Utilisant amélioré Fluorescence verte exprimant protéines Escherichia Coli pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris aide améliorée fluorescence verte exprimant protéines Escherichia coli.

Résumé

Ce manuscrit décrit une méthode simple et reproductible pour effectuer un test de la phagocytose. La première partie de cette méthode consiste à construire un vecteur animal-SUMO-EGFP (SUMO = petite ubiquitin-comme modificateur) et exprimant accrue de protéine de fluorescence verte (EGFP) chez Escherichia coli (BL21DE). Exprimant EGFP e. coli est co-incubée avec macrophages pendant 1 h à 37 ° C ; le groupe témoin négatif est incubé sur glace pendant le même laps de temps. Ensuite, les macrophages sont prêts pour évaluation. Les avantages de cette technique sont ses étapes simples et clairs, et phagocytose peut être mesurée par les deux flux cytomètre et fluorescence microscope. Les e. coli exprimant EGFP sont stables et de visualiser un signal de fluorescence forte même après que les macrophages sont fixés avec du paraformaldéhyde. Cette méthode est non seulement approprié pour l’évaluation de lignées de cellules macrophages ou macrophages primaires in vitro mais convient également pour l’évaluation des granulocytes et macrophages phagocytose dans les cellules mononucléaires de sang périphérique. Les résultats montrent que la capacité phagocytaire des macrophages péritonéaux de jeunes souris (huit semaines) est supérieure à celui des macrophages de souris âgées de (16 mois). En résumé, cette méthode mesure phagocytose du macrophage et est adaptée pour l’étude de la fonction du système immunitaire inné.

Introduction

Tests de phagocytose des macrophages sont souvent utilisés pour étudier le système immunitaire inné. La réponse immunitaire innée peut indiquer la susceptibilité à l’infection. Lignées de cellules macrophages sont largement utilisées dans les études d’immunologie. Toutefois, le passage prolongé peut causer la perte de gènes et compromis les fonctions immunitaires dans ces lignées de cellules. Ainsi, les macrophages péritonéaux primaires font l’objet idéal permettant d’étudier la fonction des cellules¹.

Bien que la réponse immunitaire innée pensait être intacte dans le corps âgé, la capacité phagocytaire peut diminuer par rapport à que dans le jeune corps^2,3. Ici, nous allons démontrer une méthode pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux d’young (huit semaines) et les personnes âgées (16 mois) souris aide exprimant EGFP e. coli, qui est pratique, rapide et rentable.

L’utilisation d’une souche exprimant EGFP e. coli est un des avantages de ce test, car ces bactéries sont stables et de visualiser un signal de fluorescence forte, même après que les macrophages sont fixés par la paraformaldéhyde à 4 % (p/v). En outre, en utilisant l' exprimant EGFP e. coli, les chercheurs n’ont pas besoin de coloration plus loin après la phagocytose, qui fait gagner du temps. En outre, les macrophages sont immunoresponsive pour l’antigène de surface d’e. coli , ce e. coli davantage adapté pour le dosage de la phagocytose que d’utiliser les champignons exprimant EGFP ou perles marqué à la fluorescéine.

Avec exprimant EGFP e. coli, un dosage de phagocytose peut être facilement réalisé en 2 h et mesuré par les deux microscopie écoulement cytometry et fluorescence, selon le but du chercheur. Étant donné que cette méthode permet de mesurer directement la capacité phagocytaire, les résultats sont plus reproductibles que d’autres méthodes indirectes.

Cette méthode a également été validée dans une lignée de cellules RAW264.7 et des cellules mononucléaires de sang périphérique humain⁴. Le texte ci-dessous fournit les instructions détaillées pour la réalisation de cet essai et met en évidence les étapes critiques que les chercheurs peuvent modifier pour répondre aux besoins de leurs expériences.

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Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées en vertu de la National Institutes of Health Guidelines pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, et les protocoles ont été approuvées par le Comité emploi de Dalian Medical University et animalier. Seize mois (avec un poids de 30-35 g) et huit semaines (20-25 g) SPF (spécifique-exempts de micro-organismes pathogènes) C57BL/6 des souris mâles ont été obtenues du centre animaux SPF de l’université médicale de Dalian. Toutes les souris étaient gardés dans la stabulation avec accès à la nourriture et l’eau ad libitum. La température a été maintenue entre 20 et 24 ° C, l’humidité était de 40 % - 70 %, et l’éclairage était 12 h lumière/12 h d’obscurité. Les animaux ont été admis à s’acclimater à l’environnement pendant au moins 7 jours avant l’expérience.

1. construction du pET-SUMO-EGFP plasmide et induction de l’expression EGFP

1. Synthétiser le fragment de gène EGFP (une séquence de bp 717 synthétisé par un service de synthèse de gène personnalisé, voir Table des matières et 1 de fichier supplémentaire pour la séquence) et amplifier le fragment avec l’apprêt avant ( 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') et amorce de marche arrière (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), à l’aide de polymérase de Taq DNA de haute fidélité.
2. Pour garantir que les produits de réaction en chaîne (PCR) polymérase adénine porte-à-faux unique de 3' pour le clonage de TA à l’étape suivante, utilisez une extension de 30 min à 72 ° C après le dernier cycle (voir 1 de fichier supplémentaire pour des conditions d’amplification). Vérifier le produit PCR par électrophorèse sur gel d’agarose.
3. Cloner le produit de la PCR dans le vecteur animal-SUMO (voir Table des matières) à l’aide de la TA clonage méthode⁵ avec T4 DNA ligase. Incubez la réaction à la température ambiante (20-25 ° C) pendant 30 min. Le vecteur est linéarisé entre nucléotides 653 et 654 avec un 1 bp 5′ T-surplomb sur chaque brin.
4. Transformer le produit de ligation dans la souche BL21(DE) de e. coli chimiquement compétente comme suit : ajouter 5 µL (100 ng) du produit PCR à 100 µL de cellules capables de BL21(DE) par un choc thermique à 42 ° C pendant 90 s ; garder le mélange sur la glace pendant 3 min et ensuite, ajouter 400 µL de milieu de bouillon (LB) de lysogénie préalablement chauffé à 37 ° C, secouant pendant 1 h à 37 ° C et 120 tr/min.
5. Ensemencer 100 µL des bactéries sur la surface d’une plaque en LB-kanamycine (100 µg/mL) avec le lactose inducteur (0,5 mmol/L), ce qui donne de la souche d’expression EGFP. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
   Remarque : Si l’EGFP est exprimée avec succès, certaines colonies s’observe comme feu de vert brillant dans l’obscurité.
   1. Vous pouvez sélectionner des colonies pour vérifier le fragment inséré de EGFP par séquençage de l’ADN. Les amorces pour le séquençage de l’ADN sont : vers l’avant, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; inverse, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
6. Ensemencer une colonie positive dans 5 mL de milieu LB avec 100 kanamycine µg/mL. Incuber dans un 37 ° C, agitation incubateur à 120 tr/min pendant 2 h et ensuite, ajouter le lactose inducteur à une concentration finale de 0,5 mmol/L et continuez à secouer pendant 6 h, induisant expression EGFP. Empiriquement, en agitant pendant 6 h, la densité optique à 600 nm (DO600) peut atteindre 0,7 ou supérieur.
7. Ajouter 10 µL de milieu de culture bactérien sur une lame, recouvrir d’une lamelle et examiner l’expression de EGFP sous un microscope à fluorescence inversé. Les bactéries exprimant EGFP peuvent être stockés dans le milieu entre 2 et 8 ° C pendant plusieurs semaines.

2. isolement des macrophages péritonéaux et culture primaire de souris

1. Ajouter 3,5 g de thioglycolate dans 100 mL d’eau distillée et stériliser le mélange à la stérilité avant utilisation. Pomper le milieu thioglycolate dans la seringue stérile 1 mL dans la hotte pour l’injection péritonéale de la souris. Une souris par seringue permet d’éviter l’infection. L’utilisation de thioglycolate peut augmenter le nombre de macrophages. Les macrophages péritonéaux résidents peuvent être isolés sans thioglycolate mais avec bas conduit à macrophage.
2. Anesthésier la souris à l’aide d’une méthode approuvée par le Comité de l’utilisation et le soin des animaux locaux. Injecter 1 mL de milieu de thioglycolate de 3,5 % dans la cavité péritonéale de la souris avec la seringue de 1 mL, à l’aide d’une aiguille de 23 G.
   Remarque : En induisant l’anesthésie, l’injection péritonéale peut être effectuée facilement et réduit le risque de blessures aux organes internes causées par injection.
3. Maintenir la souris avec de l’eau et l’alimentation ad libitum pendant 3 jours. Surveiller la prise de poids et de la nourriture des corps de l’animal tous les jours. Si la perte de poids est supérieure à 10 % dans les 3 jours, exclure l’animal de l’expérience.
4. Après 3 jours, euthanasier la souris par dislocation cervicale après induisant rapidement anesthésie par sévoflurane dans une boîte fermée. Vous pouvez également utiliser une méthode qui a été approuvée par le comité local de soin et l’utilisation d’animaux à euthanasier la souris.
5. Placez la souris dans un plat (avec un diamètre de 10 cm) avec 75 % d’éthanol à stériliser et transférer rapidement dans la hotte. Placez la souris sur une assiette et la broche de la patte avant à l’Office de fixer la position de la souris.
6. À l’aide d’une seringue de 5 mL, attachée à un 20 G aiguille, en plaçant le biseau de l’aiguille vers le haut à un angle de 30° à 40°, injecter physiologique 5 mL de froid (4-10 ° C) tamponnée au phosphate (PBS) au bas de l’abdomen dans la cavité péritonéale de la souris, en évitant toute perforation de l’intestin. Si l’intestin (ou tout autre organe) est percé, la souris et ses cellules n’est plus utilisable pour des expériences, comme cela peut activer les cellules qui ne sont pas adaptés pour la culture de cellules primaires.
7. Effectuer un massage doux sur les deux côtés de l’abdomen de la souris. Ensuite, aspirer le liquide lentement et doucement. Diluer le liquide péritonéal dans un tube à centrifuger 50 mL. Répéter ces étapes 2 x ou 3 x.
8. Centrifuger les cellules suspendues pendant 10 min à 400 x g dans une centrifugeuse réfrigérée (4 à 8 ° C). Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans un milieu RPMI 1640 avec 10 % sérum fœtal (SVF). Compter les cellules non vides. Empiriquement, la densité cellulaire est approximativement égale à 5 x 10⁶ cellules/mL quand les cellules sont remises en suspension dans 10 mL de milieu.
9. Ajouter 5 x 10⁶ cellules dans chaque puits d’une plaque de 6 puits pour le dosage de cytométrie en flux et 5 x 10⁵ cellules / puits dans une plaque de 24 puits pour un microscope à fluorescence. La culture des cellules à 37 ° C dans une étuve à₂ CO 5 % du jour au lendemain. Le milieu de culture peut être actualisé après 3 h pour éliminer les cellules non adhérentes, car la plupart d'entre eux sont des lymphocytes. Les cellules adhérentes sont principalement les macrophages, et elles peuvent adhèrent parfaitement à la plastique de tissu-culture-traitée.

3. dosage de phagocytose macrophage à l’aide de la microscopie à fluorescence

1. Observer des cellules au microscope lumineux-zone pour évaluer la viabilité des cellules et la densité cellulaire.
2. Retirer le milieu de culture de la plaque 24 puits. Ajouter 100 µL de milieu de culture frais et 10 µL de la suspension bactérienne (environ 2 x 10⁷ cellules) dans chaque puits comme décrit dans le tableau 1. Incuber pendant 1 heure dans un 37 ° C, 5 % CO₂ incubateur.
3. Laver délicatement 3 x x-5 avec 500 µL de PBS froid / puits pour laver les bactéries noninternalized.
4. Incuber les cellules avec 4 % de formaldéhyde dans du PBS à température ambiante pendant 30 min.
5. Laver les cellules fixes 3 x avec du PBS (500 µL/puits).
6. Ajouter 200 µL de la fluorescence de la phalloïdine 633 teindre conjugué solution de travail (voir Table des matières) pour colorer l’actine-F. Conserver dans un endroit sombre et humide (60-80 %) à température ambiante pendant 60 min. rincer les cellules 3 x avec du PBS (500 µL/puits) pour enlever tout excès phalloïdine. Par coloration de l’actine-F, le cytoplasme peuvent être esquissées et aider à distinguer les bactéries intériorisées.
7. Ajouter 200 µL de solution de travail DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole) (1 µg/mL) pour souiller le noyau de la cellule et incuber pendant 5 min dans un endroit sombre et humide à température ambiante. Rincez 1 x avec du PBS (500 µL/puits) et 1 x avec le même volume d’eau distillée. Ensuite, les cellules sera prêts pour l’observation sous un microscope à fluorescence inversé.

4. dosage de phagocytose macrophage utilisant l’écoulement cytometry

1. Pour minimiser les erreurs expérimentales et faire une interprétation correcte des résultats, définir les groupes et contrôler les tubes pour l’expérience telles qu’énumérées dans le tableau 2.
   1. Pour le groupe témoin, qui sera mis sur la glace (groupe de 4 dans le tableau 2), retirer le support de la plaque de 6 puits et lavez-le 1 x avec du PBS. Ensuite, ajouter 1 mL d’EDTA froid 70 mM dans le puits pour détacher les cellules et les transférer dans le tube de cytométrie de flux. Ajouter 50 µL de la suspension bactérienne dans le tube et placez-le sur la glace pendant 1 h.
   2. Pour les autres groupes, enlevez le milieu de culture. Ajouter 1 mL de milieu frais dans chaque puits. Ajouter 50 µL de la suspension bactérienne dans les puits selon le paramètre de groupe, tel que décrit dans le tableau 2. Ensuite, placez la plaque 6 puits dans les 37 ° C, 5 % CO₂ incubateur pendant 1 h.
2. Pour étancher la fluorescence de la noninternalized e. coli, ajouter 200 µL de solution d’eau de 0,8 % cristal violet (CV) dans le puits et se balancent sous peu, évitant ainsi un résultat faussement positif par la liaison exprimant EGFP e. coli à la surface de la macrophages mais pas intériorisé. Laver les cellules 3 x avec PBS pour enlever n’importe quel CV résiduelle.
3. Ensuite, ajouter 1 mL d’EDTA froid 70 mM dans le puits pour détacher les cellules et les transférer dans le tube de cytométrie de flux.
4. Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
5. Ajouter 100 µL de PBS pour remettre en suspension les cellules. Ajouter 5 µL d’anticorps F4/80-PE-conjugué (un antigène de surface exprimé sur les macrophages de souris) dans les tubes ou isotype IgG2a-PE d’usage, selon le paramètre de groupe. Vortex brièvement et incuber les échantillons sur la glace pendant 5-10 min à l’obscurité.
6. Ajouter 1 mL de PBS dans chaque tube et centrifuger à 400 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant. Remettre en suspension les granules cellulaires avec 200 à 300 µL de PBS pour analyse en cytométrie en flux. Exécutez chaque tube et acquisition de données au moins 10 000 événements de cellules F4/80⁺ .

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Résultats

Le vecteur de pET-SUMO utilise un modificateur d’ubiquitin-comme petit pour permettre l’expression des protéines natives dans le e. coli. Fusion de SUMO peut considérablement améliorer la solubilité EGFP, lui permettant d’être détecté facilement. Si l’expression EGFP est induite avec succès en lactose, vous peuvent observer des colonies vertes dans l’obscurité (Figure 1 a). Les points verts, qui représentent l' exprimant EGFP ...

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Discussion

Les étapes décrites dans le présent protocole sont assez simples et clairs. Une des étapes essentielles est d’induire l’expression EGFP sur e. coli. Habituellement, lorsqu’un gène d’eucaryotes, comme EGFP, est prévu d’exprimer chez les procaryotes comme e. coli, il y a un risque que la protéine se forment des agrégats inactifs (corps d’inclusion), qui modifie la structure native et l’activité de la protéine. En utilisant le vecteur animal-SUMO et construire le plasmide de pET-SUM...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II Flow cytometer	BD Biosciences	-
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody	Biolegend	Cat101303
Champion pET SUMO Protein Expression system	Invitrogen	K300-01
Custom Gene Synthesis Service	Takara Biotech.	-
DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	ThermoFisher	D1306
F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS	Biolegend	Cat123110
Leica DMI3000 B  Inverted Microscope	Leica Microsystems	-
PE Rat IgG2a, κ-isotype control	Biolegend	Cat400507
Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution	AAT Bioquest	Cat23125
Thioglycollate medium	Sigma-Aldrich	T9032