Un electrodo Nanopore inalámbricas cerradas para el análisis de las nanopartículas individuales

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la fabricación de un electrodo nanopore inalámbricas cerradas y posterior medición electroquímica de colisiones de nanopartículas individuales.

Resumen

Medición de las características intrínsecas de las nanopartículas individuales por demostrable tiene profunda importancia y posibles impactos en Nanociencia. Sin embargo, analizando electroquímicamente nanopartículas solo es un reto, como el sensor nanointerface es incontrolable. Para abordar este desafío, se describen aquí la fabricación y caracterización de un electrodo nanopore inalámbricas cerradas (vino) que exhibe una morfología altamente controlable y reproducibilidad excepcional. La fácil fabricación de vino permite la preparación de nanoelectrodos definidas en un laboratorio de química general sin el uso de un equipo caro y limpio. Una aplicación de 30 nm cerradas vino en análisis de nanopartículas de oro individuales en la mezcla también se destaca, que muestra una resolución actual de 0,6 pA y alta resolución temporal de 0.01 Sra. acompañado por su excelente morfología y pequeñas diámetros, más aplicaciones potenciales de WNEs cerradas pueden ser ampliados de caracterización de nanopartículas y detección única molécula/ion unicelular de sondeo.

Introducción

Las nanopartículas han atraído gran atención debido a diversas características como su capacidad catalítica, características ópticas, electroactivity y alta relación superficie a volumen^{1,2,3, 4}. análisis electroquímico de nanopartículas individuales es un método directo para la comprensión de los procesos químicos y electroquímicos intrínsecos a nivel de nanoescala. Para lograr mediciones altamente sensibles de nanopartículas individuales, dos métodos electroquímicos se han aplicado anteriormente para leer información de nanopartículas de actual respuestas^5,6,7. Uno de estos enfoques consiste en inmovilizar o capturando un nanopartículas individuales de la interfaz de la nanoelectrode para el estudio de Electrocatálisis^8,9. La otra estrategia es impulsada por nanopartículas única colisión con la superficie de un electrodo, que genera una fluctuación corriente transitoria del proceso dinámico redox.

Ambos de estos métodos requieren una interfaz detección ultrasensible de nanoescala que coincide con el diámetro de las nanopartículas individuales. Sin embargo, la tradicional fabricación de nanoelectrodos principalmente ha incorporado los sistemas micro electromecánicos (MEMS) o láser tirando de técnicas, que son tediosas y undisciplinable^{10,11,12, 13}. Por ejemplo, fabricación basados en MEMS de nanoelectrodos es costoso y requiere el uso de una sala limpia, restringiendo la producción masiva y la popularización de nanoelectrodos. Por otra parte, láser tirando fabricación de nanoelectrodos depende en gran medida la experiencia de los operadores durante el cierre y tirando de un alambre de metal dentro del tubo capilar. Si el alambre de metal no está bien sellado en el capilar, el espacio entre la pared interna de la nanopipette y alambre dramáticamente puede presentar exceso ruido actual y ampliar electroactivos área de detección. Estos inconvenientes disminuyen en gran medida la sensibilidad de la nanoelectrode. Por otro lado, la existencia de una brecha puede agrandar el área del electrodo y reducir la sensibilidad de la nanoelectrode. En consecuencia, es difícil garantizar un desempeño reproducible debido a la morfología del electrodo incontrolable en cada proceso de fabricación^14,15. Por lo tanto, un método de fabricación general de nanoelectrodos con excelente reproducibilidad es urgente para facilitar la exploración electroquímica de las características intrínsecas de las nanopartículas individuales.

Recientemente, la técnica nanopore se ha desarrollado como un enfoque elegante y libre de etiqueta para la sola molécula análisis^{16,17,18,19,20}. Debido a su fabricación controlable, el nanopipette proporciona un aislamiento de la nanoescala, con diámetro uniforme de 30-200 nm de un láser capilar tirador^21,22,23,24 . Por otra parte, este procedimiento simple y reproducible de fabricación asegura la generalización de la nanopipette. Recientemente, hemos propuesto un electrodo nanopore inalámbrica (vino), que no requiere el lacre de un alambre de metal dentro de la nanopipette. A través de un proceso de fabricación fácil y reproducible, el vino posee una deposición metal de nanoescala en lo nanopipette para formar un electroactivos interfaz^25,26,27,28 . Puesto que el vino posee una estructura bien definida y morfología uniforme de sus confinamientos, logra alta resolución actual así como la constante de tiempo de baja resistencia-capacitancia (RC) para la realización de alta resolución temporal. Divulgamos previamente dos tipos de WNEs, tipo abierto y cerrado-tipo, para la realización de análisis de la entidad. El vino tipo abierto emplea una capa de nanometal depositada sobre la pared interna de un nanopipette, que convierte la corriente farádica de una sola entidad al corriente iónica de respuesta²⁶. Generalmente, el diámetro de un vino de tipo abierto es alrededor de 100 nm. Para disminuir aún más el diámetro del vino, nos presenta el vino cerradas, en la que un nanotip de metal sólido ocupa completamente la punta de nanopipette a través de un enfoque químico-electroquímica. Este método puede generar rápidamente un 30 nanotip nm oro dentro de un confinamiento nanopore. La interfaz bien definida en la zona de la punta de un vino de tipo cerrado asegura un alto cociente signal-to-noise para medidas electroquímicas de nanopartículas individuales. Como una nanopartícula de oro cargada choca con el cerrado-tipo vino, un proceso ultrarrápido de carga-descarga en el interfaz de punta induce una respuesta de la realimentación capacitiva (CFR) en el rastro corriente iónica. En comparación con un anterior sola nanopartícula colisión estudio a través de un nanoelectrode con el metal del alambre dentro de²⁹, el cerrado-tipo vino mostraron una mayor resolución actual del pA del 0,6 ± 0.1 pA (RMS) y una resolución temporal más alta de 0,01 ms.

Adjunto, describimos un procedimiento de fabricación detallado para un vino de tipo cerrado que ha controlado muy excelente reproducibilidad y dimensiones. En este protocolo, una simple reacción entre AuCl₄^– y BH₄^– está diseñado para generar un nanotip de oro que bloquea completamente el orificio de un nanopipette. Electroquímica bipolar es adoptado para el crecimiento continuo de un nanotip de oro que llega a la longitud de varios micrómetros en el nanopipette. Este procedimiento simple permite la implementación de esta fabricación de nanoelectrode, que puede realizarse en cualquier laboratorio de química general sin un equipo caro y limpio. Para determinar el tamaño, morfología y estructura interna de un vino de tipo cerrado, este protocolo proporciona un procedimiento de caracterización detallada con el uso de un microscopio electrónico de barrido (MEB) y espectroscopia de fluorescencia. Un ejemplo reciente se destaca, que mide directamente las interacciones intrínsecas y dinámicas de nanopartículas de oro (AuNPs) chocar hacia la nanointerface de un vino de tipo cerrado. Creemos que el cerrado-tipo vino puede allanar un nuevo camino para futuros estudios electroquímicos de las células vivas, nanomateriales y sensores de nivel de entidad individual.

Protocolo

1. preparación de soluciones

Nota: Preste atención a las precauciones Generales de seguridad para todos los productos químicos. Disponer de productos químicos en una campana de humos y utilizar guantes, gafas y una capa del laboratorio. Mantenga los líquidos inflamables lejos de fuego o chispas. Todas las soluciones acuosas se prepararon con agua ultrapura (18.2 MΩ cm a 25 ° C). Las soluciones preparadas se filtraron usando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm.

1. Preparación de solución de KCl
   1. Disolver 0,074 g de cloruro de potasio en 100 mL de agua desionizada.
2. Preparación de NaBH₄ solución
   1. Disolver 0,018 g de borohidruro de sodio en 10 mL de etanol.
3. Preparación de HAuCl₄ solución
   1. Disolver 0,010 g de cloruro de potasio en 1 mL de solución ácida al 1% chloroauric.
4. Preparación de la caucho de silicón
   1. Mezcle el caucho de silicón que contiene la parte A y parte B (véase Tabla de materiales) en una proporción de 1:1 por volumen.
   2. Utilizar el caucho de silicón mezclado para pintar una zona de reacción en la diapositiva inmediatamente durante el tiempo de pot de 1 minuto.
   3. Curar el caucho de silicón preparado sobre el portaobjetos durante 5 minutos.
5. Preparación de nanopartículas de oro³⁰
   1. Añadir 4,8 mL de ácido chloroauric con una fracción del 1% en 40 mL de agua desionizada con agitación vigorosa.
   2. Calentar la solución hasta hervir.
   3. Rápidamente añadir 10 mL de una solución de citrato trisódico con una fracción del 1% en la solución.
   4. Calentar la solución para un adicional 15 min hasta que la solución final es roja en color.
      Nota: En nuestro caso, la solución ácida chloroauric fue rápidamente reducida por citrato trisódico, y se observó que la solución rápidamente cambiado de amarillo claro a negro oscuro.

2. preparación de la instalación Experimental

1. Preparación actual del sistema de medición
   1. Encienda el sistema de medición actual que contiene el amplificador de corriente (véase Tabla de materiales) y sistema de adquisición de datos de bajo nivel de ruido (vea la Tabla de materiales)
   2. Cambiar el modo de pinza de voltaje.
   3. Establece el ancho de banda de filtro en la tasa de muestreo y 10 kHz a 100 kHz.
   4. Montar una jaula de cobre casera específica diseñada para escudar el ruido externo para las células experimentales y del preamplificador en el microscopio invertido (véase Tabla de materiales).
   5. Tierra la cáscara de la jaula de Faraday, cáscaras de amplificador y sistema de microscopio invertido.
2. Configuración del sistema de detección de campo oscuro
   1. Generación de la nanotip oro dentro de la nanopipette es supervisado por el microscopio de campo oscuro –.
      Nota: Un sistema de microscopio invertido (véase Tabla de materiales) se utiliza para tomar imágenes y espectros de dispersión. Una cámara CCD de color verdadero se emplea para tomar imágenes del electrodo nanopipette y nanopore. Un condensador de campo oscuro [apertura numérica (NA) = 0.8-0.95)] se utiliza para formar una iluminación de campo oscuro. 10 X (NA = 0.3), 20 X (NA = 0.45) y 40 X (NA = 0,6) objetivos se utilizan para recoger imágenes de la cerrado-tipo de vino. Detección de fluorescencia se utiliza para comprobar además si hay diferencias entre la nanotip y la pared interna de la nanopipette. Este experimento lo realiza otro EMCCD también (véase Tabla de materiales) integrado en el microscopio invertido, y la luz de excitación es una lámpara de mercurio incorporado con un filtro paso de banda de 450-490 nm.

3. fabricación de vino de tipo cerrado

1. Fabricación de nanopipettes
   1. Poner los tubos capilares de cuarzo (véase Tabla de materiales) en un tubo de centrífuga de 15 mL con acetona por 10 min de limpieza por ultrasonidos.
   2. Retirar la acetona, luego añadir el etanol en el mismo tubo de centrífuga.
   3. Poner el tubo de centrífuga en un limpiador ultrasónico durante 10 minutos de limpieza.
   4. Poner los tubos capilares en otro tubo de centrífuga de 15 mL con agua desionizada para la eliminación del etanol, con 10 min de limpieza por ultrasonidos.
   5. Continuamente ultrasonidos limpia los capilares tres veces con agua desionizada para eliminar el etanol residual.
   6. Seque los capilares con una corriente de gas nitrógeno.
   7. Mantenga los tubos capilares en un tubo de centrífuga nuevo y limpio.
   8. Encender el extractor de láser de CO₂ (véase Tabla de materiales)
   9. Precaliente el tirador durante 15-20 min asegurar una energía constante.
   10. Instale el capilar limpio en el extractor.
   11. Configurar los parámetros de tracción de calor, filamento, velocidad, demora y fuerza de tracción en el panel del tirador láser CO₂ para un diámetro específico. El parámetro detallado para tirar a 30 nm de diámetro nanopipette en este protocolo se muestra en la tabla 1 (figura 1).
   12. Fijar el nanopipette preparado en una placa Petri con el adhesivo reutilizable (véase Tabla de materiales) para la caracterización de más.
2. Fabricación de tipo de vino
   1. Se inyectan 10 μL de la solución preparada de₄ HAuCl en el nanopipette con un microloader.
   2. Centrifugue el nanopipette durante 5 minutos a alrededor 1878 x g para la eliminación de burbujas de aire en la nanopipette.
      Nota: Para este paso, colocamos la nanopipette con la punta mirando hacia abajo en un soporte casero dentro de un tubo de centrífuga de 2 mL.
   3. Fijar la nanopipette en un cubreobjetos con el caucho de silicón preparados (vea el paso 1.4) y definir el área dentro de la nanopipette como el lado "cis" y exterior como la parte de "trans".
   4. Esperar 5 minutos hasta que la goma esté seca.
   5. Poner el conjunto integrado en la mesa objetivo del microscopio invertido.
   6. Encender y ajustar la iluminación de campo oscuro para centrar la punta de la nanopipette bajo un objetivo de microscopio X 10.
   7. Cambio a 20 X y 40 objetivos de X para una mayor resolución espacial.
   8. Colocar un electrodo de Ag/AgCl dentro de la nanopipette.
   9. Coloque el otro electrodo de Ag/AgCl con conexión a tierra en el lado de trans .
   10. Conectar un par de electrodos de Ag/AgCl para el preamplificador.
   11. Encienda el sistema actual de medición y el software correspondiente (véase Tabla de materiales) para la grabación de corriente iónica.
   12. Establece el potencial aplicado en 300 mV.
   13. Lentamente agregar 150 μL de solución de NaBH₄ hacia el lado trans para desencadenar la reacción entre HAuCl₄ y NaBH₄ (figura 2).
       Nota: La reducción de NaBH₄ en solución acuosa ocurre a una velocidad de reacción violenta. Por lo tanto, la generación de H₂ de la reducción de NaBH₄ puede inducir una estructura defectuosa de la nanotip por la generación de cavidades durante el crecimiento de nanotip oro.
   14. Ópticamente, eléctricamente y simultáneamente registrar el rastro actual y el campo oscuro imagen/dispersión espectros utilizando las corriente medida y campo oscuro sistemas de detección (figura 3).
       Nota: La solución de etanol es volátil bajo iluminación de campo oscuro. Prestar atención al volumen de etanol durante el proceso de fabricación.
   15. Apaga el potencial aplicado iónicos actuales remontan a 0 PA.
   16. Lavar el preparado vino cerradas con flujo desionizada agua desde la base hasta la punta.
3. Caracterización de la tipo de vino
   1. Caracterizar el tipo vino con un microscopio electrónico de barrido (SEM), que es un método general para la caracterización de nanopipettes^{22,31,32,33,34} .
   2. Utilizar un experimento fluorescente de ion calcio para comprobar las condiciones de sellado de la nanotip oro dentro de la nanopipette.
      1. Inyecte 10 μL de solución de CaCl₂ en el lado cis de la solución de vino y Fluo-8 de tipo cerrado en el lado de trans .
      2. Conectar los electrodos de Ag/AgCl con el headstage.
   3. Aplicar un sesgo mV 400 potenciales y usar el EMCCD (véase Tabla de materiales) para monitorear la respuesta de la fluorescencia en la zona de punta. Utilizar enfoque iones (FIB) para esculpir el vino cerradas desde la punta hasta el fondo, luego determinar la longitud de la capa de metal interior o nanotip con la caracterización de la SEM.
4. Colisión de nanopartículas individuales con cerrado tipo vino
   1. Cambiar la solución en el trans y cis a una solución de KCl después de la fabricación de la cerrado-tipo de vino.
   2. Transferir 50 μL de solución de nanopartículas de oro de 30 nanómetro en el lado trans . Grabar la señal actual de eventos de colisión de nanopartículas individuales en un potencial de 300 mV (figura 5).
   3. Cambiar el voltaje aplicado para controlar la frecuencia, la amplitud y el cambio de forma de la señal actual.

Resultados

Demostramos un enfoque fácil para fabricar un bien definido electrodo 30 de nanopore inalámbrica en nm basada en un nanopipette cónico de cuarzo. La fabricación de un nanopipette se demuestra en la figura 1, que incluye tres pasos principales. Un microcapillary con un diámetro interno de 0,5 mm y 1,0 mm de diámetro exterior se fija en el extractor, y luego un láser se enfoca en el centro del tubo capilar para fundir el cuarzo. Mediante la aplicación d...

Discusión

Fabricación de una nanopipette bien definida es el primer paso en el proceso de fabricación de vino de tipo cerrado. Enfocando un láser de CO₂ en el centro del tubo capilar, tubo uno capilar separa en dos nanopipettes simétricos con puntas cónicas de nanoescala. El diámetro se controla fácilmente, que van desde 30-200 nm, ajustando los parámetros del tirador láser. Se observa que los parámetros de tracción pueden variar para tiradores de pipeta diferente. La temperatura ambiental y la humedad tambi?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	Highly flammable and volatile
Analytical balance	Mettler Toledo	ME104E
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Blu-Tack reusable adhesive	Bostik
Centrifuge tube	Corning Inc.		Centrifuge Tubes with CentriStar Cap, 15 ml
Chloroauric acid	Energy Chemical	E0601760010	HAuCl4
Clampfit 10.4 software	Molecular Devices
Digidata 1550A digitizer	Molecular Devices
DS Fi1c true-color CCD camera	Nikon
Ecoflex 5 Addtion cure silicone rubber	Smooth-On	17050377
Eppendorf Reference 2 pipettes	Eppendorf	492000904	10, 100 and 1000 µL
Ethanol	Sigma-Aldrich	24102	Highly flammable and volatile
Faraday cage			Copper
iXon 888 EMCCD	Andor
Microcentrifuge tubes	Axygen Scientific		0.6, 1.5 and 2.0 mL
Microloader	Eppendorf	5242 956.003	20 µL
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	LOT 16938	20 mm*60 mm-1 mm thick
Milli-Q water purifier	Millipore	SIMS00000	Denton Electron Beam Evaporator
P-2000 laser puller	Sutter Instrument
Pipette tips	Axygen Scientific		10, 200 and 1,000 µL
Potassium chloride,+D25+A2:F2+A2:F25	Sigma Aldrich	P9333-500G	KCl
Quartz pipettes	Sutter	QF100-50-7.5	O.D.:1.0 mm, I.D.:0.5 mm, 75 mm length
Refrigerator	Siemens
Silicone thinner	Smooth-On	1506330
Silver wire	Alfa Aesar	11466
Sodium borohydride,	Tianlian Chem. Tech.	71320	NaBH4
Ti-U inverted dark-field microscope	Nikon