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Résumé

Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation simultanée de Förster resonance capteurs tension axée sur le transfert de l’énergie pour mesurer la récupération de charge et de fluorescence de protéine après photoblanchiment pour mesurer la dynamique des protéines permettant la mesure de force-sensibles dynamique des protéines dans des cellules vivantes.

Résumé

Les cellules détectent et répondent à des stimuli physiques dans leur environnement en convertissant des stimuli mécaniques en signaux biochimiquement détectables dans un processus appelé la mécanotransduction. Une étape cruciale dans la mécanotransduction est la transmission des forces entre les environnements externes et internes. Pour transmettre des forces, il doit y avoir une liaison physique soutenue et ininterrompue, créée par une série d’interactions protéine-protéine. Pour une interaction protéine-protéine donnée, charge mécanique ne peut non plus avoir aucun effet sur l’interaction, entraîner une dissociation plus rapide de l’interaction, ou même stabilise l’interaction. Comprendre comment moléculaire charge dicte de renouvellement des protéines dans les cellules vivantes peut fournir des informations précieuses sur l’état mécanique d’une protéine, à son tour élucider son rôle dans la mécanotransduction. Les techniques existantes pour mesurer la dynamique des protéines sensibles à la force n’ont pas des mesures directes de la charge protéique ou s’appuient sur les mesures effectuées en dehors du contexte cellulaire. Nous décrivons ici un protocole pour la récupération Förster resonance energy transfert-fluorescence après photoblanchiment (FRAP-frette) technique, qui permet la mesure de la dynamique des protéines sensibles à la force dans des cellules vivantes. Cette technique est potentiellement applicable à n’importe quel capteur de tension axée sur la frette, facilitant l’étude de la dynamique des protéines sensibles à la force dans diverses structures subcellulaires et dans différents types de cellules.

Introduction

L’environnement extracellulaire est une source riche d’indices biochimiques et physiques qui régissent le comportement de la cellule. En particulier, la nature physique du microenvironnement peut médier principales fonctions cellulaires, y compris la croissance cellulaire, migration et différenciation1,2,3,4. Le dérèglement de la mécanique du microenvironnement est une composante essentielle pour beaucoup de maladies qui n’ont pas encore de traitements adéquats, tels que le cancer5, athérosclérose6et7de la fibrose. Bien comprendre comment les cellules convertissent des stimuli physiques en signaux détectables biochimiquement, un processus appelé mécanotransduction, exige l’élucidation des mécanismes moléculaires médiation transmission de force, dans et hors des cellules et au sein de plusieurs structures subcellulaires.

À l’intérieur des structures subcellulaires, les protéines sont tournent constamment la liaison et la séparation basée sur la force de leurs interactions avec les partenaires8de fixation. Pour les forces à être transmis avec succès à travers une distance physique, il doivent y avoir une chaîne ininterrompue d’interactions protéine-protéine, ce qui signifie que le chiffre d’affaires de la protéine doit être suffisamment lente pour maintenir et transmettre la force à son partenaire de liaison9. Alors que les interactions protéines-protéines sont généralement consistent de plusieurs non-liaisons covalentes entre les domaines de la protéine, l’interaction est souvent conceptualisée comme un État lié qui peut passer à un État indépendant sous différentes conditions10, 11. pour une interaction protéine-protéine donnée, il est possible que la force peut avoir no effet sur la durée de vie de l’interaction, connue comme un « bond idéal », réduire la durée de vie de l’interaction, connue comme un « lien de glissement » ou augmenter la durée de vie de l’interaction , connu comme un « bond de capture »10. Ainsi, il y a une relation entre charge protéique et la dynamique des protéines que nous désignons comme sensibles à la force dynamique.

Vers la compréhension de l’effet de la charge sur la dynamique de liaison, un certain nombre d’expériences très instructifs ont été réalisé au niveau de la molécule unique. À l’aide de protéines isolées, ou fragments de protéines et de techniques de manipulation comme magnétique pincettes, pinces optiques et microscopie à force atomique, ces études ont démontré les interactions protéines sensibles à la force pour plusieurs pertinentes protéines11,12. Les deux intégrines13 et cadhérines14, qui sont des protéines transmembranaires importants pour former des interactions cellule-matrice et les cellules, respectivement, ont montré des altérations dans la dynamique due pour charger. Au sein de la cellule, vinculine est recruté pour les deux talin15 et α-caténine16 en fonction de la force et peut former une liaison de catch avec l’actine17, indiquant un rôle crucial pour la vinculine adhérences focales (FAs) et jonctions adherens (AJs ) sous charge. Études de molécules simples permettant l’isolement des interactions protéine-protéine spécifique et donnent des résultats sans ambiguïté, mais ils ne tiennent pas compte de la complexité de l’environnement cellulaire.

Point de repère expériences ont démontré que plusieurs structures subcellulaires, dont le syndrome et AJs, sont mécanosensibles et pièce Assemblée améliorée en réponse aux charges interne ou externe appliqué18,19, 20,21,22. En outre, plusieurs modèles théoriques ont suggéré que l’Assemblée mécanosensibles pourrait être pilotée par protéines sensibles à la force dynamique23,24,25. Pour examiner ces dynamiques sensibles à la force dans des cellules vivantes, quelques approches indirectes ont été prises. PAF et les techniques connexes fournissent une méthode relativement simple pour mesurer la dynamique des protéines en cellules26,27,28,29. Toutefois, la mesure de la charge de la protéine a été plus limitée. Une approche classique consiste à comparer la dynamique des protéines dans les cellules avec et sans l’exposition à un inhibiteur du cytosquelette utilisé pour réduire l’ensemble cellule contractilité8,30,31. Sur le plan conceptuel, il s’agit d’une comparaison entre une charge élevée et un état de faible charge. Cependant, il n’y a aucune quantification de la charge dans l’ensemble de la protéine dans aucun des États, et il peut y avoir des effets biochimiques involontaires de l’inhibiteur, telle la perte de sites de fixation clés le long d’un filament d’actine F. Une autre approche, spécifique au FAs, a consisté à mesurer l’effort de force totale sur le substrat par la FA à l’aide de la microscopie à force traction approximative charge moléculaire et d’examiner la relation avec la dynamique d’une seule protéine au sein de la FA32. Tandis que cette approche permet la quantification de l’ensemble de la population, il ne fournit pas des informations moléculaires spécifiques. SAF est constitués de plus de 200 protéines différentes, dont beaucoup peuvent supporter la charge33. Ainsi, mesurer l’intensité de la force totale d’une FA potentiellement obscurcit la possibilité de plusieurs voies de transmission de force et fiable, ne fournit pas une mesure de la charge sur une protéine spécifique.

Contrairement aux approches antérieures en mécanobiologie, l’avènement des capteurs de tension axée sur la frette permet directement les cellules de mesure des charges subies par les protéines spécifiques à l’intérieur de vie34,35,,36. Nous présentons ici un protocole qui associe des capteurs de tension axée sur la frette FRAP-mesure de la dynamique des protéines. Nous appelons cette technique FRAP-frette. Cette approche permet la mesure simultanée de la charge protéique et de la dynamique des protéines, ce qui permet l’évaluation de la dynamique des protéines sensibles à la force dans les cellules vivantes (Figure 1). Déjà, la frette-FRAP technique a été appliquée à l’étude de la dynamique de la force-sensibles de l’éditeur de liens mécaniques protéine vinculine37. Capteurs de tension ont été développées pour nombreuses protéines qui sont pertinentes dans une variété de structures subcellulaires. Par exemple, les capteurs ont été développés pour la vinculine34 et talin38,39 FAs, cadhérines et caténines AJs40,41,42, nesprin dans le complexe de LINC nucléaire 43, α-actinine44 et filamine36 dans le cytosquelette et MUC-1 dans le glycocalyx45, entre autres46. De même, le FRAP est qu'une technique couramment utilisée a été utilisée sur les protéines de mécanosensibles dans les adhérences focales8,31, adherens jonctions47, actine cortex26et noyau48. Aller de l’avant, que la frette-FRAP technique devrait être largement applicable à l’un de ces capteurs existants ou nouvellement développé capteurs, permettant les mesures de la dynamique de la force-sensibles dans une grande variété de contextes et de structures subcellulaires. À cette fin, nous fournissons un protocole détaillé, généralisé de mise en oeuvre de la technique de la frette-FRAP applicable dans ces différents systèmes. J’espère que cela permettra une grande variété d’expériences élucider les rôles de diverses protéines de mécanosensibles dans la régulation de transmission de la force et dans la médiation de comportement de la cellule.

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Protocole

1. générer des échantillons pour l’imagerie

  1. Stablement express tension capteur construct dans type de cellule souhaité.
    1. Cloner tension capteur construct dans pRRL vecteur ou autres plasmides d’expression virale.
      Remarque : Plusieurs outils de clonage moléculaires différents sont disponibles pour réaliser cette étape, y compris l’utilisation des enzymes de restriction, se chevauchent extension et Gibson Assemblée35. Le vecteur pRRL est utilisé dans lenti transduction virale et permet un degré substantiel de la production de protéines grâce à l’utilisation du promoteur humain cytomégalovirus (CMV). Différents vecteurs peuvent être nécessaires pour un contexte particulier. Par exemple, le promoteur du CMV est réduit au silence dans certains types de cellules49. En outre, uniquement axée sur la frette capteurs contenant la protéine fluorescente ce manque forte homologie, tels que mTFP1 et A206K de Vénus, peut servir à créer des lignées cellulaires stables. Capteurs contenant une protéine fluorescente cyan et protéine fluorescente jaune sera probablement soumis à50de la recombinaison homologue.
    2. Générer des lentivirus dans des cellules de rein humain embryonnaire (HEK) 293 t à l’aide de psPax2 et plasmides d’emballage de pMD2.G à l’aide de virus standard production méthodes51.
      ATTENTION : Lentivirus seulement doivent être manipulés que par du personnel qualifié dans un environnement de laboratoire de niveau 2 de biosécurité.
      Remarque : Cette combinaison de cellules et de plasmides d’emballage est conçue pour fonctionner au pRRL. Autres systèmes peuvent être nécessaires avec les autres vecteurs.
    3. Transduce cellules souhaitées par le virus à l’aide de protocoles standard de transduction52 et cytométrie permet de trier les cellules de53 en sélectionnant une population homogène exprimant chaque construction à taux endogènes environ37. Après la sélection de cellule, expériences peuvent être effectuées immédiatement, ou cellules peuvent être cryogéniquement congelés pour une utilisation ultérieure. Ne pas dépasser les 2 cycles de gel-dégel sur une lignée cellulaire stable donné.
      Remarque : L’utilisation de lignées cellulaires déficientes dans la protéine d’être étudiées (p. ex., MEFs vinculine- / - pour l’utilisation avec le capteur de tension vinculine) va augmenter le signal à bruit ratio dans les expériences de FRET ainsi que limiter les artefacts de la surexpression. Ces lignes de fibroblastes embryonnaires (MEF) de souris stable peuvent être utilisés pour environ 15 passages avant une perte significative de l’expression ou la dégradation des capteurs est apparente. Si vous ne désirez pas méthodes virales, une pléthore de réactifs commerciaux peut être utilisée selon le protocole du fabricant à transfecter transitoirement une variété de types de cellules avec des capteurs de tension dans un plasmide approprié, tel que pcDNA3.1. Une expression optimale sera de 24 à 48 h après la transfection.
  2. Préparation des substrats pour l’ensemencement de la cellule.
    1. Acquérir 4, plats de 35 mm à fond de verre.
    2. Travailler sous une hotte de culture cellulaire, dans un tube de 15 mL canonique, faire 4 mL de 10 µg/mL la fibronectine dans tamponnée au phosphate (PBS) du sérum physiologique à l’aide de PBS stérile dans la hotte de la culture cellulaire. Retourner doucement le tube une fois pour mélanger et laissez la solution reposer pendant 5 min dans le capot de la culture cellulaire.
      Remarque : La concentration ou le type de protéine, ECM peut avoir à régler pour les autres types de cellules. Les conditions prévues sont adaptées pour les MEFs.
    3. Pipette 1 mL de solution de la fibronectine sur chaque plat à fond de verre.
    4. Laisser la solution de la fibronectine sur la vaisselle pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C.
    5. Aspirer la solution de la fibronectine, rincez une fois avec du PBS et ajouter 1 mL de PBS.
  3. Les cellules sur des substrats préparés et des semences.
    1. Commencez par les cellules d’intérêt à un pourcentage de confluence approprié pour la sous-culture dans une boîte de Petri de 6 cm.
      Remarque : Différents types de cellules exigera des conditions de culture cellulaires distincts et protocoles de sous-culture. Cette section fournit des instructions permettant de MEFs. En général, MEFs sont cultivés jusqu'à 85 % confluence avant la sous-culture.
    2. Travaillant dans une hotte de culture cellulaire, rincer les cellules une fois avec 3 mL de PBS. Ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA et incuber pendant 5 min à 37 ° C.
    3. Ajouter 3 mL de support complet pour le plat de 6 cm, recueillir les cellules et placer dans un tube conique de 15 mL.
      NOTE : Composition des médias complète dépendra le type de cellule utilisé. Pour MEFs, les médias est souvent définie comme milieu Eagle de la modification de taux de glycémie élevé Dulbecco avec sérum de veau fœtal 10 %, 1 % antibiotique-antimycosiques (contenant l’amphotéricine B, la pénicilline et la streptomycine) et une solution d’acides aminés non essentiels (NEAA) de 1 %.
    4. Faire tourner les cellules vers le bas à 1000 x g pendant 5 min.
    5. Aspirer les médias et Resuspendre le culot dans 1 mL de médias complet.
    6. Enlever PBS de vaisselle de verre enduit de la fibronectine. Compter les cellules et 30 000 cellules sur chaque plat en verre enduit de fibronectine avec le support approprié et complet pour un volume final de 1,5 mL de graines.
      Remarque : Cette densité cellulaire convient pour MEFs et conduira à une population de cellules qui ne sont pas toucher, mais pas extrêmement clairsemée. Le nombre exact de cellules peut devoir être ajustée pour les autres types de cellules ou autre chambre d’imagerie.
    7. Laissez les cellules à se répandre pendant 4 h après l’ensemencement. A 2 h de propagation, aspirer les milieux de croissance et rincez une fois avec l’imagerie médiatique, laissant 1,5 mL d’imagerie des médias.
      Remarque : Ce temps de propagation est approprié pour les MEFs mais devrez peut-être être modifiées pour les autres cellules. Toutefois, les périodes d’incubation de plus de 6-8 h conduira aux dépôts importants de protéines ECM du sérum dans les médias complets. Imagerie des médias doit contenir les mêmes ajouts comme média complet mais devrait être optiquement clair et non contiennent des composés qui sont fluorescents dans les canaux d’imagerie, telles que des flavines ni étancher la fluorescence, comme le rouge de phénol. Un média d’imagerie n’est généralement utile est milieu DMEM-gfp Live cellule visualisation avec solution NEAA SVF et 1 % à 10 %. Si arrière-plan autofluorescence est trop élevé, alors la quantité de sérum peut être réduite. Si un changement de support n’est pas possible après les ensemencements initiaux, les cellules peuvent être charriés directement dans l’imagerie des milieux supplémentés avec un inhibiteur de la trypsine.

2. mettre en place le Microscope pour l’imagerie

  1. Allumez le microscope.
    1. Commencez par allumer la lampe à arc.
      Remarque : Une lampe à arc publiera une impulsion électromagnétique, qui peuvent endommager les autres appareils qui se trouve déjà.
    2. Activer le filtre roue contrôleur, contrôleur de scène automatisé, interface microscope-ordinateur et appareil photo.
    3. Allumer l’appareil FRAP et laser contrôleurs de position.
      ATTENTION : Lasers haute puissants peuvent être dommageable pour les yeux directement affichée. Il est recommandé de configurer le système de microscope pour bloquer l’excitation de laser d’être dirigé vers les pièces de l’oeil, qui peuvent être accomplis en déplaçant un miroir sur le trajet du faisceau FRAP pendant le blanchiment afin de refléter le laser vers l’échantillon et de prévenir la transmission à l’oculaire.
    4. Allumez l’ordinateur et le logiciel de contrôle de microscope ouvert.
    5. Laisser 15 min pour la lampe à arc et PAF laser pour se réchauffer.
  2. Calibrer le laser FRAP.
    1. Ouvrez la fenêtre de configuration de laser. Réglez Illumination (durant l’impulsion) sur les paramètres d’éclairage FRAP appropriés pour l’exposition de laser à l’échantillon. Réglé Éclairage réglage (imagerie) comme éclairage approprié pour l’imagerie seulement le fluorophore accepteur.
    2. Sélectionner l’objectif d’étalonner sous Paramétrage du système de coordonnées. Décochez la case Manuellement cliquez sur Points d’étalonnage et cochez afficher les images lors de l’étalonnage.
    3. Réglez le temps de pause sur µs 10 000 et le nombre d’impulsions à 100.
    4. Placez la diapositive d’étalonnage, de bromure d’éthidium scellé entre une lame de verre et d’un lamelle couvre-objet, dans l’adaptateur de la scène avec le côté de la lamelle vers le bas.
      ATTENTION : Le bromure d’éthidium est un agent mutagène et doit être manipulé avec des gants. Si la diapositive est compromise, éliminer conformément aux directives de l’institution.
    5. Utilisez les paramètres d’éclairage accepteur de se concentrer sur la surface de la lame, identifiable comme le plan focal avec le signal plus brillants. Petits défauts dans le revêtement sera visibles à l’aide à se concentrer.
    6. Déplacer la diapositive vers une zone avec une fluorescence homogène à travers le plan d’imagerie.
    7. Cliquez sur créer le paramètre. Le logiciel s’initialise le processus de calibrage, blanchiment et détecter la position du point blanchie automatiquement.
    8. Assurer une calibration réussie en évaluant l’image finale, qui sera une grille 3 x 3 points blanchie qui doit être répartie uniformément et mise au point. Enregistrer l’image de calibration pour référence ultérieure.
    9. Retirer la glissière de calibrage et de stocker en toute sécurité. Étalonnage doit être effectué avant le début de chaque expérience, mais n’a pas besoin d’être effectuée entre les échantillons.

3. Choisissez les paramètres pour l’imagerie de la frette

  1. Fixer un des échantillons générés des cellules exprimant le capteur de tension avec paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min. solution de paraformaldéhyde devrait être méthanol libre, souvent dénommé EM-grade, pour éviter la dénaturation des protéines fluorescentes. Placer dans du PBS après fixation.
    ATTENTION : Les solutions de paraformaldéhyde sont toxiques. Cette étape doit être effectuée sous une hotte et la solution devrait être disposée selon les politiques institutionnelles.
    NOTE : Cette optimisation ne dépend pas de la dynamique des protéines, et un échantillon fixe permet des temps d’imagerie maximum sans se soucier de la santé cellulaire.
  2. Rincer l’échantillon trois fois avec du PBS et laisser dans les PBS.
    Remarque : Utilisation des supports de montage plus disponible dans le commerce affectera propriétés fluorophore, rendant l’échantillon impropre pour imagerie54FRET. Idéalement, les cellules sont projetés immédiatement, mais peuvent être laissés toute la nuit à 4 ° C. Temps d’attente plus longs seront traduira par la détérioration de l’échantillon.
  3. Placer l’échantillon dans le porte-stade de microscope pour l’imagerie.
  4. Ouvrez l’outil Multi-Dimensional Acquisition (MDA). Mettre en place une imagerie séquentielle des trois canaux : excitation seul accepteur et des émissions (canal accepteur), excitation du donneur et émission de l’accepteur (canal frette) et excitation seul donneur et des émissions (canal de donateurs).
    Remarque : Il existe une variété de façons d’échantillons d’image frette. La méthode trois canaux ou « trois-cube » d’imagerie jumelé avec moyen de calibrer le système pour mesurer l’efficacité de la frette est recommandée pour capteurs de tension axée sur la frette55,56. Cette approche est simple, rapide et non destructive, requiert uniquement une norme fluorescence imaging microscope et permet la comparaison des expériences sur des jours différents et des installations d’imagerie.
  5. Analyse de l’échantillon à l’aide d’un temps d’exposition de 500 ms et un filtre de densité neutre (ND) de 10 %. Trouver une cellule exprimant le capteur de tension avec une localisation clairement vers une structure d’intérêt.
  6. Choisissez un temps d’exposition de 500 ms ou la longueur désirée pour chaque canal d’imagerie et un filtre ND de 100 % et acquérir une séquence d’images de frette.
  7. Estimer l’intensité moyenne du capteur les structures subcellulaires d’intérêt pour chaque voie d’imagerie. Les signaux faibles peuvent entraîner des résultats inexacts en raison d’une mauvaise correction des estimations, les non-linéarités dans les détecteurs, ou une contribution significative des signaux de fond. Une orientation approximative est de viser l’intensité supérieure à 10 % de la gamme dynamique de la caméra (i.e., pour un appareil de 16 bits, les intensités sera au-dessus de 6 000).
    Remarque : Les paramètres optiques identiques (temps d’exposition, des filtres, objectifs et autres variables telles que le gain de la caméra ou binning) doivent être utilisés pour toutes les expériences de la frette qui seront comparés. Changer le quelconque de ces paramètres donneront lieu à une altération de la quantité FRET qui est soit généré et/ou détectée dans la mise en place de la microscopie. Mesures d’efficacité FRET sont indépendantes de ces définissant, mais les facteurs d’étalonnage utilisées pour déterminer l’efficacité FRET ne sont pas. En théorie, les différents ensembles de facteurs d’étalonnage pourraient servir à générer des efficacités frette de différents paramètres optiques, mais cela n’est pas recommandé. Le blanchiment ou la phototoxicité peut différer entre les différents réglages, créant de fausses résultats.
  8. Acquérir une deuxième séquence d’images de frette du même champ de vision. Estimer le photoblanchiment entre les membrures en comparant l’intensité moyenne du capteur pour chaque voie d’imagerie. Photoblanchiment devrait être réduit au minimum, préférence inférieure à 1-5 % de perte de signal.
  9. Ajustez les paramètres d’imagerie afin de maximiser l’intensité tout en minimisant le photoblanchiment. Pour ajustement grossier, changer le filtre ND utilisé lors de l’acquisition. Pour des réglages plus fins, changer la durée d’exposition par incréments de 250 ms.
  10. Répétez les étapes 3,5 à 3,8 jusqu'à ce que le signal adéquat peut être obtenu tout en minimisant le photoblanchiment.
    Remarque : En général, les paramètres pour le capteur de tension de vinculine dans MEFs vinculine- / - sont 1 500 ms, ms 1 500 et 1 000 ms pour les canaux de la frette, le donneur et l’accepteur respectivement. Les valeurs optimales varient avec le type de système d’éclairage, objectif, jeux de filtres et niveau d’expression de capteur.

4. Choisissez paramètres pour FRAP imagerie

  1. Optimiser les paramètres du laser afin d’assurer un blanchiment complet de la région d’intérêt (ROI) sans blanchiment des environs ou provoquant le photovieillissement.
    1. Fixer un des échantillons générés des cellules exprimant le capteur de tension avec paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min.
      NOTE : Cette optimisation ne dépend pas de la dynamique des protéines, et un échantillon fixe permet des temps d’imagerie maximum sans se soucier de la santé cellulaire. Cela évitera également la récupération de blanchiment par les protéines mobiles, permettant d’isoler l’effet du blanchiment, éviter tout effet de récupération rapide, diffusion-mediated fluorescence ayant eu lieu entre l’incidence de blanchiment et de prendre la première image de l’eau de Javel.
      ATTENTION : Les solutions de paraformaldéhyde sont toxiques. Cette étape doit être effectuée sous une hotte et la solution devrait être disposée selon les politiques institutionnelles.
    2. Rincer l’échantillon 3 fois avec du PBS et laisser dans les PBS.
      Remarque : L’utilisation de supports de montage plus disponible dans le commerce affectera propriétés fluorophore, rendant l’échantillon impropre pour FRAP imagerie54. Idéalement, les cellules sont projetés immédiatement, mais peuvent être laissés toute la nuit à 4 ° C. Temps d’attente plus longs seront traduira par la détérioration de l’échantillon.
    3. Placer l’échantillon dans le porte-stade de microscope pour l’imagerie.
    4. Ouvrez la fenêtre de configuration de laser. Commencez par définir un temps de pause de laser de 1 000 µs et 10 impulsions, ce qui signifie que chaque point dans l’analyse à travers le ROI recevra 10 000 µs de pleine puissance laser
      Remarque : Une de 500 mW, laser à 515 nm a été utilisé pour le blanchiment. Cela a été retenu pour blanchir sélectivement la Vénus A206K, l’accepteur vinculine capteur de tension, avec une efficacité maximale. Si l'on utilise des capteurs de tension axée sur la frette avec d’autres protéines fluorescentes, un autre type de laser peut-être d’être employé.
    5. Trouver une cellule exprimant le capteur de tension avec une localisation clairement vers une structure d’intérêt et d’acquérir une image.
    6. Dessiner un ROI rectangulaire délimitant la zone pour blanchir et pour stocker l’emplacement du ROI. Impulsion du laser. Prenez une autre image de l’échantillon.
      Remarque : La taille de la boîte devrait être approximativement la taille de l’ensemble FA. Il faut que la taille de la boîte ne varie pas considérablement à travers des expériences. La zone blanchie doit être soigneusement contrôlée en protéines dont les dynamiques sont affectés par diffusion. Il s’agit d’un problème potentiel dans des protéines transmembranaires, tels que les cadhérines47, ou des protéines qui diffusent lentement27,57.
    7. Vérifiez la qualité de photoblanchiment en vérifiant que le ROI tout est blanchie, telle que l’intensité est proche des niveaux de fond. En outre, assurez-vous qu’il n’y a aucun blanchiment en dehors le retour sur investissement.
    8. Ajustez les réglages de laser si nécessaire pour atteindre une quantité importante de blanchiment dans le retour sur investissement sans provoquer de décoloration significative hors le ROI. Pour ajustement grossier, soulever et abaisser le temps de pause dans les étapes de 100 µs et pour un réglage, soulever et abaisser le nombre d’impulsions par incréments de 5 impulsions.
    9. Répétez les étapes 4.1.5 – 4.1.8 jusqu'à atteindre les paramètres minimaux au cours de laquelle le ROI est entièrement blanchie sans hors cible photobleaching.
      NOTE : Atteindre une valeur substantielle de blanchiment initiale sans provoquer de phototoxicité est un aspect clé de l’analyse de la PAF. Utilisez les paramètres laser qui donnent lieu à un produit de blanchiment complet dans les échantillons fixes. En général, le nombre minimal de photons devrait être utilisé pour atteindre le niveau souhaité de blanchiment. En outre, le protocole de blanchiment devrait être conservé relativement constant au cours d’expériences, tel altérations peuvent affecter les mesures de protéine dynamique58.
  2. Optimiser les paramètres Time-lapse pour saisir pleinement la dynamique de la protéine d’intérêt tout en minimisant le photoblanchiment.
    1. Préparer la mise en place de microscope pour l’imagerie de cellules vivantes, de préférence avec une platine chauffante et objectif ainsi que contrôle de CO2 . Laisser se pour équilibrer pendant 20 min.
      Remarque : Pour maintenir la santé des cellules imagés, pH et la température doivent être maintenues dans le vaisseau d’imagerie. Une variété de stades chauffées et chauffages objectives peut facilement maintenir la température à 37 ° C. Le contrôle du pH pour de nombreux types de médias peut être accompli par l’utilisation d’une pompe péristaltique à col humidifiée 5 % CO2 sur l’échantillon à 15 mL/min. par ailleurs, si CO2 contrôle n’est pas disponible, vivre d’imagerie milieux contenant HEPES devrait servir à empêcher la modification de pH important.
    2. Placez un des échantillons générés des cellules exprimant le capteur de tension dans le support de scène de microscope pour l’imagerie. Laisser se pour équilibrer pendant 10 min.
    3. À l’aide de l’outil MDA, mis en place un Time-lapse pour acquérir 3-5 images pré bleach, bleach le retour sur investissement et continuent de prendre des images de 10 à 60.
      Remarque : Pour la vinculine au FAs, imagerie toutes les 5 s d’eau de Javel après 5 min suffit d’observer la dynamique sans introduire de blanchiment excessif31. Les points de départ utiles pour taux d’imagerie et de la durée pour nombreuses autres protéines se trouvent dans la littérature47,48,,du5960.
    4. Utilisez accepteur d’imagerie paramètres qui réduisent au minimum l’exposition de l’échantillon à la lumière, tout en conservant un rapport signal-bruit suffisant, pour l’image de la structure d’intérêt. Un bon point de départ est la moitié de la ND filtre et exposition temps nécessaire pour l’imagerie de l’accepteur au cours de la frette.
    5. Trouver une cellule exprimant le capteur de tension avec une localisation clairement vers une structure d’intérêt et enclencher une image.
    6. Dessiner un ROI rectangulaire pour mettre en évidence où les blanchir et pour stocker l’emplacement du ROI. Initier le Time-lapse.
    7. Examiner le jeu d’images pour les problèmes potentiels.
      1. S’il y a des sauts substantielles (supérieure à 10 % de l’intensité initiale) dans la récupération de la fluorescence entre cadres, réduire le pas de temps entre les images.
      2. S’il y a une importante perte globale de fluorescence au fil du temps (plus de 5 à 10 % de l’intensité initiale), réduire le nombre d’images prises à l’eau de Javel et/ou modifier les paramètres d’imagerie afin de réduire l’exposition de l’échantillon à la lumière.
      3. Si la récupération de fluorescence n’a pas atteint un plateau avant la fin de la Time-lapse, augmenter la longueur totale de la Time-lapse.
    8. Ajustez les paramètres Time-lapse en conséquence et répétez les étapes 4.2.5 – 4.2.7 jusqu'à la récupération de la fluorescence est reflété adéquatement sans global photo-détérioration de l’échantillon.

5. acquisition de données frette-FRAP

  1. Préparer la mise en place de microscope pour l’imagerie de cellules vivantes, de préférence avec une platine chauffante et objectif ainsi que contrôle de CO2 . Laisser se pour équilibrer pendant 20 min.
    1. Afin d’assurer la santé des cellules imagés, maintenir la température à 37 ° C dans la salle d’imagerie. Utiliser une pompe péristaltique à passer humidifié 5 % CO2 sur l’échantillon à 15 mL/min pour maintenir le pH.
    2. Si CO2 contrôle n’est pas disponible, utiliser les média imageries direct contenant HEPES pour empêcher des changements de pH grand.
  2. Ouvrez l’outil MDA et mis en place avec l’imagerie des paramètres, y compris les jeux de filtres différents FRET.
  3. Enregistrez cet Assistant débogage MANAGÉ dans le dossier expérimental avec le nom de MDA_FRET_Date.
  4. Mettre en place un autre MDA avec FRAP paramètres, y compris les jeux de filtres différents, les paramètres de Time-lapse et le journal de l’imagerie d’impulsion du laser après l’acquisition de l’eau de Javel avant.
  5. Enregistrez cet Assistant débogage MANAGÉ dans le dossier expérimental avec le nom de MDA_FRAP_Date. Fermez la fenêtre de la MDA.
  6. Dans la barre d’outils en haut de l’écran, sélectionnez Journal | Commencer l’enregistrement.
  7. Ouvrez la fenêtre MDA, charger l’état de MDA_FRET_Date et appuyez sur acquérir. Charger l’état de MDA_FRAP_Date , puis appuyez sur acquérir.
  8. À la fin de l’acquisition, dans la barre d’outils en haut de l’écran, sélectionnez Journal | Arrêter l’enregistrement.
  9. Enregistrer ce journal dans le dossier expérimental avec le nom de FRETFRAP_Date et l’ajouter à une barre d’outils pour faciliter l’accès. Fermez la fenêtre de la MDA.
  10. Placez un des échantillons générés des cellules exprimant le capteur de tension dans le porte-microscope pour l’imagerie. Laisser se pour équilibrer pendant 10 min.
  11. Naviguez à l’aide de l’acquisition d’images sous Acquire | Acquisition de avec une exposition minimale de temps et ND filtrent pour identifier les cellules d’intérêt.
  12. Définir l’autofocus continu en accédant à appareils | Mise au point. Mise au point manuelle sur l’échantillon jusqu'à arriver à l’avion d’imagerie correcte.
  13. Cliquez sur Définir un accent continu, attendez que le système d’ajuster et cliquez Démarrer continue en se concentrant.
    NOTE : Ceci n’est pas nécessaire, mais il améliore significativement la qualité des courbes de récupération FRAP parce qu’elle empêche l’échantillon d’out-of-focus à la dérive.
  14. Trouver une cellule exprimant le capteur de tension avec une localisation clairement vers une structure d’intérêt et enclencher une image.
  15. Dessiner un ROI rectangulaire pour mettre en évidence où eau de Javel. Stocker l’emplacement de retour sur investissement.
  16. Initialiser le journal FRETFRAP_Date , qui commencera à l’acquisition d’images de frette suivie de l’initialisation de la PAF en Time-lapse.
  17. Répétez les étapes 5.14-5.16 jusqu'à 10-15 ensembles d’images sont acquises.
    Remarque : La mesure ne peut être répétée dans la même cellule. Une fois que le photoblanchiment se produit, données FRET ne sont pas fiables.

6. analyser les données de la frette-FRAP

  1. Analyser les images FRET en utilisant le logiciel de choix.
    Remarque : Il y a plusieurs façons d’image et de quantifier la frette61, y compris ratiométrique frette62 et frette indice34,35. Toutefois, il est fortement recommandé d’utiliser les estimations de la frette efficacité55,63 pour l’interprétation des données de FRET-FRAP. Voir la Discussion pour la poursuite de l’exploration de ce sujet. Pour émission sensibilisée et calcul du rendement de la frette, logiciel sur mesure est disponible chez le laboratoire Hoffman à https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public.
  2. Quantifier les paramètres pertinents pour chaque structure subcellulaire qui a été blanchi. Cela devrait inclure la frette index/efficacité et moyenne initiale accepteur intensité moyenne (proportionnelle à la concentration), mais pourrait également inclure des paramètres physiques comme la taille ROI.
  3. Analyser les images de la PAF en utilisant le logiciel de choix.
    Remarque : Il existe plusieurs façons pour quantifier la FRAP26,27,28,29. Principales préoccupations expérimentales incluent comptables pour la décoloration au cours de l’eau de Javel après imaging, changements dans l’intensité du fond et la translocation des structures subcellulaires hautement dynamiques, tels que les adhérences focales. Blanchir les corrections et les variations du rétro-éclairage peut être accompli grâce à l’analyse des régions non blanchi et non fluorescent des images. Des structures subcellulaires très dynamiques, particulièrement ceux montrant la dynamique de croissance ou démontage excessive sont incompatibles avec les analyses FRAP standard et ne doivent pas être analysées. En outre, il y a une variété de moyens de normaliser les données. Les lignes directrices fournies sont pour l’analyse plus simple.
  4. Corriger les données de récupération pour la décoloration des effets et puis normaliser pour blanchir des intensités. Quantifier le temps de récupération et de la fraction mobile selon le suivant équation28,34:
    MF - (MF - Ro) e-kt
    où MF est la fraction mobile, Ro est la récupération initiale, et k est le taux de récupération. La demi-vie de la reprise est déterminée par :
    Τ1/2 = ln 2/k.
    Remarque : Il existe une variété de logiciels accessibles pour compléter ces analyses64 ainsi que divers plugins ImageJ. Logiciel personnalisé est disponible à partir du laboratoire Hoffman à https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public. Des analyses plus doivent être utilisés pour les situations où la diffusion affecte la dynamique de la protéine d’intérêt, des échelles de temps multiples n’apparaissent pas dans la récupération, ou les géométries blanchiment non standards sont utilisées.

7. interpréter les données de FRET-FRAP

  1. Compiler les informations pertinentes pour chaque ROI, y compris : frette index/efficacité, intensité de l’accepteur, FRAP mi-temps FRAP fraction mobile.
    NOTE : Indice de FRET ou d’efficacité est utilisée pour déterminer la charge moyenne dans l’ensemble de la protéine dans le retour sur investissement. Intensité de l’accepteur mesure la concentration locale de la protéine. La moitié du temps de récupération est une mesure de la dynamique des protéines. Une petite pause indique la rotation plus rapide. FRAP fraction mobile mesure la quantité de protéine à l’intérieur du ROI qui est activement retournement. Une large fraction mobile indique qu’un pourcentage plus élevé de la protéine dans le retour sur investissement est retournement.
  2. Pour étudier l’effet de la concentration locale sur le taux de renouvellement des protéines et la quantité, terrain FRAP fraction mi-temps et mobile contre l’intensité initiale accepteur.
  3. Pour étudier l’effet de la charge de la protéine sur le taux de renouvellement des protéines et la quantité, terrain FRAP fraction mi-temps et mobile contre frette index/efficacité.
    Remarque : Selon la protéine ou de la structure, il peut aussi être intéressant d’examiner les effets des paramètres physiques, notamment la taille de la structure ou l’excentricité, sur charge de protéines ou de chiffre d’affaires.

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Résultats

FRETTE-FRAP est constitué de la combinaison de deux techniques fluorescents, vous inquiétez pas et PAF. Comme nous nous sommes concentrés sur les effets de la charge de la protéine, nous avons utilisé axée sur la frette tension capteurs34,46. Ces capteurs sont souvent basés sur une tension de détection module composé de deux protéines fluorescentes, tels que mTFP1 et VenusA206K, reliés par un éditeur de liens flagellif...

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Discussion

La méthode FRAP-frette permet une mesure directe de la dynamique des protéines sensibles à la force une propriété qui a été difficile de sonder directement à l’intérieur de cellules vivantes. La sensibilité de la dynamique des protéines à charge moléculaire est essentielle aux fonctions de la protéine comme un transmetteur de force ou un transducteur. Chargement est nécessaire pour la transmission des deux interne et forces appliqué extérieurement, appelé mechanotransmission et pour la conversion de c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une bourse de la National Science Foundation carrière (NSF-CMMI-14-54257) ainsi que les subventions accordées par l’American Heart Association (16GRNT30930019) et le National Institutes of Health (R01GM121739-01) décerné à m. Brenton Hoffman et un ressortissant Science Foundation recherche bourse d’études supérieures accordé à Katheryn Rothenberg. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la NSF ou NIH.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher25300062
16% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences30525-89-4
60x Objective NA1.35OlympusUPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)Gibco15240-062
Automated StagePrior ScientificH117EIX3
Custom Dichroic MirrorChroma Technology CorpT450/514rpc
Custom mTFP1 Emission FilterChroma Technology CorpET485/20m
Custom mTFP1 Excitation FilterChroma Technology CorpET450/30x
Custom Venus Excitation FilterChroma Technology CorpET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization MediumSapphireMC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma AldrichD5796with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine SerumHyCloneSH30396.03
Fibronectin, HumanCorning47743-654
FRAPPA Calibration SlideAndorprovided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm LaserAndor
Glass-bottomed Fluoro DishesWorld Precision InstrumentsFD35
HEK293-T CellsATCCCRL-3216
Hexadimethrine Bromide, PolybreneSigma AldrichH9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigma AldrichD6429
Inverted Fluorescent MicroscopeOlympusIX83
JMP Pro SoftwareSAS
Lambda 10-3 Motorized Filter WheelsSutter InstrumentsLB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon BulbSutter InstrumentsLS/OF30
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027
MATLAB SoftwareMathworks
MEM Non-Essential Amino AcidsThermo Fisher11140050
MetaMorph for OlympusOlympus
Micro-Humidification SystemBioptechs130708
MoFlo Astrios EQ Cell SorterBeckman CoulterB25982
Objective Heater MediumBioptechs150819-13
OptiMEMThermo Fisher31985070
Phosphate Buffered SalineSigma AldrichD8537
pMD2.G Envelope PlasmidAddgene12259
pRRL Vectorgift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging PlasmidAddgene12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 CameraHamamatsu PhotonicsC11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF CentrifugeThermo Fisher75004505
Stable Z Stage WarmerBioptechs403-1926
Venus Emission FilterSemrockFF01-571/72

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