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要約

ここでは、密閉型無線ナノポア電極の作製と単一ナノ粒子の衝突のそれに続く電気化学的測定のためのプロトコルを提案する.

要約

Nanoelectrochemistry による単一ナノ粒子の本質的な特徴を測定深い基本的な重要性を保持しているし、ナノサイエンスの潜在的な影響を持っています。ただし、単一ナノ粒子の電気化学的分析として挑戦、センシング ナノグリーンは手に負えない。このような課題に対処するため述べるここ作製と展示形態が高度制御と優れた再現性密閉型無線ナノポア電極 (WNE) の評価。WNE の安易な作製には、クリーン ルームや高価な機器を使用せず一般の化学実験で明確に定義された電極の準備ができます。1 つのアプリケーション、30 の 0.6 pA の高い現在の解像度を示し、高時間分解能 0.01 さん伴う優れた形態、小型密閉型 WNE 混合物単一金ナノ粒子の分析では強調 nm単一分子・ イオンの検出そして単一セルのプロービングにナノ粒子のキャラクタリゼーションから直径、密閉型 WNEs のより多くの潜在的なアプリケーションを拡張できます。

概要

ナノ粒子が触媒機能、特定の光学機能、electroactivity、高の表面・体積比1,2,3など多様な機能のため多大な注目を集めています。4. 単一ナノ粒子の電気化学的解析、ナノスケール レベルで本質的な化学的・電気化学的プロセスを理解するための直接法。単一ナノ粒子の非常に敏感な測定を達成するために 2 つの電気化学的アプローチは、現在応答5,6,7からナノ粒子の情報を読み出すため以前適用されています。これらの方法の 1 つには、固定または電極8,9の研究によりのインターフェイス上の個々 のナノ粒子をキャプチャが含まれます。その他の戦略は、動的な酸化還元プロセスから過渡電流の揺らぎを生成する電極の表面で単一ナノ粒子衝突によって駆動されます。

これらのメソッドの両方は、単一ナノ粒子の直径に一致するナノスケールの超高感度センシング インターフェイスを必要があります。ただし、電極の伝統的な製造主に搭載マイクロ電気機械システム (MEMS) または退屈と undisciplinable1011,12である技術を引っ張ってレーザー 13。たとえば、電極の作製を MEMS ベースは高く、大規模な生産および電極の普及を制限するクリーン ルームの使用が必要です。その一方で、電極の作製を引っ張ってレーザーは中にシールと毛細血管の内側の金属ワイヤのプル、オペレーターの経験に大きく依存します。金属ワイヤで毛細血管にしっかりと密封されてない場合、nanopipette の内壁とワイヤ間のギャップを大幅に余分なバック グラウンド電流ノイズを導入し、ゲルロボットのセンシング エリアを拡大します。これらの欠点は、主として、違いの感度を低下させます。一方、ギャップの存在は、電極面積を拡大し、違いの感度を低減できます。結果として、各製造プロセス14,15で手に負えない電極形態による再現性のあるパフォーマンスを保証するは難しいです。したがって、再現性の優れたナノ電極の一般的な製造方法は単一ナノ粒子の本質的な機能の電気化学的探査を容易にすることが急務します。

最近では、ナノ細孔技術は単一分子解析16,17,18,19,20のエレガントでラベル無料アプローチとして開発されたが。その制御の作製により、nanopipette はレーザー キャピラリー引き手21,22,23,24 で 30-200 nm に至る均一径ナノ閉じ込めを提供しています。.さらに、このシンプルで再現性のある施工により、nanopipette の一般化です。最近、我々 は、nanopipette 内部の金属ワイヤーのシーリングを必要としない無線ナノポア電極 (WNE) を提案しました。安易なと再現可能な製造プロセスを通じて、WNE 所有、ゲルロボット インターフェイス25,26,27,28 を形成する nanopipette 内のナノスケール金属蒸着.WNE では、明確に定義された構造およびその制限の制服の形態を所有している、ので、それは高い時間分解能を実行するための低抵抗容量 (RC) 時定数と同様に、現在の高解像度を実現します。以前、我々 は WNEs、開放型と密閉型、単一のエンティティ分析を実現するための 2 つのタイプを報告しました。オープン型の WNE イオン電流応答26に単一のエンティティのガルバニ電流の電流を変換する nanopipette の内壁に堆積したナノメタル層を採用しています。通常、オープン型 WNE の直径は約 100 nm。WNE の直径をさらに低減、固体金属ナノ針状が完全に化学・電気化学的アプローチを通じて nanopipette 先端を占める密閉型 WNE を提案します。このメソッドは、ナノポア閉じ込め中 30 nm の金ナノ針状を急速に生成できます。密閉型 WNE の先端領域で明確に定義されたインタ フェースは、単一ナノ粒子の電気化学測定の高い信号対雑音比を保証します。充電された金ナノ粒子は、密閉型の WNE と衝突とヒント界面超高速充放電プロセスはイオンの現在のトレースで容量性フィードバックの応答 (CFR) を誘導します。以前単一ナノ粒子衝突研究を介して金属と違い29内部配線と比較して、密閉型の WNE を示した 0.6 pA ± 0.1 pA (RMS) の高い現在の解像度と高い時間分解能 0.01 ms。

ここで、寸法と優れた再現性を制御高密閉型 WNE の詳細作製手順について述べる。このプロトコル、単純な AuCl4-と BH4反応で-は、nanopipette のオリフィスを完全にブロックする金ナノ針状を生成する設計されています。バイポーラ電気化学は、nanopipette 内の数 μ m の長さに達する金ナノ針状の持続的成長を採用しています。この簡単な手順がこの違い製造、クリーン ルームと高価な機器を使わず、一般的な化学の研究室で実施することができますを実現。 にします。サイズ、形態、および密閉型 WNE の内部構造を確認するのには、このプロトコルは、走査型電子顕微鏡 (SEM) と蛍光分光法の利用による詳細な評価手順を提供します。金ナノ粒子 (結果) 衝突の密閉型 WNE ナノグリーンへの本質的な動的な相互作用を直接測定する 1 つの最近の例は、強調表示されます。密閉型の WNE が単一エンティティ レベル センサー、ナノ材料、細胞の電気化学的研究の将来の新しいパスを開くかもしれないと考えています。

プロトコル

1. 溶液の調製

注: は、すべての化学物質の一般的な安全上の注意に注意を払います。ヒューム フードの化学薬品の処分し、白衣、ゴーグル、手袋を着用します。火や火花から引火性の液体を保ちます。純水 (25 ° C で 18.2 cm MΩ) を使用してすべての水溶液を調製しました。準備されたソリューションは、0.22 μ m 孔サイズ フィルターを使用してフィルター処理されなかった。

  1. KCl 溶液の調製
    1. 100 mL の脱イオン水での塩化カリウムの 0.074 g を溶解します。
  2. NaBH4溶液の調製
    1. 0.018 g エタノール 10 mL の水素化ホウ素ナトリウムを溶解します。
  3. HAuCl4溶液の調製
    1. 1 mL 1% 塩化金酸溶液に塩化カリウムの 0.010 g を溶解します。
  4. 準備シリコーンゴム
    1. シリコーンゴム ボリューム 1:1 の比率で含むパート A とパート B (材料の表を参照) をミックスします。
    2. 混合のシリコーンゴムを使用する鍋時間 1 分の間に即座にスライドで反応面積を塗りつぶします。
    3. 5 分用のスライド上の準備されたシリコーンゴムを治します。
  5. 30金ナノ粒子の調製
    1. 40 mL の激しく撹拌しながら脱イオン水に 1% の質量割合と塩化金酸の 4.8 mL を追加します。
    2. 熱沸騰させるソリューション。
    3. すぐに解決策に 1% の質量割合でクエン酸ナトリウム溶液 10 mL を追加します。
    4. 最終的な解決策が色の赤になるまでさらに 15 分のためのソリューションを加熱します。
      注: 場合、塩化金酸溶液急速に減少したクエン酸ナトリウムとソリューションが急速に明確な黄色から変更が観察された暗い黒に。

2. 実験のセットアップの準備

  1. 電流測定システムの準備
    1. 電流増幅器を含む現在の測定システムを入れます (材料の表を参照) と低騒音データ集録システム (材料の表を参照)
    2. 電圧クランプ モードに切り替えます。
    3. フィルターの帯域幅を 100 kHz に 10 kHz とサンプリング レートに設定します。
    4. 実験細胞と倒立顕微鏡にプリアンプの外部ノイズをシールドする自己設計されていた特定自家製銅ケージを組み立てる (材料の表を参照してください)。
    5. 地上、ファラデーケージのシェル、増幅器、および倒立顕微鏡システムのシェル。
  2. 暗視野の検出システムのセットアップ
    1. 内、nanopipette 金ナノ針状の世代は、暗視野顕微鏡によって監視されます。
      注: 倒立顕微鏡システム画像と散乱スペクトルを使用 (材料の表を参照してください)。Nanopipette、ナノ細孔中の電極の画像を取るにトゥルー カラー デジタル CCD カメラを採用します。暗視野コンデンサー [開口数 (NA) = 0.8 – 0.95)] を利用して、暗視野照明を形成します。10 X (NA = 0.3)、20 X (NA = 0.45)、および 40 X (NA = 0.6) 目標は密閉型の WNE の画像を収集するために使用されます。蛍光検出、さらにナノ針状と、nanopipette の内部の壁のギャップがあるかどうかを確認する使用されます。この実験を行う別の EMCCD (材料表参照) 倒立顕微鏡も統合し、励起光は 450-490 nm のバンドパス フィルターと内蔵水銀ランプ。

3. 密閉型 WNE の作製

  1. ピペットの作製
    1. 10 分間超音波洗浄のアセトンでいっぱい 15 mL 遠心管に石英毛細血管 (材料の表を参照) を置きます。
    2. アセトンを注ぎ、同じ遠心管にエタノールを追加します。
    3. クリーニングの 10 分間超音波洗浄機で遠心管を入れてください。
    4. 毛細血管を超音波洗浄の 10 分で、エタノールの除去のための脱イオン水で別の 15 mL 遠心管に入れます。
    5. 継続 3 回で毛細血管が残留エタノールを削除するきれいな純水超音波。
    6. 乾燥窒素ガス流を用いた毛細血管。
    7. 新しい、きれいなの遠心管中の毛細血管を保ちます。
    8. CO2レーザー引き手を入れます (材料の表を参照)
    9. 安定したレーザー出力を確保するための 15 〜 20 分のための引き手を予熱します。
    10. 引き手に洗浄毛細管をインストールします。
    11. 熱、フィラメント、速度、遅延、および特定の直径のための CO2レーザー引き手のパネルに牽引力の引きのパラメーターを設定します。このプロトコルでは 30 nm 直径 nanopipette を引っ張るため詳細なパラメーターは、表 1 (図 1) に表示されます。
    12. 再使用可能な接着剤でシャーレに準備された nanopipette を修正 (材料の表を参照) さらに特性評価のため。
  2. 作製密閉型の WNE
    1. Microloader と、nanopipette に調製した HAuCl4溶液の 10 μ L を挿入します。
    2. 遠心分離機の周り 1878 × g nanopipette の中の気泡を除去するために 5 分間 nanopipette。
      注: この手順では、2 mL 遠心チューブ内自家製ホルダーに下向きの先端と、nanopipette を出しました。
    3. Coverslip の準備のシリコーンゴムを使用、nanopipette を修正 (手順 1.4 参照)"cis"側として、nanopipette 内の領域を定義し、「トランス」側として外。
    4. ゴムが硬化するまでの 5 分を待ちます。
    5. 倒立顕微鏡の目的のテーブルに統合されたアンサンブルを置きます。
    6. オンにし、顕微鏡の対物レンズが 10 倍の nanopipette tip を集中する暗視野照明を調整します。
    7. 20 X、40 X 目標より高い空間分解能を変更します。
    8. 銀/塩化銀電極、nanopipette の内部に配置します。
    9. トランス側に他の接地の銀/塩化銀電極を配置します。
    10. 銀/塩化銀電極のペアを前置増幅器に接続します。
    11. 現在の測定システムと対応するソフトウェアをオンに (材料の表を参照してください) イオンの現在の録音のため。
    12. 300 に適用される可能性を設定 mV。
    13. ゆっくりと HAuCl4と NaBH4 (図 2) との反応を誘発するトランス側に NaBH4ソリューションの 150 μ L を追加します。
      注: NaBH4水溶液中での還元で行われる暴力的な反応速度。したがって、NaBH4の削減から H2の世代は金ナノ針状成長時に空洞の生成によって、半導体の欠陥のある構造を引き起こす可能性があります。
    14. 同時に、電気的、光学的記録現在のトレースと暗視野画像/散乱スペクトル現在測定と暗視野の検出システム (図 3) を使用します。
      注: エタノール溶液は暗視野照明下における揮発性です。作製時におけるエタノールの量に注意を払います。
    15. イオン現在にさかのぼって 0 後適用される可能性をオフにペンシルバニア州
    16. 準備を洗って流れる密閉型 WNE 先端に下から水を脱イオンします。
  3. 特性密閉型の WNE
    1. 走査型電子顕微鏡 (SEM) と密閉型 WNE を特徴付けるピペット22,31,32,33,34 の特性に対する一般的な方法であります。.
    2. カルシウム イオンの蛍光実験を使用して、nanopipette 中金ナノ針状のシール状態を確認します。
      1. トランス側に密閉型の WNE および蛍光 8 ソリューションcis側に CaCl2液の 10 μ L を注入します。
      2. 銀/塩化銀電極をパッチアンプ用アダプターに接続します。
    3. 400 mV のバイアス電位を適用し、EMCCD を使用 (材料表参照) の先端領域での蛍光応答を監視します。下に先端から密閉型の WNE を彫刻するフォーカス イオン ビーム (FIB) を使用し、内部の金属層または SEM 特性とナノ針状の長さを決定します。
  4. 密閉型の WNE 単一ナノ粒子衝突
    1. 密閉型の WNE の作製後 KCl 溶液にトランスシス側のソリューションを変更します。
    2. トランス側に 30 nm の金ナノ粒子溶液 50 μ L を転送します。300 の可能性で単一ナノ粒子衝突イベントの現在の信号の記録 mV (図 5)。
    3. 周波数、振幅、および現在の信号の形状変化を監視する電圧を変更します。

結果

石英コニカル nanopipette に基づいて適切に定義された 30 nm 無線ナノポア電極を作製する安易なアプローチを紹介します。図 13 つの主要な手順が含まれています、nanopipette の作製を示します。0.5 mm の内径と外径 1.0 mm マイクロキャピ ラリーは、引き手で固定し、レーザーは溶融石英キャピラリーの中心に焦点を当てた。力を毛細血管の端末に適用...

ディスカッション

明確に定義された nanopipette の作製は、密閉型の WNE 作製プロセスの最初のステップです。キャピラリーの中央に CO2レーザの焦点を当て、1 つ毛細血管はナノスケール円錐先端の 2 つの対称的なピペットに分割します。直径は至るまで 30-200 nm レーザーの引き手のパラメーターを調整することにより、簡単に制御されます。それは異なるピペットの引き手を引いてのパラメーターが変化...

開示事項

著者は利益相反行為を宣言しません。

謝辞

この研究は中国の国家自然科学基金 (61871183,21834001)、イノベーション プログラムの上海市教育委員会 (2017-01-07-00-02-E00023)、上海市教育から「広陳」プロジェクトでサポートされている委員会・上海教育開発財団 (17 CG 27)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneSigma-Aldrich650501Highly flammable and volatile
Analytical balanceMettler ToledoME104E
Axopatch 200B amplifierMolecular Devices
Blu-Tack reusable adhesiveBostik
Centrifuge tubeCorning Inc.Centrifuge Tubes with CentriStar Cap, 15 ml
Chloroauric acidEnergy ChemicalE0601760010HAuCl4
Clampfit 10.4 softwareMolecular Devices
Digidata 1550A digitizerMolecular Devices
DS Fi1c true-color CCD cameraNikon
Ecoflex 5 Addtion cure silicone rubberSmooth-On17050377
Eppendorf Reference 2 pipettesEppendorf49200090410, 100 and 1000 µL
EthanolSigma-Aldrich24102Highly flammable and volatile
Faraday cageCopper
iXon 888 EMCCDAndor
Microcentrifuge tubesAxygen Scientific0.6, 1.5 and 2.0 mL
MicroloaderEppendorf5242 956.00320 µL
Microscope Cover GlassFisher ScientificLOT 1693820 mm*60 mm-1 mm thick
Milli-Q water purifierMilliporeSIMS00000Denton Electron Beam Evaporator
P-2000 laser pullerSutter Instrument
Pipette tipsAxygen Scientific10, 200 and 1,000 µL
Potassium chloride,+D25+A2:F2+A2:F25Sigma AldrichP9333-500GKCl
Quartz pipettesSutterQF100-50-7.5O.D.:1.0 mm, I.D.:0.5 mm, 75 mm length
RefrigeratorSiemens
Silicone thinnerSmooth-On1506330
Silver wireAlfa Aesar11466
Sodium borohydride,Tianlian Chem. Tech.71320NaBH4
Ti-U inverted dark-field microscopeNikon

参考文献

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