giftig. Dieser Schritt sollte in einem Abzug durchgeführt werden und die Lösung sollte nach institutionellen Richtlinien entsorgt werden.
    2. Spülen Sie die Probe 3 Mal mit PBS und lassen in PBS.
      Hinweis: Die Verwendung von die meisten kommerziell verfügbaren Montage Medien wirken Fluorophor Eigenschaften, so dass die Probe nicht geeignet für FRAP imaging-54. Im Idealfall die Zellen werden sofort abgebildet werden, sondern können bei 4 ° c über Nacht bleiben Längere Wartezeiten führt zu Verschlechterung der Probe.
    3. Legen Sie die Probe in den Mikroskop-Bühne-Halter für die Bildgebung.
    4. Das Laser-Konfigurationsfenster zu öffnen. Beginnen Sie mit der Einstellung einer Laser-Verweilzeit von 1.000 µs und 10 Impulse, was bedeutet, dass jeder Ort im Scan über den ROI 10.000 µs Full-Power-Laser erhalten
      Hinweis: Ein 500 mW, 515 nm Laser wurde zum Bleichen verwendet. Dies wurde gewählt, um selektiv Venus A206K, den Akzeptor in Vinkulin Spannung Sensor, mit maximaler Effizienz zu bleichen. Wenn Spannung FRET-basierte Sensoren mit anderen fluoreszierende Proteine verwendet werden, möglicherweise eine andere Art von Laser eingesetzt werden.
    5. Eine Zelle mit dem Ausdruck des Spannung Sensors mit klaren Lokalisierung eine Struktur von Interesse zu finden und ein Bild zu erwerben.
    6. Zeichnen Sie einen rechteckige ROI Szenariobereichs zu bleichen und den ROI-Standort speichern. Puls der Laser. Ein anderes Bild der Probe ausrichten.
      Hinweis: Die Größe sollte etwa so groß wie die gesamte FA. Sollten darauf achten, dass die Kastengröße nicht drastisch über Experimente variieren. Die gebleichte Bereich muss in Proteinen sorgfältig überwacht werden, deren Dynamik durch Diffusion betroffen sind. Dies ist eine potenzielle Gefahr in transmembranen Proteine, wie z.B. Cadherine47, oder Proteine, die27,57langsam zu verbreiten.
    7. Überprüfen Sie die Qualität der Immunofluoreszenz, indem Sie überprüfen, dass der gesamte ROI gebleicht ist, derart, dass die Intensität in der Nähe von Hintergrund-Niveaus. Stellen Sie außerdem sicher, dass es keine bleichen außerhalb des ROI.
    8. Passen Sie die Lasereinstellungen an, wie notwendig, um eine erhebliche Menge an bleichen innerhalb der ROI ohne signifikante bleichen außerhalb der ROI zu erzielen. Heben Sie für grobe Anpassungen und senken Sie die Verweilzeit in Schritten von 100 µs und für Feineinstellungen, heben Sie und senken Sie die Anzahl der Impulse in Schritten von 5 Impulse.
    9. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.5 – 4.1.8 bis zum Erreichen der minimalen Einstellungen, an denen der ROI vollständig ohne Ziel Immunofluoreszenz gebleicht.
      Hinweis: Einen wesentliche bleichen Anfangswert ohne Induktion Phototoxizität zu erreichen ist ein Schlüsselaspekt der FRAP-Analyse. Verwenden Sie die Lasereinstellungen, die ein komplettes Bleichmittel in den festen Proben führen. Im Allgemeinen sollte die minimale Anzahl der Photonen verwendet werden, um den gewünschten bleichen zu erreichen. Auch sollte das bleichende Protokoll während der Experimente, relativ konsistent gehalten werden, da Veränderungen Messungen des Proteins Dynamik58beeinflussen können.
  2. Zeitraffer-Parameter, um die Dynamik des Proteins des Interesses voll zu erfassen, bei gleichzeitiger Minimierung der Immunofluoreszenz zu optimieren.
    1. Bereiten Sie die Mikroskopie-Set-up für das live Cell Imaging, vorzugsweise mit einem beheizten Objekttisch sowie Ziel und CO2 -Regler. 20 min equilibrate lassen.
      Hinweis: Um die Gesundheit der abgebildeten Zellen beizubehalten, Temperatur und pH-Wert in der bildgebenden Gefäß einzuhalten. Eine Vielzahl von beheizten Stufen und objektiven Heizungen kann leicht pflegen die Zellentemperatur bei 37 ° C. Die Kontrolle des pH-Wertes für viele Medien-Typen kann erreicht werden durch die Verwendung einer peristaltischen Pumpe Pass befeuchtet 5 % CO2 über die Probe 15 mL/min. Alternativ, wenn CO2 -Steuerelement ist nicht verfügbar, live imaging Medium mit HEPES sollte verwendet werden, um großen pH-Änderungen zu verhindern.
    2. Platz eins der generierten Proben der Zellen mit dem Ausdruck des Spannung Sensors in den Mikroskop-Bühne-Halter für die Bildgebung. Für 10 min equilibrate lassen.
    3. Mit dem MDA-Tool richten Sie ein Zeitraffer, 3-5 Bilder vorab zu bleichen, bleichen die ROI sowie weiter einnehmen, 10-60 Bilder zu erwerben.
      Hinweis: Für Vinkulin bei FAs, imaging-alle 5 s für 5 min nach dem Bleichen ist ausreichend, um die Dynamik zu beobachten, ohne übermäßige bleichen31einzuführen. In der Literatur47,48,59,60finden nützliche Ansatzpunkte für bildgebende Preis und Dauer für viele andere Proteine.
    4. Verwenden Sie Akzeptor imaging-Einstellungen, die die Belichtung der Probe, zu minimieren und gleichzeitig eine ausreichende Signal-Rausch-Verhältnis, um die Struktur von Interesse Bild. Ein guter Ausgangspunkt ist die Hälfte der ND Filter und Belichtung Zeit notwendig, für die Darstellung von den Akzeptor beim Bund.
    5. Suchen Sie eine Zelle mit dem Ausdruck des Spannung Sensors mit klaren Lokalisierung eine Struktur von Interesse und snap ein Bild.
    6. Zeichnen Sie einen rechteckige ROI um zu markieren wo Bleichmittel und den ROI-Standort speichern. Initiieren Sie den Zeitraffer.
    7. Den resultierenden Satz von Bildern auf potenzielle Probleme zu untersuchen.
      1. Wenn gibt es erhebliche Sprünge, die Fluoreszenz-Erholung zwischen den Frames (größer als 10 % der ursprünglichen Intensität), reduzieren Sie den Zeitschritt zwischen Frames.
      2. Gibt es ein bedeutenden globalen Verlust der Fluoreszenz im Laufe der Zeit (mehr als 5 bis 10 % der ursprünglichen Intensität), verringern Sie die Anzahl der Bilder, die nach dem Bleichmittel und/oder Einstellungen Sie die bildgebenden zur Verringerung der Exposition der Probe ans Licht.
      3. Wenn Fluoreszenz Erholung nicht bis zum Jahresende den Zeitraffer Plateau hat, erhöhen Sie die Gesamtlänge von den Zeitraffer.
    8. Passen Sie die Zeitraffer-Parameter entsprechend an, und wiederholen Sie Schritte 4.2.5 – 4.2.7 bis die Fluoreszenz Erholung ausreichend ohne globale Foto-Schäden an der Probe erfasst wird.

5. Bund-FRAP Daten erfassen

  1. Bereiten Sie die Mikroskopie-Set-up für das live Cell Imaging, vorzugsweise mit einem beheizten Objekttisch sowie Ziel und CO2 -Regler. 20 min equilibrate lassen.
    1. Um die Integrität der abgebildeten Zellen sicherzustellen, behalten Sie die Temperatur bei 37 ° C in der bildgebenden Kammer. Verwendung einer peristaltischen Pumpe übergeben befeuchtet 5 % CO2 über der Probe mit 15 mL/min um den pH-Wert zu erhalten.
    2. Alternativ wenn CO2 Steuerelement nicht verfügbar ist, können Sie live-Image-Medien mit HEPES um große pH-Wert-Änderungen zu verhindern.
  2. Öffnen Sie das MDA-Tool und richten Sie mit Bund imaging-Parameter, unter anderem die verschiedenen Filter-Sets.
  3. Dieser MDA in den experimentellen Ordner mit dem Namen des MDA_FRET_Datezu retten.
  4. Ein weiterer MDA mit FRAP imaging-Parameter, einschließlich die verschiedenen Filter-Sets, die Time-Lapse-Einstellungen und das Journal den Laser nach Pre-Bleichmittel Übernahme Puls eingerichtet.
  5. Dieser MDA in den experimentellen Ordner mit dem Namen des MDA_FRAP_Datezu retten. Das MDA-Fenster zu schließen.
  6. Wählen Sie in der Symbolleiste am oberen Rand des Bildschirms, Journal | Starten Sie die Aufnahme.
  7. Das MDA-Fenster zu öffnen, Laden des MDA_FRET_Date Staates und drücken Sie erwerben. Dann laden Sie den MDA_FRAP_Date -Zustand und drücken Sie erwerben.
  8. Am Ende des Erwerbs in der Symbolleiste am oberen Rand des Bildschirms wählen Sie Journal | Beenden Sie die Aufnahme.
  9. Dieser Zeitschrift auf die experimentelle Ordner mit dem Namen FRETFRAP_Date speichern und Hinzufügen einer Symbolleiste für einfachen Zugang. Das MDA-Fenster zu schließen.
  10. Platz eins der generierten Proben der Zellen mit dem Ausdruck des Spannung Sensors in den Mikroskop-Halter für die Bildgebung. Für 10 min equilibrate lassen.
  11. Navigieren Sie die Probe mit der Bildaufnahme unter Acquire | Erwerben mit minimalen Zeit- und ND Filtern, um die Zellen von Interesse zu identifizieren.
  12. Kontinuierlicher Autofokus durch navigieren zu Geräten eingestellt | Schwerpunkt. Manuell fokussieren Sie auf die Probe bis zum Erreichen der korrekten Abbildungsebene.
  13. Klicken Sie Kontinuierlicher Fokus festlegen, warten Sie, bis das System anpassen, und klicken Sie auf Starten kontinuierliche Fokussierung.
    Hinweis: Dies ist nicht erforderlich, aber Qualität der FRAP Erholung Kurven deutlich verbessert, weil es verhindert, dass die Probe driften Out-of-Focus.
  14. Suchen Sie eine Zelle mit dem Ausdruck des Spannung Sensors mit klaren Lokalisierung eine Struktur von Interesse und snap ein Bild.
  15. Zeichnen Sie einen rechteckige ROI um wo Sie bleichen zu markieren. Speichern Sie den ROI-Standort.
  16. Initialisieren der FRETFRAP_Date Zeitschrift, die den Erwerb von FRET-Bilder, gefolgt von der Initialisierung des Time-Lapse FRAP beginnen wird.
  17. Wiederholen Sie die Schritte 5.14-5.16 bis 10-15 Bildsätze erworben werden.
    Hinweis: Die Messung nicht in derselben Zelle wiederholt werden. Sobald Immunofluoreszenz auftritt, ist Bund Daten unzuverlässig.

(6) Bund FRAP Daten analysieren

  1. Analysieren Sie die Bund-Bilder mit der Software der Wahl.
    Hinweis: Es gibt mehrere Möglichkeiten, um Bild und quantitate Bund61, einschließlich ratiometrischen Bund62 und Bund Index34,35. Es ist jedoch dringend empfohlen, die Schätzungen der FRET-Effizienz-55,-63 für die Interpretation der Bund FRAP Daten verwenden. Siehe die Diskussion für die weitere Erforschung dieses Themas. Für sensibilisierten Emissions- und Berechnung der FRET-Effizienz ist Individualsoftware von Hoffman Labor bei https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public erhältlich.
  2. Quantifizieren Sie die relevanten Parameter für jede subzelluläre Struktur, die gebleicht wurde. Dies sollte mittlere Bund Index/Effizienz und durchschnittlichen ersten Akzeptor Intensità ¤ t (proportional zur Konzentration) unter anderem könnte auch physikalische Parameter wie ROI Größe umfassen.
  3. Analysieren Sie die FRAP-Bilder mit der Software der Wahl.
    Hinweis: Es gibt mehrere Möglichkeiten, FRAP26,27,28,29quantitate. Experimentelle Kernanliegen gehören Buchhaltung zum Bleichen während der Post-Bleichmittel imaging, Änderungen im Hintergrundintensität und Translokation von hochdynamischen subzellulären Strukturen, wie z. B. fokalen Adhäsionen. Bleaching, Korrekturen und Schwankungen der Hintergrundbeleuchtung kann durch die Analyse der nicht gebleicht und nicht-fluoreszierende Regionen der Bilder erreicht werden. Hochdynamische subzellulären Strukturen, insbesondere übermäßige Wachstum oder Demontage Dynamik zeigt FRAP Standardanalysen unvereinbar sind und sollte nicht analysiert werden. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von Möglichkeiten, um die Daten zu normieren. Die angegebenen Richtlinien sind für die einfachste Analyse.
  4. Die Wiederherstellungsdaten zum Bleichen Effekte zu korrigieren und dann um Intensitäten Pre bleichen normalisieren. Quantifizieren Sie die halbe Zeit der Erholung und der mobilen Anteil entsprechend der folgenden Gleichung28,34:
    MF - (MF - R-o) e-kt
    wo MF mobile Bruchteil, Ro ist die anfängliche Erholung und k ist die Wiederfindungsrate. Die halbe Zeit der Erholung wird bestimmt durch:
    Τ1/2 = ln 2/k.
    Hinweis: Es gibt eine Vielzahl von öffentlich verfügbaren Software-Pakete für den Abschluss dieser Analysen64 sowie eine Vielzahl von ImageJ Plugins. Individualsoftware ist das Hoffman-Lab an der https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public ab. Weitere Analysen sollte verwendet werden, für die Situationen, wo die Diffusion beeinflusst die Dynamik des Proteins des Interesses, mehrere Zeitskalen sind offensichtlich in die Erholung oder nicht standardmäßige bleichende Geometrien verwendet werden.

7. Bund FRAP Daten interpretieren

  1. Relevante Informationen für jedes ROI einschließlich kompilieren: FRET-Index/Effizienz, Akzeptor Intensität, FRAP Halbzeit FRAP mobile Bruchteil.
    Hinweis: Bund Index oder Effizienz dient zum Durchschnittsbelastung über das Protein in den ROI zu bestimmen. Akzeptor Intensität misst die lokale Konzentration des Proteins. Die Hälfte der Zeit der Erholung ist ein Maß für Proteindynamik. Ein kleiner Halbzeit zeigt schneller Umsatz. FRAP mobile Bruchteil misst die Menge an Protein in den ROI, die aktiv umdrehen. Ein größerer mobilen Teil gibt an, dass ein größerer Anteil des Proteins innerhalb der ROI umdrehen.
  2. Um die Wirkung der lokalen Konzentration auf Protein Fluktuationsrate und Menge Sonde, Grundstück FRAP Halbzeit und mobilen Fraktion gegen anfängliche Akzeptor Intensität.
  3. Um die Wirkung von Protein Last auf Protein Fluktuationsrate und Menge Sonde, Grundstück FRAP Halbzeit und mobilen Fraktion gegen FRET-Index/Effizienz.
    Hinweis: Je nach Protein oder Struktur, kann es auch interessant zu untersuchen, Beeinflussung von physikalischen Parametern, wie z. B. Strukturgröße oder Exzentrizität, Protein Last bzw. Umsatz sein.

Ergebnisse

Bund-FRAP setzt sich aus der Kombination von zwei fluoreszierende Techniken, Bund und FRAP. Da wir auf die Auswirkungen der Protein-Last, verwendeten wir Spannung FRET-basierte Sensoren34,46. Diese Sensoren basieren häufig auf eine Spannung Sensor Modul bestehend aus zwei fluoreszierende Proteine, wie mTFP1 und VenusA206K, verbunden durch eine birnenförmige Linker (Abbildung 1A). Wenn das Modul zwis...

Diskussion

Die Bund-FRAP-Methode ermöglicht direkte Messung von Kraft-Sensitive Protein Dynamics, eine Eigenschaft, die schwierig war, direkt in lebenden Zellen zu untersuchen. Die Empfindlichkeit der Proteindynamik molekulare Belastung ist entscheidend für die Funktion des Proteins als Kraft Sender oder Wandler. Beladung ist erforderlich für die Übertragung der beiden intern generierten und äußerlicher Anwendung Kräfte, genannt Mechanotransmission und für die Umwandlung von jenen Kräften in biochemisch nachweisbar Signale...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den National Science Foundation CAREER Award (NSF-CMMI-14-54257) sowie Zuschüsse aus der American Heart Association (16GRNT30930019) und die National Institutes of Health (R01GM121739-01) verliehen an Dr. Brenton Hoffman und Angehöriger unterstützt. Science Foundation Graduate Research Fellowship an Katheryn Rothenberg vergeben. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der NSF oder NIH.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher25300062
16% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences30525-89-4
60x Objective NA1.35OlympusUPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)Gibco15240-062
Automated StagePrior ScientificH117EIX3
Custom Dichroic MirrorChroma Technology CorpT450/514rpc
Custom mTFP1 Emission FilterChroma Technology CorpET485/20m
Custom mTFP1 Excitation FilterChroma Technology CorpET450/30x
Custom Venus Excitation FilterChroma Technology CorpET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization MediumSapphireMC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma AldrichD5796with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine SerumHyCloneSH30396.03
Fibronectin, HumanCorning47743-654
FRAPPA Calibration SlideAndorprovided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm LaserAndor
Glass-bottomed Fluoro DishesWorld Precision InstrumentsFD35
HEK293-T CellsATCCCRL-3216
Hexadimethrine Bromide, PolybreneSigma AldrichH9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigma AldrichD6429
Inverted Fluorescent MicroscopeOlympusIX83
JMP Pro SoftwareSAS
Lambda 10-3 Motorized Filter WheelsSutter InstrumentsLB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon BulbSutter InstrumentsLS/OF30
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027
MATLAB SoftwareMathworks
MEM Non-Essential Amino AcidsThermo Fisher11140050
MetaMorph for OlympusOlympus
Micro-Humidification SystemBioptechs130708
MoFlo Astrios EQ Cell SorterBeckman CoulterB25982
Objective Heater MediumBioptechs150819-13
OptiMEMThermo Fisher31985070
Phosphate Buffered SalineSigma AldrichD8537
pMD2.G Envelope PlasmidAddgene12259
pRRL Vectorgift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging PlasmidAddgene12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 CameraHamamatsu PhotonicsC11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF CentrifugeThermo Fisher75004505
Stable Z Stage WarmerBioptechs403-1926
Venus Emission FilterSemrockFF01-571/72

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