Un elettrodo di tipo chiuso senza fili Nanopore per analizzare le singole nanoparticelle

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per la fabbricazione di un elettrodo di tipo chiuso senza fili nanopore e successiva misura elettrochimica delle nanoparticelle singole collisioni.

Abstract

Misura le caratteristiche intrinseche delle singole nanoparticelle da nanoelectrochemistry detiene profondo fondamentale importanza ed ha potenziali impatti in nanoscienza. Tuttavia, analizzando elettrochimicamente singole nanoparticelle è impegnativo, come il telerilevamento nanointerface è incontrollabile. Per affrontare questa sfida, descriviamo qui la fabbricazione e caratterizzazione di un elettrodo di tipo chiuso senza fili nanopore (WNE) che presenta una morfologia altamente controllabile e riproducibilità eccezionali. La facile realizzazione di WNE consente la preparazione di nanoelettrodi ben definito in un laboratorio di chimica generale senza l'uso di una camera pulita e costose attrezzature. Una sola applicazione di un 30 nm WNE chiuso-tipo nell'analisi di singole nanoparticelle d'oro nella miscela viene anche evidenziato, che mostra una risoluzione elevata corrente di 0,6 pA e temporale ad alta risoluzione di 0.01 ms accompagnato da loro morfologia eccellente e piccolo diametri, altre applicazioni potenziali di tipo chiuso WNEs possono essere espansa dalla caratterizzazione di nanoparticelle per rilevazione di singola molecola/ioni e unicellulare di sondaggio.

Introduzione

Le nanoparticelle hanno attirato l'attenzione enorme a causa di diverse caratteristiche come loro capacità catalitica, caratteristiche ottiche particolari, electroactivity ed elevati rapporti superficie-volume^{1,2,3, 4}. analisi elettrochimica delle nanoparticelle singole è un metodo diretto per la comprensione dei processi chimici ed elettrochimici intrinseci a livello di nanoscala. Per ottenere misurazioni altamente sensibile delle singole nanoparticelle, due approcci elettrochimici sono state precedentemente applicati per leggere informazioni di nanoparticelle da corrente risposte^5,6,7. Uno di questi approcci coinvolge immobilizzare o catturare una nanoparticella individuo sull'interfaccia del nanoelectrode per lo studio di elettrocatalisi^8,9. L'altra strategia è guidata dalla singola nanoparticella collisione con la superficie di un elettrodo, che genera una fluttuazione di corrente transitoria dal processo redox dinamico.

Entrambi questi metodi richiedono un'interfaccia sensibile ultrasensibile di nanoscala che corrisponda al diametro delle singole nanoparticelle. Tuttavia, la fabbricazione tradizionale di nanoelettrodi principalmente ha incorporato i sistemi micro-elettromeccanici (MEMS) o laser tirando tecniche, che sono noioso e undisciplinable^{10,11,12, 13}. Ad esempio, basati su MEMS fabbricazione di nanoelettrodi è costoso e richiede l'uso di una camera pulita, limitazione della massiccia produzione e divulgazione di nanoelettrodi. D'altra parte, laser tirando fabbricazione di nanoelettrodi si basa pesantemente su esperienza degli operatori durante la sigillatura e tirare un filo metallico all'interno del capillare. Se il filo metallico non è ben sigillato nel capillare, il divario tra il filo e la parete interna della nanopipette drammaticamente può introdurre rumore corrente di fondo in eccesso e ingrandire l'elettroattivi rilevamento della zona. Questi inconvenienti in gran parte diminuiscono la sensibilità della nanoelectrode. D'altra parte, l'esistenza di una lacuna può allargare l'area dell'elettrodo e ridurre la sensibilità della nanoelectrode. Di conseguenza, è difficile garantire una performance riproducibile dovuto le morfologie di elettrodo incontrollabile in ogni processo di fabbricazione^14,15. Pertanto, un metodo di fabbricazione generale di nanoelettrodi con eccellente riproducibilità è assolutamente necessario per facilitare l'esplorazione elettrochimico delle caratteristiche intrinseche delle singole nanoparticelle.

Recentemente, la tecnica di nanopore è stata sviluppata come un approccio elegante e privo di etichetta per singola molecola analisi^{16,17,18,19,20}. A causa della sua fabbricazione controllabile, il nanopipette fornisce un confinamento su scala nanometrica, con un diametro uniforme che vanno da 30-200 nm da un laser capillare estrattore^21,22,23,24 . Inoltre, questa procedura di fabbricazione semplice e riproducibile assicura la generalizzazione della nanopipette. Recentemente, abbiamo proposto un elettrodo nanopore wireless (WNE), che non richiede la tenuta di un filo metallico all'interno del nanopipette. Attraverso un processo di fabbricazione facile e riproducibili, il WNE possiede una deposizione metallica su scala nanometrica entro il nanopipette per formare un elettroattivi interfaccia^25,26,27,28 . Poiché il WNE possiede una struttura ben definita e morfologia uniforme dei suoi confini, realizza l'alta risoluzione corrente, così come la costante di tempo di resistenza-capacità bassa (RC) per l'esecuzione di elevata risoluzione temporale. Precedentemente abbiamo segnalato due tipi di WNEs, tipo aperto e chiuso-tipo, per la realizzazione di analisi di singola entità. Il tipo aperto WNE impiega un strato di nanometal depositato sulla parete interna di un nanopipette, che converte la corrente faradica di una singola entità per la risposta corrente ionica²⁶. Di solito, il diametro di un tipo aperto WNE è di circa 100 nm. Per ridurre ulteriormente il diametro di WNE, abbiamo presentato il WNE chiuso-tipo, in cui un nanotip di metallo solido completamente occupa la punta di nanopipette attraverso un approccio chimico-elettrochimica. Questo metodo è in grado di generare rapidamente un nanotip 30 nm oro all'interno di un confinamento nanopore. L'interfaccia ben definita nella zona di punta di un chiuso-tipo WNE assicura un elevato rapporto segnale-rumore per misure elettrochimiche di singole nanoparticelle. Come una nanoparticella d'oro caricata si scontra con il WNE chiuso-tipo, un processo di carica-Scarica ultraveloce all'interfaccia punta induce una risposta di feedback capacitivo (CFR) nella traccia corrente ionica. Rispetto ad un precedente singolo nanoparticella collisione Studio tramite una nanoelectrode con metallo filo all'interno²⁹, il WNE chiuso-tipo ha mostrato una più alta risoluzione corrente di pA di ± 0,1 0,6 pA (RMS) e maggiore risoluzione temporale di 0,01 ms.

Qui, descriviamo una procedura di fabbricazione dettagliato per un WNE chiuso-tipo che è altamente controllato dimensioni e riproducibilità eccezionali. In questo protocollo, una semplice reazione tra AuCl₄^– e BH₄^– è progettato per generare un nanotip d'oro che blocca completamente l'orifizio di un nanopipette. Poi, elettrochimica bipolare è adottato per una crescita continua di un nanotip d'oro che raggiunge la lunghezza di parecchi micrometri all'interno del nanopipette. Questa semplice procedura consente l'implementazione di questa fabbricazione di nanoelectrode, che possa essere effettuati in qualsiasi laboratorio di chimica generale senza una camera pulita e costose attrezzature. Per determinare la dimensione, la morfologia e la struttura interna di un WNE di tipo chiuso, questo protocollo fornisce una procedura dettagliata caratterizzazione con uso di un microscopio elettronico a scansione (SEM) e la spettroscopia di fluorescenza. Un esempio recente è evidenziato, che misura direttamente le interazioni intrinseche e dinamiche di nanoparticelle d'oro (AuNPs) collisione verso il nanointerface di un WNE di tipo chiuso. Noi crediamo che il WNE chiuso-tipo può aprire un nuovo percorso per futuri studi elettrochimici delle cellule viventi, nanomateriali e sensori a livello di singolo-entità.

Protocollo

1. preparazione delle soluzioni

Nota: Prestare attenzione alle precauzioni generali di sicurezza per tutte le sostanze chimiche. Smaltire i prodotti chimici in una cappa aspirante e indossare guanti, occhiali e un camice da laboratorio. Tenere liquidi infiammabili lontano dal fuoco o scintille. Tutte le soluzioni acquose sono state preparate utilizzando acqua ultrapura (18,2 cm MΩ a 25 ° C). Le soluzioni preparate sono state filtrate utilizzando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22 μm.

1. Preparazione della soluzione di KCl
   1. Sciogliere 0,074 g di cloruro di potassio in 100 mL di acqua deionizzata.
2. Preparazione della soluzione₄ NaBH
   1. Sciogliere 0,018 g di sodio boroidruro in 10 mL di etanolo.
3. Preparazione della soluzione₄ HAuCl
   1. Sciogliere 0,010 g di cloruro di potassio in 1 mL di soluzione di acido cloroaurico 1%.
4. Preparazione di gomma di silicone
   1. Mescolare la gomma di silicone contenente la parte A e parte B (Vedi Tabella materiali) con un rapporto di 1:1 in volume.
   2. Utilizzare la gomma di silicone mista per disegnare un'area di reazione la diapositiva immediatamente durante il tempo di pot di 1 min.
   3. Curare la gomma di silicone preparati su vetrino per 5 min.
5. Preparazione di nanoparticelle d'oro³⁰
   1. Aggiungere 4,8 mL di acido cloroaurico con una frazione in massa di 1% in 40 mL di acqua deionizzata con agitazione vigorosa.
   2. Riscaldare la soluzione ad ebollizione.
   3. Aggiungere rapidamente 10 mL di una soluzione di citrato trisodico con una frazione in massa di 1% nella soluzione.
   4. Riscaldare la soluzione per altri 15 minuti fino a quando la soluzione finale è di colore rossa.
      Nota: Nel nostro caso, la soluzione di acido cloroaurico rapidamente è stato ridotto di citrato trisodico, ed è stato osservato che la soluzione ha cambiato rapidamente da giallo-chiaro a scuro-nero.

2. preparazione del Setup sperimentale

1. Preparazione del sistema di misura di corrente
   1. Accendere il sistema di misurazione corrente contenente l'amplificatore di corrente (Vedi Tabella materiali) e sistema di acquisizione dati a basso rumore (Vedi Tabella materiali)
   2. Accendete la modalità tensione-morsetto.
   3. Impostare la larghezza di banda del filtro a tasso di campionamento e 10 kHz a 100 kHz.
   4. Assemblare una gabbia rame fatti in casa specifica auto-progettata per proteggere il rumore esterno per celle sperimentali e il pre-amplificatore sul microscopio invertito (Vedi Tabella materiali).
   5. Terra la shell della gabbia di Faraday, gusci dell'amplificatore e il sistema di microscopio invertito.
2. Installazione del sistema di rilevamento di campo scuro
   1. Generazione dell'oro nanotip dentro la nanopipette è controllata dal microscopio a campo oscuro –.
      Nota: Un sistema di microscopio invertito (Vedi Tabella materiali) è utilizzato per prendere immagini e spettri di dispersione. Una telecamera CCD digitale colore vero è impiegata per prendere immagini dell'elettrodo nanopipette e nanopore. Un condensatore a campo oscuro [apertura numerica (NA) = 0,8 – 0,95)] viene utilizzato per formare un'illuminazione in campo scuro. 10 X (NA = 0,3), 20x (NA = 0,45) e 40 X (NA = 0,6) obiettivi vengono utilizzati per raccogliere immagini di WNE il tipo chiuso. Rilevazione della fluorescenza è utilizzato per verificare ulteriormente se ci sono spazi vuoti tra la nanotip e la parete interna della nanopipette. Questo esperimento viene eseguito da un altro EMCCD (Vedi Tabella materiali) integrato anche il microscopio invertito, e la luce di eccitazione è una lampada a mercurio incorporato con un filtro passa-banda di 450-490 nm.

3. fabbricazione di tipo chiuso WNE

1. Fabbricazione di nanopipettes
   1. Mettere i capillari di quarzo (Vedi Tabella materiali) in una provetta da centrifuga da 15 mL riempita con acetone per 10 min di pulizia ad ultrasuoni.
   2. Versi fuori acetone, quindi aggiungere etanolo nella stessa provetta da centrifuga.
   3. Mettere la provetta da centrifuga in un pulitore ad ultrasuoni per 10 min di pulizia.
   4. Mettere i capillari in un'altra provetta da centrifuga da 15 mL con acqua deionizzata per la rimozione dell'etanolo, con 10 minuti di lavaggio ad ultrasuoni.
   5. Continuamente ad ultrasuoni che pulire i capillari tre volte con acqua deionizzata per rimuovere il residuo dell'etanolo.
   6. Asciugare i capillari utilizzando un flusso di gas di azoto.
   7. Conservare i capillari in una provetta da centrifuga nuovo, pulito.
   8. Accendere l'estrattore di laser CO₂ (Vedi Tabella materiali)
   9. Preriscaldare l'estrattore per 15-20 min garantire una potenza laser costante.
   10. Installare il capillare pulito nell'estrattore.
   11. Impostare i parametri che tirando di calore, filamento, velocità, ritardo e la forza di trazione sul pannello dell'estrattore della CO₂ laser, per un diametro specifico. Il parametro detailed per tirare un nanopipette di diametro 30 nm in questo protocollo è illustrato nella tabella 1 (Figura 1).
   12. Difficoltà il nanopipette preparato su una piastra di Petri con l'adesivo riutilizzabile (Vedi Tabella materiali) per ulteriore caratterizzazione.
2. Fabbricazione di chiuso-tipo WNE
   1. Iniettare 10 μL di soluzione di₄ HAuCl preparata la nanopipette con un microloader.
   2. Centrifugare la nanopipette per 5 min a circa 1878 x g per la rimozione di bolle d'aria nella nanopipette.
      Nota: Per questo passaggio, abbiamo messo il nanopipette con la punta rivolta verso il basso in un supporto in casa all'interno di una provetta da centrifuga da 2 mL.
   3. Difficoltà il nanopipette su un vetrino coprioggetto con la gomma di silicone preparati (Vedi punto 1.4) e definire l'area all'interno del nanopipette come il lato "cis" e fuori come il lato "trans".
   4. La gomma è guarita, attendere 5 min.
   5. Mettere l'ensemble integrato sul tavolo obiettivo del microscopio invertito.
   6. Accendere e regolare l'illuminazione del campo scuro per mettere a fuoco la punta di nanopipette sotto un obiettivo microscopio 10X.
   7. Cambiamento a 20 X e 40 X obiettivi per una maggiore risoluzione spaziale.
   8. Posizionare un elettrodo Ag/AgCl dentro il nanopipette.
   9. Inserire l'altro elettrodo Ag/AgCl con messa a terra sul lato di trans .
   10. Collegare una coppia di Ag/AgCl elettrodi per il pre-amplificatore.
   11. Accendere il sistema di misurazione di corrente e il software corrispondente (Vedi Tabella materiali) per la registrazione corrente ionica.
   12. Impostare il potenziale applicato su 300 mV.
   13. Lentamente aggiungere 150 μL di soluzione di NaBH₄ nel lato trans per innescare la reazione tra HAuCl₄ e NaBH₄ (Figura 2).
       Nota: La riduzione di NaBH₄ in soluzione acquosa avviene a una velocità di reazione violenta. Di conseguenza, la generazione di H₂ dalla riduzione di NaBH₄ può indurre una struttura difettosa della nanotip dalla generazione della cavità durante la crescita di nanotip oro.
   14. Contemporaneamente, elettricamente e otticamente registrare la traccia corrente e del scuro-campo immagine/dispersione spettri utilizzando l'attuale misura e campo scuro sistemi di rilevazione (Figura 3).
       Nota: La soluzione di etanolo è volatile nell'ambito dell'illuminazione in campo scuro. Prestare attenzione al volume di etanolo durante il processo di fabbricazione.
   15. Spegnere il potenziale applicato dopo aver ionico attuale tracciato torna a 0 PA.
   16. Lavare il preparato WNE chiuso-tipo con che scorre acqua deionizzata dal basso fino alla punta.
3. Caratterizzazione di chiuso-tipo WNE
   1. Caratterizzano WNE chiuso-tipo con un microscopio elettronico a scansione (SEM), che è un metodo generale per la caratterizzazione di nanopipettes^{22,31,32,33,34} .
   2. Utilizzare un esperimento fluorescente di ioni calcio per verificare la condizione di tenuta dell'oro nanotip dentro la nanopipette.
      1. Iniettare 10 μL di soluzione di CaCl₂ lato cis della soluzione chiuso-tipo WNE e Fluo-8 nel lato di trans .
      2. Collegare gli elettrodi di Ag/AgCl per l'headstage.
   3. Applicare un bias di mV 400 potenziali e utilizzare il EMCCD (Vedi Tabella materiali) per monitorare la risposta di fluorescenza nell'area di punta. Utilizzare focus fascio di ioni (FIB) per scolpire le WNE tipo chiuso dalla punta verso il basso, quindi determinare la lunghezza dell'interno strato di metallo o nanotip con caratterizzazione SEM.
4. Nanoparticella singola collisione con chiuso-tipo WNE
   1. Cambiare la soluzione nei lati trans e cis a una soluzione di KCl dopo fabbricazione di WNE il tipo chiuso.
   2. Trasferire 50 μL di soluzione di nanoparticelle d'oro 30 nm nel lato di trans . Registrare il segnale in corrente di singole nanoparticelle tra gli eventi di collisione a un potenziale di 300 mV (Figura 5).
   3. Modificare la tensione applicata per monitorare la frequenza, ampiezza e cambiamento di forma del segnale corrente.

Risultati

Dimostriamo un facile approccio per fabbricare un elettrodo di wireless nanopore nm 30 ben definito, basato su una nanopipette conica di quarzo. La realizzazione di un nanopipette è illustrata nella Figura 1, che comprende tre fasi principali. Un microcapillary con un diametro interno di 0.5 mm e diametro esterno di 1,0 mm è stato risolto nell'estrattore, poi un laser è focalizzato sul centro del capillare per fondere il quarzo. Applicando forze ai termina...

Discussione

Realizzazione di un nanopipette ben definito è il primo passo nel processo di fabbricazione di WNE chiuso-tipo. Mettendo a fuoco un laser di CO₂ al centro del capillare, uno vaso capillare separa in due nanopipettes simmetrico con punte coniche su scala nanometrica. Il diametro è controllato facilmente, che vanno da 30-200 nm, regolando i parametri dell'estrattore della laser. Va osservato che i parametri per la trazione possono variare per estrattori diversi pipetta. La temperatura ambientale e l'umidità p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	Highly flammable and volatile
Analytical balance	Mettler Toledo	ME104E
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Blu-Tack reusable adhesive	Bostik
Centrifuge tube	Corning Inc.		Centrifuge Tubes with CentriStar Cap, 15 ml
Chloroauric acid	Energy Chemical	E0601760010	HAuCl4
Clampfit 10.4 software	Molecular Devices
Digidata 1550A digitizer	Molecular Devices
DS Fi1c true-color CCD camera	Nikon
Ecoflex 5 Addtion cure silicone rubber	Smooth-On	17050377
Eppendorf Reference 2 pipettes	Eppendorf	492000904	10, 100 and 1000 µL
Ethanol	Sigma-Aldrich	24102	Highly flammable and volatile
Faraday cage			Copper
iXon 888 EMCCD	Andor
Microcentrifuge tubes	Axygen Scientific		0.6, 1.5 and 2.0 mL
Microloader	Eppendorf	5242 956.003	20 µL
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	LOT 16938	20 mm*60 mm-1 mm thick
Milli-Q water purifier	Millipore	SIMS00000	Denton Electron Beam Evaporator
P-2000 laser puller	Sutter Instrument
Pipette tips	Axygen Scientific		10, 200 and 1,000 µL
Potassium chloride,+D25+A2:F2+A2:F25	Sigma Aldrich	P9333-500G	KCl
Quartz pipettes	Sutter	QF100-50-7.5	O.D.:1.0 mm, I.D.:0.5 mm, 75 mm length
Refrigerator	Siemens
Silicone thinner	Smooth-On	1506330
Silver wire	Alfa Aesar	11466
Sodium borohydride,	Tianlian Chem. Tech.	71320	NaBH4
Ti-U inverted dark-field microscope	Nikon