Utilizzando Enhanced fluorescenza verde che esprimono proteine Escherichia Coli per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del Mouse

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del mouse usando una maggiore fluorescenza verde Escherichia coliche esprimono proteine.

Abstract

Questo manoscritto descrive un metodo semplice e riproducibile per eseguire un test di fagocitosi. La prima parte di questo metodo prevede la costruzione di un vettore di animali-SUMO-EGFP (SUMO = piccolo ubiquitina-come modificatore) e che esprimono una maggiore proteina di fluorescenza verde (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). Che esprimono EGFP e. coli è coincubated con i macrofagi per 1h a 37 ° C; il gruppo di controllo negativo viene incubato in ghiaccio per la stessa quantità di tempo. Quindi, i macrofagi sono pronti per la valutazione. I vantaggi di questa tecnica includono i passi semplici e diretti, e fagocitosi possono essere misurata con entrambi microscopio di fluorescenza e cytometer di flusso. Il che esprimono EGFP e. coli sono stabili e visualizzare un segnale di fluorescenza forte anche dopo i macrofagi sono fissati con paraformaldeide. Questo metodo non è solo adatto per la valutazione delle linee cellulari del macrofago o macrofagi primari in vitro ma adatto anche per la valutazione della fagocitosi di granulociti e monociti in cellule mononucleari del sangue periferico. I risultati mostrano che la capacità fagocitica dei macrofagi peritoneali dai giovani topi (otto-settimana-vecchio) è superiore a quella dei macrofagi dai topi invecchiati (16 mesi). In sintesi, questo metodo misura la fagocitosi del macrofago ed è adatto per studiare la funzione del sistema immunitario innato.

Introduzione

Saggi di fagocitosi del macrofago sono spesso utilizzati per studiare la funzione immunitaria innata. La risposta immunitaria innata può indicare la suscettibilità all'infezione. Linee cellulari del macrofago sono ampiamente utilizzate negli studi di immunologia. Tuttavia, il passaggio prolungato può causare la perdita del gene e compromesse funzioni immuni in queste linee cellulari. Così, i macrofagi peritoneali primari sono l'oggetto ideale in cui studiare la funzione delle cellule¹.

Anche se la risposta immunitaria innata è stata pensata per essere intatto nel corpo invecchiato, può fare diminuire la capacità fagocitica rispetto a che nel giovane corpo^2,3. Qui, ci dimostrerà un metodo per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali dai giovani (otto-settimana-vecchio) e anziani (16 mesi) mouse utilizzando che esprimono EGFP e. coli, che è conveniente, veloce ed economicamente fattibile.

L'uso di un ceppo che esprimono EGFP e. coli è uno dei vantaggi di questo test perché questi batteri sono stabili e visualizzare un segnale di fluorescenza forte, anche dopo i macrofagi sono stati risolti in paraformaldeide al 4% (p/v). Inoltre, utilizzando il che esprimono EGFP e. coli, i ricercatori non devono ulteriormente colorazione dopo fagocitosi, che consente di risparmiare tempo. Inoltre, i macrofagi sono immunoresponsive per e. coli , antigene di superficie, rendendo il e. coli più adatto per il test di fagocitosi di utilizzando i funghi che esprimono EGFP o branelli della fluorescina-etichettati.

Con che esprimono EGFP e. coli, un test di fagocitosi può essere facilmente compiuto in 2h e misurato da entrambi microscopia fluorescenza e citometria di flusso, a seconda della finalità del ricercatore. Poiché questo metodo misura direttamente la capacità fagocitica, i risultati sono più riproducibili rispetto ad altri metodi indiretti.

Questo metodo è stato convalidato anche in una linea cellulare RAW 264.7 e cellule mononucleari del sangue periferico umano⁴. Il testo riportato di seguito fornisce le istruzioni dettagliate per l'esecuzione di questo test e vengono evidenziati i passaggi critici che i ricercatori possono modificare per soddisfare le esigenze dei loro esperimenti.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state effettuate nell'ambito degli istituti nazionali di salute orientamenti per la cura e l'uso di animali da laboratorio e i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato di Dalian Medical University. Sedici mesi (con un peso corporeo di 30-35 g) e otto-settimana-vecchio topo C57BL/6 (specifiche-patogeno-free) maschio (20-25 g) SPF sono stati ottenuti dal centro animale SPF dell'Università medica di Dalian. Tutti i topi sono stati tenuti in custodia degli animali con accesso a cibo e acqua ad libitum. La temperatura è stata mantenuta a 20-24 ° C, umidità era 40% - 70%, e l'illuminazione era 12 h luce/12 h scuro. Gli animali sono stati ammessi raggiunga l'ambiente per almeno 7 giorni prima dell'esperimento.

1. costruzione del plasmide pET-SUMO-EGFP e induzione dell'espressione di EGFP

1. Sintetizzare il frammento del gene EGFP (una sequenza di bp 717 sintetizzato da un servizio di sintesi del gene personalizzato, vedere Tabella materiali e 1 File supplementari per la sequenza) e amplificare il frammento con il primer forward ( 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') e reverse primer (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), utilizzando ad alta fedeltà Taq DNA polimerasi.
2. Per garantire che i prodotti di reazione a catena (PCR) polimerasi single 3' adenina sporgenze per la clonazione TA nel passaggio successivo, è possibile utilizzare un'estensione di 30 min a 72 ° C dopo l'ultimo ciclo (Vedi 1 File supplementari per le condizioni di PCR). Controllare il prodotto PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio.
3. Clonare il prodotto di PCR nel vettore animale-SUMO (Vedi Tabella materiali) utilizzando il metodo⁵ con T4 DNA ligasi di clonazione di TA. Incubare la reazione a temperatura ambiente (20-25 ° C) per 30 min. Il vettore è linearizzato tra nucleotidi 653 e 654 con 1 bp 5 ′ T-sporgenza su ogni filo.
4. Trasformare il prodotto di legatura il ceppo BL21 Escherichia coli chimicamente competente come segue: aggiungere 5 µ l (100 ng) del prodotto PCR a 100 µ l di cellule competenti di BL21 via shock termico a 42 ° C per 90 s; mantenere la miscela in ghiaccio per 3 minuti e poi, aggiungere 400 µ l di terreno di brodo (LB) di Lisogenesi preriscaldato a 37 ° C, scuotendolo per 1h a 37 ° C e 120 giri/min.
5. Inoculare 100 µ l dei batteri sulla superficie di una piastra di LB-kanamicina (100 µ g/mL) con il lattosio induttore (0,5 mmol/L), producendo il ceppo di espressione di EGFP. Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte.
   Nota: Se la EGFP è espresso con successo, alcune colonie possono essere osservate come incandescente luce verde nel buio.
   1. Facoltativamente, selezionare colonie per verificare il frammento inserito EGFP di sequenziamento del DNA. Il primer di sequenziamento del DNA sono: in avanti, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; inverso, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
6. Inoculare una colonia positiva in 5 mL di terreno LB con kanamicina di 100 µ g/mL. Incubare a 37 ° C in agitazione incubatore a 120 giri/min per 2 h e poi, aggiungere il lattosio induttore a una concentrazione finale di 0,5 mmol/L e continuare ad agitare per 6 h, inducendo l'espressione di EGFP. Empiricamente, quando scuotendo per 6 h, la densità ottica a 600 nanometro (OD600) può raggiungere 0,7 o superiore.
7. Aggiungere 10 µ l di terreno di coltura batterico su un vetrino, coprire con un vetrino coprioggetto ed esaminare l'espressione di EGFP sotto un microscopio a fluorescenza invertito. I batteri che esprimono EGFP possono depositare in mezzo a 2-8 ° C per diverse settimane.

2. isolamento dei macrofagi peritoneali e colture primarie di mouse

1. Aggiungere 3,5 g di tioglicolato a 100 mL di acqua distillata ed autoclave la miscela di sterilità prima dell'uso. Pompa il mezzo tioglicolato nella siringa sterile da 1 mL nella cappa per l'iniezione peritoneale del mouse. Utilizzare un mouse per siringa per evitare l'infezione. L'uso di tioglicolato può aumentare il numero dei macrofagi. I macrofagi peritoneali residenti possono essere isolati senza tioglicolati, ma con più basso macrofago produce.
2. Anestetizzare il mouse usando un metodo approvato dal comitato di uso e cura degli animali locale. Iniettare 1 mL di terreno di 3,5% tioglicolato nella cavità peritoneale del mouse con la siringa da 1 mL, utilizzando un ago di 23 G.
   Nota: Attraverso l'induzione di anestesia, l'iniezione peritoneale può essere facilmente eseguita e riduce il rischio di lesioni agli organi interni causati da iniezione.
3. Mantenere il mouse con acqua e cibo ad libitum per 3 giorni. Monitorare l'assunzione di cibo e peso del corpo dell'animale ogni giorno. Se la perdita di peso del corpo è supera al 10% entro 3 giorni, è possibile escludere l'animale da esperimento.
4. Dopo 3 giorni, eutanasia il mouse di dislocazione cervicale dopo l'induzione rapida anestesia di sevoflurane in una scatola chiusa. In alternativa, utilizzare un metodo che è stato approvato dal comitato animale locale di uso e la manutenzione di eutanasia il mouse.
5. Mettere il mouse in un piatto (con un diametro di 10 cm) con 75% di etanolo per sterilizzare e trasferire rapidamente alla cappa. Posizionare il mouse su un piatto e pin la zampa anteriore alla scheda per fissare la posizione del mouse.
6. Usando una siringa da 5 mL per un 20 G needle, ponendo la smussatura dell'ago fino ad un angolo di 30° - 40°, inietta soluzione fisiologica 5 mL di freddo (4-10 ° C) in tampone fosfato (PBS) al basso addome nella cavità peritoneale del mouse, evitando di perforare l'intestino. Se l'intestino (o qualsiasi altro organo) è forato, il mouse e le celle non più utilizzabile per esperimenti, come questo può attivare le cellule che non sono adatte per colture cellulari primarie.
7. Eseguire un leggero massaggio sui due lati dell'addome del mouse. Quindi, aspirare il liquido lentamente e delicatamente. Versare il liquido peritoneale in una provetta da centrifuga 50 mL. Ripetere questi passaggi 2x o 3x.
8. Centrifugare le cellule sospese per 10 min a 400 x g in una centrifuga refrigerata (4-8 ° C). Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in medium RPMI 1640 con 10% siero bovino fetale (FBS). Contare le celle. Empiricamente, la densità delle cellule è circa uguale a 5 x 10⁶ cellule/mL quando le cellule sono risospese in 10 mL di terreno.
9. Aggiungere 5 x 10⁶ celle in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per l'analisi di citometria a flusso e 5 x 10⁵ cellule per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti per un microscopio a fluorescenza. Coltura le cellule a 37 ° C in un incubatore a CO₂ 5% durante la notte. Il terreno di coltura può essere aggiornato dopo 3 h per rimuovere cellule nonadherent perché la maggior parte di questi linfociti. Le cellule aderenti sono principalmente i macrofagi, e possono aderire bene alla plastica tessuto-cultura-trattati.

3. test di fagocitosi macrofago utilizzando il microscopio a fluorescenza

1. Osservare le cellule al microscopio luminoso-campo per valutare la vitalità cellulare e la densità delle cellule.
2. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 100 µ l di terreno di coltura fresco e 10 µ l di sospensione batterica (circa 2 x 10⁷ cellule) in ogni pozzetto come descritto nella tabella 1. Incubare per 1 h a 37 ° C, 5% CO₂ incubator.
3. Lavare delicatamente 3 x x-5 con 500 µ l di PBS freddo per pozzetto per lavare noninternalized batteri.
4. Incubare le cellule con formaldeide 4% in PBS a temperatura ambiente per 30 min.
5. Lavare le cellule fisse 3 x con PBS (500 µ l/pozzetto).
6. Aggiungere 200 µ l di fluorescenza falloidina 633 tingere coniugato soluzione di lavoro (Vedi Tabella materiali) a macchiare la F-actina. Conservare in luogo buio, umido (60-80%) a temperatura ambiente per 60 min. Sciacquare le celle 3 x con PBS (500 µ l/pozzetto) per rimuovere qualsiasi falloidina in eccesso. Dalla macchiatura della F-actina, il citoplasma può essere schematizzata e aiutare a distinguere i batteri interiorizzati.
7. Aggiungere 200 µ l di soluzione di lavoro di DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) (1 µ g/mL) per macchiare il nucleo delle cellule ed incubare per 5 minuti in un luogo buio, umido, a temperatura ambiente. Sciacquare 1x con PBS (500 µ l/pozzetto) e 1 x con lo stesso volume di acqua distillata. Quindi, le cellule sarà pronte per l'osservazione al microscopio di fluorescenza invertito.

4. test di fagocitosi macrofago mediante citometria a flusso

1. Per ridurre al minimo gli errori sperimentali e fare una corretta interpretazione dei risultati, impostare i gruppi e tubi per l'esperimento di controllo come indicato nella tabella 2.
   1. Per il gruppo di controllo, che verrà posizionato sul ghiaccio (gruppo 4 della tabella 2), rimuovere il supporto dalla piastra 6 pozzetti e lavarlo 1x con PBS. Quindi, aggiungere 1 mL di EDTA freddo 70mm nel pozzo per staccare le cellule e trasferirli al tubo di citometria a flusso. Aggiungere 50 µ l di sospensione batterica nel tubo e posizionarlo sul ghiaccio per 1h.
   2. Per gli altri gruppi, rimuovere il terreno di coltura. Aggiungere 1 mL di medium fresco in ogni pozzetto. Aggiungere 50 µ l di sospensione batterica nei pozzetti secondo l'impostazione di gruppo, come descritto in tabella 2. Quindi, posizionare la piastra 6 pozzetti a 37 ° C, 5% CO₂ incubatrice per 1 h.
2. Per placare la fluorescenza di noninternalized e. coli, aggiungere 200 µ l di soluzione di acqua di cristallo viola (CV) 0,8% nel pozzo e ondeggiare poco, evitando così un risultato falso positivo dall'associazione che esprimono EGFP Escherichia coli alla superficie della macrofagi ma non interiorizzato. Lavare le cellule 3 x con PBS per rimuovere qualsiasi residuo CV.
3. Quindi, aggiungere 1 mL di EDTA freddo 70mm nel pozzo per staccare le cellule e trasferirli al tubo di citometria a flusso.
4. Centrifugare le provette a 400 x g per 5 min e scartare il surnatante.
5. Aggiungere 100 µ l di PBS per risospendere le cellule. Aggiungere 5 µ l di anticorpo F4/80-PE-coniugato (un antigene di superficie espresso sui macrofagi del mouse) in tubi o isotipo uso IgG2a-PE, in base all'impostazione di gruppo. Vortex brevemente e incubare i campioni in ghiaccio per 5-10 minuti al buio.
6. Aggiungere 1 mL di PBS in ogni provetta e centrifugare a 400 x g per 5 min, scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare con 200-300 µ l di PBS per l'analisi di citometria a flusso. Eseguire ogni tubo e acquisire i dati per almeno 10.000 eventi delle cellule F4/80⁺ .

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Risultati

Il vettore di animali-SUMO utilizza un modificatore di ubiquitin-come piccolo per consentire l'espressione di proteine native in Escherichia coli. Fusione di SUMO può significativamente aumentare la solubilità EGFP, permettendo così di essere individuati facilmente. Se l'espressione di EGFP correttamente è indotta da lattosio, colonie verde possono essere osservate nel buio (Figura 1A). Puntini verdi, che rappresentano il che esprimono EGFP e...

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Discussione

La procedura descritta in questo protocollo è abbastanza semplice e lineare. Una delle fasi critiche è di indurre l'espressione di EGFP su e. coli. Di solito, quando un gene da eucarioti, come EGFP, è progettato per esprimere nei procarioti come e. coli, c'è un rischio che la proteina si forma aggregati inattivi (corpi di inclusione), che cambia la struttura nativa e l'attività della proteina. Utilizzando il vettore animale-SUMO e costruendo il plasmide di animali-SUMO-EGFP, la proteina di fusione ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II Flow cytometer	BD Biosciences	-
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody	Biolegend	Cat101303
Champion pET SUMO Protein Expression system	Invitrogen	K300-01
Custom Gene Synthesis Service	Takara Biotech.	-
DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	ThermoFisher	D1306
F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS	Biolegend	Cat123110
Leica DMI3000 B  Inverted Microscope	Leica Microsystems	-
PE Rat IgG2a, κ-isotype control	Biolegend	Cat400507
Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution	AAT Bioquest	Cat23125
Thioglycollate medium	Sigma-Aldrich	T9032