녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해

요약

여기, 우리 향상 된 녹색 형광 단백질 표현 대장균을 사용 하 여 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

초록

이 원고 먹어서 분석 결과 수행 하는 간단 하 고 재현할 수 방법을 설명 합니다. 이 방법의 첫 번째 부분 포함 애완 동물-스모-EGFP 벡터 구축 (스모 = 작은 유비퀴틴-같은 한정자) 녹색 형광 단백질 (EGFP) 대장균 (BL21DE)에서 향상 된 표현. EGFP 표현 대장균 은 37 ° C에서 1 시간에 대 한 대 식 세포와 coincubated 부정적인 제어 그룹은 시간의 동일한 금액에 대 한 얼음에 알을 품을. 다음, 대 식 세포는 평가 대 한 준비. 이 기술의 장점 간단 하 고 간단한 절차, 그리고 먹어서 두 흐름 cytometer 및 형광 현미경에 의해 측정 될 수 있다. EGFP 표현 대장균 안정 하 고 대 식 세포는 paraformaldehyde로 고정 한 후에 강한 형광 신호를 표시 합니다. 이 방법은 뿐만 아니라 대 식 세포 세포 선 또는 기본 세포 생체 외에서의 평가 적합 하지만 granulocyte 및 monocyte 주변 혈액 단 세포에서 식 균 작용의 평가 위해 또한 적당 한. 결과 보여 젊은 (8 주 된) 쥐에서 복 막 대 식 세포의 phagocytic 기능 세 (16 개월) 쥐에서 대 식 세포의 그것 보다 높다. 요약 하자면,이 방법은 대 식 세포 식 균 작용 고 타고 난 면역 계통 기능 공부를 위해 적당 한 이다.

서문

대 식 세포 식 균 작용 분석 자주 타고 난 면역 기능을 공부 하는 데 사용 됩니다. 타고 난 면역 반응 감염 민감성을 나타낼 수 있습니다. 대 식 세포 세포 라인 면역학 연구에 널리 사용 됩니다. 그러나, 확장된 통로 유전자 손실이 발생할 수 있습니다 및 이러한 셀 라인에서 면역 기능을 손상. 따라서, 기본 복 막 대 식 세포는 세포 기능¹을 공부 하는 이상적인 개체.

타고 난 면역 반응 세 본문에 그대로 생각 했다, 비록 phagocytic 능력 그는 더 젊은에^2,3바디 비해 줄어들 수 있습니다. 여기, 우리가 영 (8 주-오래 된)와 세 (16 개월) 마우스 EGFP 표현 대장균은, 빠르고, 편리 하 고 경제적으로 실현 가능한를 사용 하 여 복 막 대 식 세포의 식 균 작용을 평가 하는 방법을 보여줄 것입니다.

이러한 박테리아는 안정 되 고 대 식 세포는 4% (w/v) paraformaldehyde로 고정 한 후에 강한 형광 신호를 표시 하기 때문에 EGFP 표현 E. 콜라이 긴장의 사용이 분석이 결과의 장점 중 하나입니다. 또한, 대장균의 EGFP 표현 사용 하 여 연구원은 필요 하지 않습니다 더 먹어서, 시간 후 얼룩. 또한, 대 식 세포는 대장균 EGFP 표현 버섯 또는 구슬 fluorescein 표시를 사용 하 여 보다 더 먹어서 분석 결과 대 한 적당 한 만드는 대장균 표면 항 원에 대 한 immunoresponsive.

EGFP 표현 대장균, 함께 먹어서 분석 결과 쉽게 2 시간에서 달성 고 두 흐름 cytometry 및 형광 현미경 검사 법, 연구자의 목적에 따라 측정. 때문에이 메서드는 직접 phagocytic 능력을 측정, 결과 다른 간접적인 방법 보다 더 재현.

이 방법은 또한 RAW264.7 세포 라인에서 검증 된 그리고 인간 주변 혈액 단 세포⁴. 텍스트 아래이 분석 결과 수행 하기 위한 자세한 단계별 지침을 제공 하 고 연구원은 그들의 실험의 요구에 맞게 수정할 수 있습니다 중요 한 단계를 강조.

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프로토콜

모든 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 국가 학회 건강 지침에 따라 수행한 및 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회의 대련 의과대학에 의해 승인 했다. 16-달-오래 된 (와 함께 30-35 g의 몸 무게)와 8 주 오래 된 (20-25 g) SPF (특정 병원 체 자유로운) 남성 C57BL/6 마우스 대련 의과대학의 SPF 동물 센터에서 입수 했다. 모든 마우스 액세스와 동물 주택에 음식과 물 광고 libitum를 유지 했다. 온도 20-24 ° C에서 유지 되었다, 습도 40%-70%, 이었고 조명 12 h 빛/12 h 어두운 했다. 동물 실험 전에 적어도 7 일 동안 환경에 적응을 허용 되었다.

1. 건설 애완 동물-스모-EGFP 플라스 미드의 EGFP 식의 유도

1. 합성 EGFP 유전자 조각 (717 bp 시퀀스 사용자 지정 유전자 합성 서비스에 의해 합성 참조 테이블의 자료 와 보충 파일 1 시퀀스) 앞으로 뇌관 (단편 증폭 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') 및 뇌관 역 (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), 고 충실도 Taq DNA 중 합 효소를 사용 하 여.
2. 마지막 주기 (PCR 조건에 대 한 보충 파일 1 참조) 후 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 제품 다음 단계에서 TA 복제에 대 한 단일 3' 아데닌 돌출부는 되도록 72 ° C에서 30 분 확장을 사용 합니다. Agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR 제품을 확인 하십시오.
3. 애완 동물-스모 벡터에 PCR 제품을 복제 ( 재료의 표참조) T4 DNA 리가와 방법⁵ 를 복제 하는 TA를 사용 하 여. 30 분 동안 실내 온도 (20-25 ° C)에 반응을 품 어. 벡터는 뉴클레오티드 653 및 1 bp 5 ' T-각 가닥에 오버행으로 654 사이 오는지.
4. 화학적으로 유능한 BL21(DE) E. 콜라이 긴장으로 결 찰 제품을 다음과 같이 변환: 5 µ L 추가 (100 ng) BL21(DE) 90 42 ° C에 열 충격을 통해 유능한 세포의 100 µ L PCR 제품의 s; 3 분 동안 얼음에 혼합물을 계속 하 고, 37 ° C에서와 120 rpm에서 1 h 동안 흔들어 37 ° C에 미리 데워 lysogeny 국물 (파운드) 매체의 400 µ L 추가.
5. 100 µ L 유도 유 당 (0.5 m m o l/L), 파운드-대 (100 µ g/mL) 판의 표면에 박테리아의 EGFP 식 스트레인 저조한 접종 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어.
   참고: 지금까지 EGFP 성공적으로 표현 하는 경우에 일부 식민지 어둠 속에서 빛나는 녹색 빛으로 관찰할 수 있습니다.
   1. DNA 시퀀싱에 의해 삽입 된 EGFP 조각 확인 식민지, 선택 합니다. DNA 연속을 위한 뇌관은: 앞으로, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; 역, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
6. 긍정적인 식민지 100 µ g/mL 대와 파운드 매체의 5 mL에 접종. 2 h, 120 rpm에서 인큐베이터를 떨고 37 ° C에 품 어 다음, 0.5 mmol/L의 최종 농도에 유도 유 당을 추가 하 고 EGFP 식 유도 6 h에 대 한 동요를 계속. 경험적으로 때 6 h, 600에서 광학 밀도 흔들어 nm (OD600) 0.7에 도달 수 있습니다 이상.
7. 슬라이드에 세균성 문화 매체의 10 µ L을 추가 하 고는 coverslip로 커버 한 표현의 EGFP 거꾸로 형광 현미경 검사. EGFP 표현 박테리아는 몇 주 동안 2-8 ° C에 매체에 저장할 수 있습니다.

2. 마우스 복 막 대 식 세포 분리 및 주 문화

1. 100 mL의 증류수 그리고 압력솥 사용 하기 전에 불 임에 혼합물을 thioglycolate의 3.5 g을 추가 합니다. 마우스의 복 막 주입에 대 한 후드에 1 mL 균 주사기로 thioglycolate 매체를 펌프. 감염을 피하기 위해 주사기 당 한 마우스를 사용 합니다. Thioglycolate 사용 하 여 대 식 세포의 수를 증가할 수 있다. 상주 복 막 대 식 세포는 고립 될 수 있다 thioglycolate 없이 하지만 낮은와 대 식 세포 생성.
2. 현지 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 하는 방법을 사용 하 여 마우스 anesthetize 1 mL 주사기, 바늘 23 G를 사용 하 여 마우스의 복 막 구멍으로 3.5 %thioglycolate 매체의 1 mL를 주사.
   참고: 마 취 유도, 복 막 주입 쉽게 수행 될 수 있습니다 및 주입으로 인 한 내부 장기에 부상의 위험을 감소 시킨다.
3. 3 일 동안 물과 음식 광고 libitum 와 마우스를 유지. 매일 동물의 몸 무게와 음식 섭취 량을 모니터링 합니다. 몸 무게 감량 3 일 이내 10% 보다 큰 경우에, 실험에서 동물을 제외 합니다.
4. 3 일 후, 마우스를 빠르게 sevoflurane 닫힌된 상자에 의해 마 취 유도 후 자 궁 경부 전위에 의해 안락사. 또는, 마우스를 안락사를 로컬 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었습니다 방법을 사용 합니다.
5. 75% 에탄올 소독, 마우스 (10 cm 직경)와 함께 그릇에 넣어 고 후드에 신속 하 게 그것을 전송. 접시에 마우스를 놓고 마우스의 위치를 해결 하기 위해 보드에 앞 발을 고정 합니다.
6. 20 G에 연결 된 5 mL 주사기를 사용 하 여 바늘, 30 °-40 ° 각도에서 바늘 경사를 배치 인산 염 버퍼 감기 (4-10 ° C)의 5 mL 식 염 수 (PBS) 낮은 복 부에에 주입 마우스의 복 막 구멍, puncturing 창 피하고 있습니다. 경우는 대 장 (또는 다른 기관) 구멍은, 마우스를 해당 셀 더 이상 사용할 수 없습니다 실험,로이 기본 세포 배양에 적합 하지 않은 세포를 활성화할 수 없습니다.
7. 마우스의 복 부의 두 측면에 부드러운 마사지를 수행 합니다. 그런 다음, 부드럽게 그리고 천천히 액체를 발음. 50 mL 원심 분리기 관으로 복 막 액체 분배. 이 2 배 또는 3 배 단계를 반복 합니다.
8. 냉장된 원심 분리기 (4-8 ° C)에서 400 x g 에서 10 분 동안 정지 세포 원심 삭제는 상쾌한 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 RPMI 1640 매체에 셀 펠 릿 resuspend. 셀을 계산 합니다. 경험적으로, 셀 밀도 약 5 x 10⁶ 셀/mL 셀은 매체의 10 mL에 resuspended 때.
9. 교류 cytometry 분석 결과 및 형광 현미경에 대 한 24-잘 접시에 잘 당 5 x 10⁵ 셀에 대 한 6 잘 플레이트의 각 음에 5 x 10⁶ 셀을 추가 합니다. 밤새 5% CO₂ 배양 기에서 37 ° C에서 세포 문화. 문화 매체 때문에 이들의 대부분은 세포 nonadherent 세포를 제거 하는 3 h 후는 새로 고칠 수 있습니다. 부착 세포는 주로 대 식 세포, 그리고 그들은 잘 조직 문화 취급 하는 플라스틱에 고착 할 수 있다.

3. 대 식 세포 식 균 작용 분석 결과 형광 현미경을 사용 하 여

1. 세포 생존 능력 및 셀 밀도 밝은 분야 현미경으로 세포를 관찰 합니다.
2. 24-잘 접시에서 문화 매체를 제거 합니다. 표 1에 설명 된 대로 각 우물에 신선한 문화 매체의 100 µ L와 10 µ L 세균성 중지 (약 2 × 10⁷ 셀)을 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO₂ 배양 기에서에서 1 시간에 품 어.
3. 부드럽게 noninternalized 박테리아를 잘 당 3 x-5 x 차가운 PBS의 500 µ L 씻어.
4. 30 분 동안 실내 온도에 PBS에 4% 포름알데히드와 셀을 품 어.
5. 고정된 셀 3 세척 PBS 가진 x (500 µ L/잘).
6. Phalloidin 633 형광의 200 µ L 염색 활용된 작업 솔루션 추가 ( 재료의 표참조) F-말라 얼룩. 60 분에 대 한 실 온에서 어두운, 습 한 장소 (60%-80%)에 게 린스 셀 3 PBS 가진 x (500 µ L/잘) 어떤 과잉 phalloidin 제거 하. F-말라 얼룩, 세포질 설명 수 고 내 면된 박테리아를 구별 하는 데 도움이.
7. 세포 핵 얼룩 및 실 온에서 어두운, 습 한 장소에 5 분 동안 품 어 DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) 작업 솔루션 (1 µ g/mL)의 200 µ L를 추가 합니다. PBS 가진 1 x 린스 (500 µ L/잘)와 같은 양의 증류수를 가진 1 x. 그런 다음, 셀 거꾸로 형광 현미경 관찰에 대 한 준비가 될 것입니다.

4. 대 식 세포 식 균 작용 분석 결과 cytometry 사용 하 여

1. 실험 오류를 최소화 하 고 결과의 적절 한 해석 하 게 그룹을 설정 하 고 표 2에 나열 된 실험에 대 한 튜브를 제어.
   1. 컨트롤 그룹에 대 한는 얼음 ( 표2에서 그룹 4)에 배치 됩니다, 6 잘 플레이트에서 매체를 제거 하 고 그것을 씻어 PBS 가진 1 x. 다음, 세포를 분리 하 여 교류 cytometry 튜브에 그들을 전송 우물에 70 m m 감기 EDTA의 1 mL를 추가 합니다. 튜브에 세균 현 탁 액의 50 µ L을 추가 하 고 1 시간에 대 한 얼음에 배치.
   2. 다른 그룹에 대 한 문화 매체를 제거 합니다. 각 우물에 신선한 매체의 1 mL를 추가 합니다. 표 2에 설명 된 대로 그룹 설정에 따라 우물에 세균 현 탁 액의 50 µ L를 추가 합니다. 다음, 37 ° C, 5% CO₂ 인큐베이터 1 시간에에서 6-잘 접시를 놓습니다.
2. Noninternalized 대장균의 형광을 풀기 위해 우물에 0.8% 크리스탈 바이올렛 (CV) 물 솔루션의 200 µ L을 추가 하 고 곧, 거짓 양성 결과의 표면에 EGFP 표현 대장균 바인딩에 의해 피할 영향력은 대만 내 면 되지. 3 셀을 씻어 모든 잔여 이력서를 제거 하는 PBS 가진 x.
3. 다음, 세포를 분리 하 여 교류 cytometry 튜브에 그들을 전송 우물에 70 m m 감기 EDTA의 1 mL를 추가 합니다.
4. 5 분에 대 한 400 x g 에서 튜브 원심 및 삭제는 상쾌한.
5. Resuspend 셀을 PBS의 100 µ L를 추가 합니다. 그룹 설정에 따라 튜브, 또는 사용 IgG2a PE isotype F4/80-PE-활용 된 항 체 (마우스 대 식 세포에 표면 항)의 5 µ L를 추가 합니다. 짧게 소용돌이 어둠 속에서 5-10 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.
6. 각 관으로 PBS의 1 mL을 추가 하 고 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한 삭제. 교류 cytometry 분석에 대 한 PBS의 200-300 µ L로 셀 펠 릿 resuspend 각 튜브를 실행 하 고 f 4/80⁺ 세포의 적어도 10, 000 건의 데이터.

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결과

애완 동물-스모 벡터 대장균에서 네이티브 단백질의 식을 수 있도록 작은 유비퀴틴-같은 한정자를 사용 합니다. 스모 퓨전 크게 쉽게 감지 될 수 있도록 EGFP 가용성을 높일 수 있다. EGFP 식 성공적으로 유 당에 의해 유발 됩니다, 경우 (그림 1A) 어둠 속에서 녹색 식민지를 관찰할 수 있습니다. 녹색 점, EGFP 표현 대장균을 나타내는 40 x 목표...

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토론

이 프로토콜에서 단계는 매우 간단 하 고 간단 합니다. 중요 한 단계 중 하나는 대장균에 EGFP 식을 유도 하는 것입니다. 일반적으로, EGFP, 같은 진핵생물에서 유전자를 대장균같은 원핵생물에서 표현 하 계획 하는 경우는 단백질의 기본 구조 및 활동 변경 단백질 비활성 집계 (포함 시체)를 형성할 것 이다 위험이 있다. 애완 동물-스모 벡터를 사용 하 여 애완 동물-스모-EGFP 플라스 미드...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II Flow cytometer	BD Biosciences	-
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody	Biolegend	Cat101303
Champion pET SUMO Protein Expression system	Invitrogen	K300-01
Custom Gene Synthesis Service	Takara Biotech.	-
DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	ThermoFisher	D1306
F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS	Biolegend	Cat123110
Leica DMI3000 B  Inverted Microscope	Leica Microsystems	-
PE Rat IgG2a, κ-isotype control	Biolegend	Cat400507
Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution	AAT Bioquest	Cat23125
Thioglycollate medium	Sigma-Aldrich	T9032