緑色蛍光タンパク質-表現する拡張を使用するマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するために大腸菌

要約

ここでは、強化された緑色蛍光タンパク質発現大腸菌を用いたマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するためのプロトコルを提案する.

要約

本稿では、貪食能の分析を実行するシンプルかつ再現可能な方法について説明します。このメソッドの最初の部分では、ペット相撲 EGFP ベクターの構築 (相撲 = 小さなユビキチン様修飾) と表現する緑色蛍光タンパク質 (EGFP)エシェリヒア属大腸菌(BL21DE)。37 ° C で 1 時間のマクロファージの EGFP 発現大腸菌を coincubated します。培養陰性対照グループは、時間の同量のため氷の上。その後、マクロファージは評価の準備ができています。この手法の利点は、そのシンプルでわかりやすい手順と貪食能は両方の流れの cytometer 蛍光顕微鏡で測定できます。EGFP 発現大腸菌が安定していると、マクロファージはパラホルムアルデヒドで固定後も強い蛍光信号が表示されません。このメソッドはマクロファージ細胞株あるいは体外プライマリ マクロファージの評価に適したが、末梢血単核細胞における顆粒球や単球の貪食能の評価にも適しただけではありません。若い (8 週齢) マウス腹腔マクロファージの貪食機能に高齢者 (16 ヶ月歳) マウスからマクロファージの細胞よりも高い結果を示す.要約すると、このメソッドは、マクロファージの貪食能を測定、生得の免疫組織の機能を勉強に適しています。

概要

マクロファージの食作用の試金は、自然免疫の研究に使われます。生得の免疫反応伝染への感受性があります。マクロファージ細胞は免疫学研究で広く使用されます。ただし、拡張通路遺伝子の損失を引き起こす可能性があります、これらの細胞免疫機能を侵害します。したがって、プライマリのマクロファージ、細胞機能¹を研究するための理想的なオブジェクトです。

生得の免疫反応は、高齢者の体にそのままと思われたが貧食能が、年下でボディ^2,3と比較して低下します。ここでは、若い (8 週齢) と EGFP 発現大腸菌、便利、迅速、かつ経済的に実現可能であるを使用して高齢者 (16 ヶ月歳) マウスの腹腔マクロファージの貪食能を評価する方法を示します。

EGFP 発現大腸菌株の使用は、これらの細菌は安定しており、マクロファージが 4% (w/v) パラホルムアルデヒドで固定後も強い蛍光信号が表示されないので、このアッセイの利点の 1 つです。また、EGFP 発現大腸菌を用いた研究者必要はありませんさらに染色細胞貪食は、時間を節約できます。さらに、マクロファージがエシェリヒア属大腸菌抗原、大腸菌の EGFP 発現菌類またはフルオレスセイン分類されたビーズを使用するよりも適して食作用の試金のためを作るための immunoresponsive です。

EGFP 発現大腸菌と食作用の試金、簡単に 2 h で達成し、両方流れフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、研究者の目的に応じてで測定します。以来、このメソッドは、貪食能力を直接測定、結果、その他の間接的な方法よりも再現性。

このメソッドは、RAW264.7 細胞ラインで検証されている、ひと末梢血単核細胞の⁴。下のテキストはこの分析を実行する詳細な手順について説明し、ハイライト重要なステップが研究者が彼らの実験のニーズに合わせて変更。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

ケアと実験動物の使用のため国家機関の健康の指針の下ですべての手順を行ったし、プロトコルは、動物愛護と大連医科大学の使用委員会によって承認されました。16 ヶ (30-35 g の体重) と、8 週齢 (20-25 g) SPF (特定病原体フリー) 男性 c57bl/6 マウスは大連医科大学の SPF 動物センターから得られました。すべてのマウスは、食糧および水の自由にアクセスで動物飼育で保管されました。20-24 ° C に保たれた温度、湿度は 40% から 70% に、照明は暗いの 12 h 光/12。動物は、実験前に少なくとも 7 日間環境に適応する許されました。

1. ペット相撲 EGFP プラスミドとの EGFP 発現誘導の建設

1. EGFP 遺伝子のフラグメントを合成 (カスタム遺伝子合成サービスによって合成 717 bp シーケンスには、シーケンスの材料表と補足ファイル 1が参照してください)、前方のプライマー (フラグメントを増幅5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') 逆プライマー (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3')、忠実度の高い Taq DNA ポリメラーゼを用いたします。
2. ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 製品が単一 3' 次のステップで TA のクローニングのためのオーバー ハング アデニンができるようにには、最後のサイクル (PCR 条件の補足のファイル 1を参照してください) の後に 72 ° C で 30 分拡張子を使用します。Agarose のゲルの電気泳動で PCR の製品を確認してください。
3. ペット相撲ベクトルに PCR の製品をクローン (材料表参照) TA クローニング法⁵ T4 DNA リガーゼを使ってします。30 分間室温 (20-25 ° C) で反応を孵化させなさい。653 と 1 bp の 5 ' の各鎖に T オーバー ハングで 654 のヌクレオチドの間ベクトルが線形化されます。
4. 化学的に有能なエシェリヒア属大腸菌BL21(DE) ひずみに結紮製品を次のように変換: 5 μ L を追加 (100 ng) BL21(DE) 90 42 ° C で熱ショックによって有能なセルの 100 μ L に PCR の製品の s;3 分間氷の上の混合物を維持し、37 ° c、1 h 37 ° C で 120 rpm の振動予熱ホストゲノム スープ (LB) 媒体の 400 μ L を追加します。
5. 降伏 EGFP 式ひずみとインデューサ ラクトース (0.5 mmol/L)、LB カナマイシン (100 μ g/mL) プレートの表面に細菌の 100 μ L を接種します。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
   注: EGFP を表明正常にいくつかの植民地が暗闇の中で光る緑色の光として観察できます。
   1. DNA の配列によって挿入された EGFP フラグメントを検証するコロニーを選択します。DNA 塩基配列のプライマー: 前方、5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3';逆、5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'。
6. 100 μ g/mL カナマイシンと LB 培地 5 mL に肯定的なコロニーを接種します。2 時間 120 rpm でインキュベーターを揺れ 37 ° C の孵化し、0.5 ミリ モル/L の最終的な集中にインデューサ乳糖を追加し、6 h、EGFP の発現を誘導するために振るを続行します。経験的に、6 h、600 の光学濃度の振動と nm (OD600) が 0.7 に達する可能性があります以上。
7. スライドに細菌培養液の 10 μ L を加えて、coverslip でそれをカバー倒立蛍光顕微鏡下で EGFP の発現を調べる。EGFP 発現細菌は、数週間 2-8 ° C でメディアに格納できます。

2. マウス腹腔マクロファージの分離と培養

1. チオグ リコール酸の 3.5 g を 100 mL の蒸留水とオートクレーブを使用する前に無菌性の混合物に追加します。マウス腹腔内注射用フードで 1 mL 滅菌注射器にチオグ リコール酸培地をポンプします。感染を避けるために注射器ごとの 1 つのマウスを使用します。チオグ リコール酸の使用は、マクロファージの数を増やすことができます。腹腔マクロファージは分離することができますマクロファージが得られますチオグ リコール酸がなくても低い。
2. ローカル アニマル ・ ケアおよび使用委員会によって承認されたメソッドを使用してマウスを麻酔します。マウスの腹腔内に 23 G 針を用いて 1 mL 注射器 3.5% チオグ リコール酸培地 1 mL を注入します。
   注: 麻酔を誘導することによって腹腔内注入が簡単に行えます、注入によって引き起こされる内部の臓器に傷害の危険を減らします。
3. 3 日間の水や食料の自由でマウスを維持します。動物の体の重量と食品の摂取量を毎日監視します。3 日以内に体重を 10% より大きい場合は、実験から動物を除外します。
4. 3 日後に、急速にクローズド ボックスでセボフルランによる麻酔を誘導した後頚部転位によってマウスを安楽死させます。また、マウスを安楽死地元の動物のケアおよび使用委員会によって承認されているメソッドを使用します。
5. 滅菌、75% エタノール (直径 10 cm) と皿にマウスを置くし、フードにすぐに転送。皿の上にマウスを置くし、マウスの位置を固定するボードに前足をピンします。
6. 20 G に接続されている 5 mL シリンジを使用して針を 30 ° ~ 40 ° の角度で針ベベルを配置する注入 5 mL 冷 (4-10 ° C) のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 下腹部にマウスの腹腔内腸を穿刺を避けること。腸 (または他の器官) をパンクすると場合、マウスおよびそのセルもはや使用できます実験、これは初代細胞培養に適していないセルをアクティブに可能性がありますと。
7. マウスの腹部の両側に優しくマッサージを実行します。その後、静かにゆっくりと液体を吸い出しなさい。腹腔液を 50 mL の遠心管に分配します。次の手順は 2 倍または 3 倍を繰り返します。
8. 冷却遠心機 (4-8 ° C) で 400 × gで 10 分間の浮遊細胞を遠心します。上澄みを廃棄し、10% 牛胎児血清 (FBS) RPMI 1640 媒体で細胞ペレットを再懸濁します。セルをカウントします。経験的に、細胞密度は、セル培地 10 mL で再停止されるとき約 5 × 10⁶セル/mL と同じです。
9. 流れの cytometry の試金の蛍光顕微鏡用 24 ウェル プレートによくあたり 5 x 10 の⁵セル 6 ウェル プレートの各ウェルに 5 x 10 の⁶セルを追加します。一晩で 5% CO₂インキュベーター 37 ° C の細胞を培養します。これらのほとんどはリンパ球であるので非粘着性のセルを削除する 3 時間後、培養液を更新できます。付着性のセルは主にマクロファージ、組織文化処理プラスチックによく付着することができます彼ら。

3 蛍光顕微鏡を用いたマクロファージ貪食能アッセイ

1. 細胞生存率、細胞密度を評価する明視野顕微鏡で細胞を観察します。
2. 24 ウェル プレートから培養培地を削除します。新鮮な培養液を 100 μ l 添加と細菌懸濁液 (約 2 x 10 の⁷セル) の 10 μ L を各ウェルの表 1に示すように追加します。1 h 37 ° C、5% CO₂インキュベーターで孵化させなさい。
3. Noninternalized 細菌を洗浄する井戸あたり 500 μ L 冷 PBS の x-5 3 x は水洗い。
4. 30 分間室温で PBS で 4% のホルムアルデヒドとセルを孵化させなさい。
5. 3 固定セルを洗浄して PBS の x (500 μ L/ウェル)。
6. 蛍光ファロイジン 633 を 200 μ l 添加色素共役実用的なソリューションを追加 (参照材料表) F-アクチンを染色します。60 分間室温で暗く、湿気の多い場所 (60%-80%) に保管のリンスの細胞 3 x PBS (500 μ L/ウェル) 任意の余分な電子を削除します。F-アクチンを染色によって細胞質を概観して内面化された細菌を区別するのに役立ちます。
7. 細胞核を染色し、室温で暗く、湿気の多い場所で 5 分間インキュベート DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) 使用液 (1 μ g/mL) 200 μ L を追加します。1x PBS で洗浄 (500 μ L/ウェル) と等量の蒸留水と 1 x。セルは、倒立蛍光顕微鏡下で観察の準備になります。

4 フローサイトメトリーを用いたマクロファージ貪食能アッセイ

1. 実験の誤差を最小限に抑えると結果の適切な解釈をする、グループを設定し、表 2に記載されている実験のための管を制御します。
   1. コントロール グループのする氷 (表2 グループ 4) に配置されます 6 ウェル プレートからメディアを取り出して、それを洗う PBS で 1 x。セルをデタッチし、流れの cytometry チューブに移して同様に 70 mM 冷たい EDTA の 1 mL を追加します。チューブの細菌懸濁液 50 μ L を追加、1 h の氷の上に置きます。
   2. 他のグループは、培養培地を削除します。各ウェルに新鮮な媒体の 1 つの mL を追加します。表 2に説明されているようにグループの設定によると井戸に細菌懸濁液を 50 μ l 添加を追加します。その後、37 ° C、1 時間 5% CO₂インキュベーターに 6 ウェル プレートを配置します。
2. Noninternalized大腸菌の蛍光を癒やす、井戸に 0.8% (CV) クリスタル バイオレット水溶液 200 μ L を追加しの表面に EGFP 発現大腸菌バインディングによって偽陽性の結果を回避するため、すぐに影響を与える、マクロファージ、内面が。3 セルを洗浄して任意の残留の CV を削除する PBS の x。
3. セルをデタッチし、流れの cytometry チューブに移して同様に 70 mM 冷たい EDTA の 1 mL を追加します。
4. 400 x gで 5 分でチューブを遠心し、上澄みを廃棄します。
5. 細胞を再懸濁しますに PBS 100 μ L を追加します。グループの設定によると、チューブ、または使用 IgG2a PE アイソタイプに F4/80 PE 標識抗体 (マウスのマクロファージに発現する表面抗原) の 5 μ L を追加します。渦を簡単にし、暗闇の中で 5-10 分のための氷のサンプルをインキュベートします。
6. 各管に 1 mL の PBS を追加し、400 x gで 5 分間遠心上清を破棄します。フローサイトメトリー解析のための PBS の 200-300 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。各チューブを実行し、F4/80⁺細胞の少なくとも 10,000 のイベント用のデータを取得します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

ペット相撲ベクターは、大腸菌でのネイティブ蛋白質の表現を許可する小さいユビキチンのような修飾子を利用しています。相撲の融合は、簡単に検出することができます、EGFP の溶解度を大きく向上できます。EGFP の発現は正常にラクトース誘発性、緑コロニーが (図 1 a) 暗闇の中で観察できます。EGFP 発現大腸菌を表し、緑のド?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

このプロトコルの手順は非常にシンプルで簡単です。エシェリヒア属大腸菌の EGFP 発現を誘導するために重要な手順の 1 つです。通常、EGFP のような真核生物の遺伝子は大腸菌のような原核生物で表現する予定されている場合蛋白質のネイティブ構造と活性を変化する蛋白質が非アクティブな集計 (封入体) を形成、リスクがあります。ペット相撲ベクトルを使用し、ペット相撲 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II Flow cytometer	BD Biosciences	-
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody	Biolegend	Cat101303
Champion pET SUMO Protein Expression system	Invitrogen	K300-01
Custom Gene Synthesis Service	Takara Biotech.	-
DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	ThermoFisher	D1306
F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS	Biolegend	Cat123110
Leica DMI3000 B  Inverted Microscope	Leica Microsystems	-
PE Rat IgG2a, κ-isotype control	Biolegend	Cat400507
Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution	AAT Bioquest	Cat23125
Thioglycollate medium	Sigma-Aldrich	T9032