JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ゴルジ体細胞表面からタンパク質の逆行輸送は膜の恒常性を維持するために不可欠です。ここでは、HeLa 細胞における機能性 nanobodies を用いた組換えタンパク質の細胞表面にゴルジ体輸送を生化学的解析法について述べる。

要約

タンパク質とゴルジ体内外細胞表面膜の輸送は、恒常性、細胞小器官アイデンティティおよび生理学に不可欠です。逆行性プロテイン トラフィックを研究、細胞表面から固定しライブの細胞イメージング、電子顕微鏡検査、または生化学的、ゴルジ複合体への輸送を分析するための多彩な生物学: ナノボディでベースのツールキットを最近開発しました。我々 設計機能抗緑の蛍光蛋白質 (GFP) nanobodies-小さな、単量体、高親和性タンパク質バインダー-細胞外の GFP 部分と利子の膜蛋白質を表現する細胞へ適用することができます。GFP レポーターにバインドし誘導体化 nanobodies 具体的に内在化されているし、記者の並べ替えルートに沿ってピギーバック輸送。Nanobodies 蛍光顕微鏡による逆行性輸送に従うとライブ イメージング、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ 2 電子記者生物学: ナノボディで複合体の電顕的局在を調べる (APEX2) fluorophores が付いている修飾されました。顕微鏡とトランスゴルジ ネットワーク (TGN) 到着の動態を評価するためにチロシン硫酸化 (TS) をモチーフにしました。この方法論の記事で細菌によって表現し、機能性 nanobodies を浄化する一般的な手順の概要を説明します。取り込みや TGN 到着貨物蛋白質を分析する mCherry と TS 変更 nanobodies を使用して私たちのツールの強力な使用をについて説明します。

概要

タンパク質や細胞表面からさまざまな細胞内コンパートメントに脂質の逆行のトラフィックは分泌を相殺して前向性輸送機械1のコンポーネントを再利用する膜の恒常性の維持のために重要,2内面化クラスリン依存または独立したエンドサイトーシスを介して、以下貨物蛋白質と脂質を設定初期エンドソームからさらには細胞膜にリサイクル、遠藤ライソゾーム システムに沿っていずれかをリダイレクト。または、トランスゴルジ ネットワーク (TGN) にターゲットを絞った。前向性膜貫通貨物受容体、カチオン依存性および陽イオンに依存しないマンノース-6-リン酸受容体 (CDMPR ・ CIMPR) などの多数の機能サイクルの一部である、TGN にエンドソームや細胞表面からリサイクルを提供します。後期エンドソーム、リソソーム3,4、5ソーティリンと SorLA6、7トランスゴルジ (WLS) 細胞表面に Wnt リガンドを輸送、TGN からライソゾーム加水分解酵素を合成しました。8,9,10,11.、TGN に戻るを取得する他の蛋白質は TGN46 とその関連アイソ フォーム12,13,14スネア (可溶性Nエチルマレイミド感受性融合因子添付ファイル受容体)15,16,17、アミロイド前駆体タンパク質 (APP)18,19、進歩的な強直 (アンク) 蛋白質20、金属トランスポーター ATP7A/B または DMT121,22, などと膜貫通酵素カルボキシペプチダーゼ D、風鈴 BACE123,24,25などを処理します。これらの内因性のタンパク質から離れて細菌植物毒素 (例えば、滋賀とコレラ毒素、リシン、アブリン) ハイジャックに細胞質26,27、retrotranslocation の小胞体に到達する逆行輸送機械 28,29。

逆行性のトラフィックを直接分析するために以前にラベルを貨物蛋白質を細胞表層から細胞内コンパートメント30に従ってください生物学: ナノボディでベースのツールキットを開発しました。Nanobodies は、タンパク質バインダー量重鎖だけ抗体 (hcAbs) ラクダ科動物、軟骨魚類の31,32で発生する自然由来の新しいファミリを表します。HcAbs の変数の重鎖のドメイン (VHH) を構成し、従来の抗体 (Igg など) に比べて多くの利点がある: 彼らは単量体、小さな (~ 15 kDa)、非常に溶ける、二硫化物結束を欠いている細菌によって表される、選択することができます高親和性結合33,34,35,36。私たちの生物学: ナノボディでツールをするためには、汎用性と広く適用/内腔細胞外ドメインに GFP が付いた表面ラベルとトラックのタンパク質機能抗 GFP nanobodies を採用しました。(APEX2) アスコルビン酸ペルオキシダーゼ 2 mCherry と nanobodies の機能化によって真正な貨物の膜貫通タンパク質の37、またはチロシン硫酸化 (TS) シーケンスの逆行輸送どちらか固定で分析することができますなど、ライブセル イメージングで電子顕微鏡検査、または生化学的。チロシン硫酸化チロシン硫酸化硫酸転移酵素 (TPST1 および TPST2) で媒介はトランス Golgi に制限修飾 TGN、直接勉強できるトランスポートおよびこれに細胞表層の興味の蛋白質の動態/細胞ゴルジ区画38,39,40。

この方法の記事で哺乳類セル30における逆行性輸送を分析するアプリケーションの数に適した機能性 nanobodies (VHH 2xTS、- APEX2、- mCherry 誘導体) の生産の容易さについて述べる。我々 は主に硫酸化のコンパートメントに細胞表層から細胞内トラフィックの分析のための TS サイト変更生物学: ナノボディでの使用に焦点を当てます。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

1. 細菌変換機能 Nanobodies

注:このプロトコルは、前述の30式、浄化、機能性抗 GFP nanobodies の解析に最適化されています。他の蛋白質の鎖誘導体化は、この標準的なプロトコルの変更を必要があります。

  1. 蛋白質の表現に適しています chemocompetent 細菌 (~ 100 μ L) を解凍 (例えば、エシェリヒア属大腸菌ロゼッタ BL21 (DE3) 細胞) 氷の上にそれらを配置することによって。
    注:Chemocompetent 標準的な実習の手順に従って細菌セルを準備します。また、化学的に有能な細菌セルも市販することができます。
  2. 50 追加エンコード機能 nanobodies プラスミドの ng。生物学: ナノボディで記者のサイト固有ビオチン化十分な細菌の表現の中に、また追加三重過剰 (150 ng) ビオチン リガーゼ ・ ビラをエンコーディング細菌発現プラスミドの (また見なさいテーブル 1プラスミドについて)。優しく上下ピペット。
    注:生物学: ナノボディでビオチン化は必要ではありませんまたは生物学: ナノボディで記者がビオチン受容体ペプチド (BAP) を欠いているが、エンコード ・ ビラ プラスミドと共同の変換は必要ありません。
  3. 氷の上で 30 分間細菌細胞を孵化させなさい。
  4. 熱水浴または加熱ブロックの 42 ° C で 1 分のそれらを配置することによって細菌の細胞に衝撃を与えます。
  5. 室温 (RT) の 1 つの mL を追加ルリア スープ (LB) 媒体と抵抗性遺伝子の形質発現を許可する 37 ° C で 1 時間の thermoshaker で変換された細菌を孵化させなさい。1 L LB を準備するには、中、バランス 5 g 酵母の抽出、10 g トリプトンと, 塩化ナトリウム 10 g を水で埋めるし、オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい。場合機能生物学: ナノボディでいるされて subcloned アンピシリン/carbenicillin への抵抗を含む表現のベクトルで、1.5 のステップを省略できます。
  6. 1 分 11,000 x gで細菌を餌し、新鮮な LB 培地の 100 μ L で再懸濁します。
  7. (例えばで 50 μ g/mL カナマイシンおよび 50 μ G/ml carbenicillin (ステップ 1.2) 上記のように細菌は co 生物学: ナノボディで記者と・ ビラ変形させたきたとき) それぞれの抗生物質を含んでいる LB の版に浮遊菌をプレートします。
  8. 37 ° C でインキュベーターでポンドのプレートを配置し、成長させる一夜 (O/N)。
    注:プロトコルは 4 ° C で成長したコロニーで LB プレートを格納することによってここで一時停止できます。ポンドのプレートをシールにパラフィルムを使用します。

2. 細菌の液体培養と機能生物学: ナノボディで式の誘導

  1. プレートからの興味のベクトルを含む細菌のコロニーをピックアップし、抗生物質 O/N 37 ° C で動揺のインキュベーターで LB 培の 20 mL の入ったフラスコを育てましょう (ステップ 1.7 選択の抗生物質についても参照)。
  2. 次の日は選択の抗生物質で LB 培地 1 L フラスコに成長 20 mL の細菌培養を希釈します。
  3. 37 ° C で培養をインキュベート 0.6 〜 0.7 の OD600に達するまで続けます。タンパク質の発現を誘導する前に RT にクールダウンする文化を許可します。
  4. 1 M イソプロピル-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) (1:1, 000 の希釈) インデューサの 1 mM の最終的な集中の 1 mL の添加により機能性 nanobodies ・ ビラのタンパク質発現を誘導します。また官能 nanobodies (また見なさいテーブル 1プラスミドについて) に BAP エピトープのビオチン化できるように培地に 200 μ M d ビオチンの結果 20 mM d-ビオチン ストック溶液 10 mL を追加します。
    注:D-ビオチン原液は ddH2O し 500 mM NaH2PO4の添加によってソリューションに持ち込まれました。また、d-ビオチンは、DMSO で溶解することができます。Nanobodies APEX2 に融合を生成する (VHH APEX2)、ヘムの結合を促進するため 1 mM 5-アミノレブリン酸 (ダラ) 塩酸 LB 培地を加えて補完必要があります。ダラを作製し、100 mM の原液 ddH2o.
  5. 1 L の IPTG 誘導培養 VHH 2xTS 4 h の 30 ° c、20 ° C または RT O/N VHH APEX2、および 16 をインキュベート ° C O/N VHH mCherry (また見なさいテーブル 1プラスミドについて)。
    注:新しい生物学: ナノボディでコンス トラクターの式の条件は、実験者によって最適化されなければなりません。
  6. 1 L 遠心ボトルにフラスコから細菌培養を転送し 4 ° C、45 分上清をデカントで 5,000 × gで細胞のペレット、浄化が続きます。
    注: プロトコルは、-80 ° C で細菌のペレットを無期限に格納することによってここで休止できます。VHH APEX2 または VHH mCherry 用ペレットは、それぞれ (のために組み込まれたヘム) 茶色やピンク、通常。

3. 機能性 Nanobodies の精製

  1. 必要に応じて、解凍冷凍氷細菌ペレット (2.6 の手順を参照してください)。
  2. 細菌の細胞ペレットに 30 mL の冷たい結合バッファー (1 × PBS で 20 mM のイミダゾール) を追加し、上下にピペッティングによって再懸濁します。ラベル付きの 50 mL チューブに再懸濁の細菌を転送します。
  3. 30 mL の結合バッファー 200 μ G/ml リゾチーム、20 μ G/ml DNase を私、1 mM MgCl2 1 mM 特異フッ化物 (PMSF) 最初の常温では、10 分放置、エンド オーバー エンド シェーカー 4 ° C で 1 時間インキュベートを補足。
  4. 機械的に懸濁液に先端の超音波発生装置を置くことで 50 mL のチューブの細菌細胞を溶解させます。1 分冷却期間の間一定の 3 x 1 分パルスを適用します。
  5. 細菌の破片とそのままなセルのペレットへ 45 分の 4 ° C で 15,000 × gで lysate を遠心します。どちらの遠心分離に適切な遠心ボトルに熱量の細菌細胞ライセートを転送または卓上遠心分離のためのいくつかの 5 mL チューブにライセートを分割します。
  6. 新しい 50 mL のチューブに上清を移すし、小球形にされた破片を破棄します。
  7. クリアを格納固定化金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (IMAC) で浄化を準備しながら氷の溶解液。ヒスチジン-タグ付け機能性 nanobodies を分離する採用単回使用 (材料表参照) 彼の列高速かつ単純な重力流浄化を許可します。
    注:また、商業列の代わりにバッチ浄化を使用してすることができますも。
  8. 金属製のスタンドで彼のコラムに装着します。
    1. 列のストレージ ソリューションは、先細りし、彼を平衡 10 ml の結合バッファー (1 × PBS で 20 mM のイミダゾール) の列。
    2. 重力流 (流れを破棄することができます) によって空。
  9. 徐々 にロード、クリアされた細菌ライセート (~ 30 mL) 列に。重力流 (流れを破棄することができます) によって空。
  10. 彼を洗う 2 列 x 10 mL の結合バッファー (1 × PBS で 20 mM のイミダゾール)。
  11. 2 mL の溶出バッファー (1x PBS で 500 mM のイミダゾール) と nanobodies を 2 mL チューブに溶出し、バッファー交換を適用します。
  12. バッファー交換。
    1. 平衡、脱塩 5 mL の 1x PBS で 5 回 50 mL チューブ列アダプターに配置されて列 (材料の表を参照してください)。
    2. 充填層を入力するバッファーを許可します。流れを破棄します。
    3. 5 番目の PBS 平衡後 1,000 x g 2 分の位置にある列をスピンします。
    4. 流れを破棄します。
    5. 新しい 50 mL チューブにアダプターを持つ列を配置します。溶出機能生物学: ナノボディで (ステップ 3.11) から PBS 平衡脱塩カラムと 2 分間 1,000 x gでスピンに 2 mL を負荷し、溶出液を収集します。
      注:商業の脱塩列の代わりに、バッファー組成を交換する透析を適用できます。
  13. ビシンコニン (BCA) または製造元の指示に従ってブラッドフォードの試金を使用して溶出液のタンパク質 (生物学: ナノボディで) 濃度を決定します。
    注:GFP レポーター細胞株による生物学: ナノボディで取り込みアッセイ、2 ~ 10 mg/mL のストック濃度が最適です。

4. 機能性生物学: ナノボディで式 (クマシー染色) の検証

  1. ナトリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミド電気泳動 (SDS-PAGE) 標準のプロトコルに従って 10 12.5% ゲルを準備します。
    注:また、市販のプレキャスト勾配ゲルを使用します。
  2. 1.5 mL チューブにサンプル バッファー 95 ° C、5 分で沸騰機能生物学: 精製ナノボディでのピペット 20 μ g。
    注:例として 2 x サンプルバッファーの 10 μ L で 1.5 mL チューブに 2 mg/mL 生物学: ナノボディで原液の 10 μ L を追加します。ボリュームが小さすぎる場合、さらにサンプルバッファーを追加する前に PBS で生物学: ナノボディでを希釈する必要があります。
  3. SDS ポリアクリルアミドのゲルにサンプル バッファーで煮て精製生物学: ナノボディでをロードし、参照色素 (例えば、ブロモフェノール ブルー) がクマシー染色後、分離ゲルの終わりに達するまでページの標準プロトコルに従って実行し、染め色。
  4. Coomassie ゲル染色と染め色。
    1. ゲルを uncast、Coomassie 染色液 (10 g/l ddH2O 10% 酢酸と 45% メタノールで Coomassie 原液 5%) 移動動揺のプラットホームの RT で 20-30 分のためにそれを汚します。ゲルは、染色液で完全にカバーされなければなりません。
    2. 脱色する 2-3 回とさらに染め色の O/N ゲルを離れる前に常温では、1 時間のためのソリューション (ddH2O で 7.5% 酢酸と 15% メタノール) をすすぐ。
      注: 過剰 Coomassie できますに効率的に浸しゲルの周りキッチン ペーパー タオルを置くことによって。
  5. 画像を撮像素子やカメラで選択のゲル。
    注:生物学: ナノボディで式は、(また見なさい図 1 a) 抗体のエピトープをターゲットを用いたイムノ プロット解析でさらに検証できます。

5. 培養細胞の蛍光染色による機能性 Nanobodies の取り込み

  1. 種子 ~ 400,000 に 500,000 HeLa 細胞の抗生物質 (ダルベッコ イーグルの変更中、DMEM を含む完全培地で 18 mm ガラス coverslips (号 1.5 H) 35 mm 料理または 6 ウェル クラスターでの記者の GFP 付けられた蛋白質を安定に発現する細胞文化フードで10% 牛胎児血清 (FCS)、100 単位/ml ストレプトマイシン、2 mM l-グルタミン、、ピューロマイシン 1.5 μ G/ml を添加した)。
    注:ここでは、説明のため EGFP カルネキシン、EGFP CDMPR、TfR EGFP を安定発現 HeLa 細胞を使用してください。安定したセルラインから離れても一時的に transfected HeLa 細胞を使用できます。安定したセルラインは直接比較のため、親非導入 HeLa 細胞でこの手順で共同栽培することができます。
  2. 増殖する 7.5% CO2インキュベーターで 37 ° C でセル O/N を孵化させなさい。
    注:セルは、次の日に 〜 80% の confluency に必要です。
  3. 2 ピペット 2 mL の完全培地を含む 15 または 50 mL のチューブに 2 mg/mL 生物学: ナノボディで原液の μ L (このボリュームは 35 mm ディッシュや 6 もクラスターの 1 つの井戸をカバー、媒体の生物学: ナノボディでより多くの細胞文化 d を含むように比例して音量を調整するための十分な幸せ経済社会研究またはクラスター)。
    注:例示では、我々 ここで使用 VHH-mCherry、さらに抗体の汚損の生物学: ナノボディで (図 2を参照) EGFP 記者によって内面化を参照してくださいする必要はありませんので。
  4. 細胞から成長培地を削除し、35 mm ディッシュまたは 6 ウェル単位あたり 2 μ g/mL 機能生物学: ナノボディでを含む prewarmed 完全培地 2 mL を追加します。
  5. 細胞生物学: ナノボディで記者を介した通風管を許可する 7.5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
    注:計画の実験によって生物学: ナノボディで取り込みの時は調整が必要です。ここに示す実験の 1 h は EGFP CDMPR、TfR EGFP の生物学: ナノボディで吸収の定常状態に到達するのに十分です。
  6. メディアを取り出して、1 mL の 1x PBS 室温で 2-3 回セルを洗浄して
  7. 1 ml 室温 10 分間 3% パラホルムアルデヒド (PFA) のセルを修復します。
  8. PFA ソリューションを削除し、1 ml 50 mM NH4室温 5 分 1x PBS で Cl の残り定着剤を癒す
    注: 3 %pfa 別途として定着性廃棄物処分すべき。
  9. 1 mL の 1x PBS 室温で 3 回セルを洗浄して
  10. 1 ml 0.1% のセルを permeabilize 室温 10 分の 1 × PBS でトリトン X-100
    注:透過は不要です、その後セルは、メディアをマウントに埋め込まれているとき EGFP と mCherry の蛍光は良いです。
  11. 1 mL の 1x PBS 室温で 3 回セルを洗浄して
  12. 室温 5 分の 5 μ g/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) を含む 1x PBS で 1 %bsa のドロップ (~ 100 μ L) の鉗子で、coverslips を配置します。
  13. 料理/ウェルに戻し、coverslips、1 mL の 1x PBS 室温で 3 回洗浄
  14. スライド ガラスをラベル付けしてマウント Fluoromount g. と細胞3-4 時間暗闇の中で強化して光保護下の 4 ° C でスライド ガラスを格納メディアをマウントをしましょう。
  15. 染色パターンの選択 (例えば、点走査型共焦点正立顕微鏡) の顕微鏡を使用してのイメージ。

6 (硫酸化分析用) 培養細胞による機能性 Nanobodies の取り込み

  1. 細胞文化フード種子 ~ 400,000 に 500,000 HeLa 細胞が GFP 付けられたレポーター蛋白質 35 mm 料理または完全な媒体含む抗生物質 (ダルベッコ イーグルの変更中、10% ウシ胎仔を DMEM で 6 もクラスターを安定に発現します。血清 (FCS)、100 単位/ml ストレプトマイシン、2 mM l-グルタミン、1.5 μ G/ml ピューロマイシン)。
    注:前述のように、我々 はここで説明のため EGFP カルネキシン、EGFP CDMPR、TfR EGFP を安定発現 HeLa 細胞を使用します。安定したセルラインから離れても一時的に transfected hela 細胞を使用できます。
  2. 増殖する 7.5% CO2インキュベーターで 37 ° C でセル O/N を孵化させなさい。
    注:翌日 ~ 80% の confluency セルが必要です。
  3. 完全培地を削除、RT で 1x PBS で 2 回を洗浄し、7.5% の CO2インキュベーターで 37 ° C で 1 時間 (SFM) 硫酸フリー培地で細胞を飢えさせます。
    注:SFM は、ワシのバランスの取れた塩 500 mL に MEM アミノ酸 (50 x) 液、L-グルタミン (200 mM)、5 mL のビタミン溶液 (100 倍)、および CaCl2·2H2O の 900 μ L の 5 mL の 10 mL を追加することによって準備されます。0.22 μ m のフィルターそして因数を通過します。
  4. 換気フード、放射能作業用に指定されたベンチで SFM でナトリウム塩として 0.5 mCi/mL [35S] 硫酸を含有する培地をラベリング硫酸を準備します。
    注意:放射能が含まれているすべてのソリューションを慎重に処理します。指定されたフードやベンチでのみ動作します。すべての素材 (ヒント、チューブ、プレート等) または放射能との接触の洗浄バッファーを収集し、別に処分があります。同様のすべてのステップ (ステップ 6.5 6.20) の下にこれを行います。
  5. 1x PBS で VHH 2xTS を硫酸 2 μ G/ml の最終的な集中する媒体のラベルに追加します。
    注:コントロールとして VHH std または TS サイトに欠けているもう一つ生物学: ナノボディで特殊にラベリングを示すことがあります。
  6. 硫酸中含む mCi/0.5 mL [35S] 硫酸と 2 μ G/ml VHH 2xTS ラベル付け 0.7 mL で SFM を交換し、認定作業放射能 7.5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 1 時間細胞をインキュベートします。
    注:計画の実験によって生物学: ナノボディで硫酸化の時間を調整する必要があります。また、TGN 到着速度を決定するを実行して、(たとえば、10 分、20 分、30 分など) 別の回のラベルです。
  7. 標識培地を取り除き、冷却板や氷で冷えた 1x PBS で 2-3 回セルを洗浄します。
  8. 換散バッファー (PBS 含んでいる 1% トリトン X-100 と 0.5% デオキシ コール酸) 2 mM PMSF とプロテアーゼ阻害剤のカクテル 1 補足の 1 mL を追加し、4 ° C でロッキング プラットフォーム上で 10-15 分間細胞をインキュベート
  9. こすりと 1.5 mL チューブ、ライセート、渦にライセートを転送し、4 ° C でエンド オーバー エンド回転子に 10-15 分のための場所
  10. 準備、postnuclear 4 ° C で 10 分間、10,000 × gで遠心分離によってライセート
  11. 新しい 1.5 mL のチューブを使用して、1.5 mL チューブのニッケルのスラリーの 20-30 μ L を準備し、優しく 1 分 1,000 x gでそれらをペレット化による 1x PBS で 1 回洗浄します。
    注:ニッケルではなく、ビーズ、ストレプトアビジン ビーズ (生物学: ナノボディでが場合ビオチン化) または生物学: ナノボディで (T7 または HA タグ) のエピトープに対する igg 抗体タンパク質 A ビーズを使用できます。
  12. 転送、postnuclear 1.5 mL チューブに lysate を含むニッケル ビーズと、nanobodies を分離するエンド オーバー エンド回転子の 4 ° C で 1 時間インキュベートします。因数 (50-100 μ L)、postnuclear のライセートを外し、SDS サンプルバッファーの総細胞の生物学: ナノボディで、GFP レポーターおよびコントロールを読み込みその後イムノブロット分析で沸騰します。
  13. 軽く 1 分 1,000 x gでペレット化によって PBS または換散バッファー x 1 にビードを 3 回洗浄しなさい。
    注:ビーズのより厳格な洗浄のため PBS または換散バッファーに 20 mM のイミダゾールを含めることができます。
  14. 慎重にビーズ洗浄バッファーのすべてを削除、サンプル バッファー x 2 の 50 μ L を追加、95 ° C で 5 分間沸騰させる
  15. 両方の負荷は 12.5 %sds ページのゲルおよび参照色素 (例えば、ブロモフェノール ブルー) が分離ゲルの終わりに達するまで、ページの標準プロトコルに従って実行 midi にビーズをゆでた。
    注:ミニの 12.5% を使用して、総細胞の生物学: ナノボディで、GFP レポーターおよびコントロールの読み込みのイムノブロット解析を実行できる SDS-PAGE またはプレキャスト勾配ゲル。
  16. 〜 30 mL の RT で 1 時間固定バッファー (ddH2O 10% 酢酸と 45% メタノール) の分離ゲルを修正、3 回 〜 50 mL の脱イオン水でゲルを洗浄し、ゲル乾燥の準備します。
  17. SDS ページのゲルを乾燥します。
    1. 慎重に伸ばしてしがみつくフィルム固定ジェル、プレカットのフィルター ペーパーでそれをカバーします。
    2. 乾燥のプラットフォーム上に、ろ紙をゲルを置く、真空のカバーに置き、ゲル乾燥の真空ポンプのスイッチします。3-5 h のためのゲルを乾燥させます。
    3. しがみつくフィルムを取り出し、蛍光体スクリーン装備オートラジオグラフィー カセットに乾燥ゲルを置きます。
  18. 画像オートラジオグラフィー蛍光体スクリーンの撮像素子を使用しています。メーカーの指示に従ってください。
    注:信号の強さに応じて蛍光体スクリーンに長くさらされるゲル必要を乾燥しました。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

様々 な細胞内の目的地への逆行性蛋白輸送を調べるためには、ラベルを付けると、セル表面30から組換え融合蛋白質に従ってください抗 GFP 生物学: ナノボディでベースのツールを開設します。ここでは、このような細菌の生産 nanobodies 誘導体し、硫酸化解析による TGN 到着を調査する彼らの使用と同様、蛍光顕微鏡と免疫ブロット、取り込みを研究?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

Nanobodies は、従来の抗体に比べて多くの利点を持つタンパク質バインダー足場の新たなクラスを表す: 彼らは小さく、安定した、単量体、高親和性と不足のジスルフィド結合33,35,のために選択できます。44,45細胞培養システムと生物発生生物学46,47,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、スイスの全米科学財団による助成金 31003A 162643 によって支えられました。ニコール Beuret とサポート Biozentrum イメージング コア施設 (IMCF) に感謝します

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GFP antibodySigma-Aldrich118144600001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibodyBethyl LaboratoriesA190-114A
Anti-actin antibodyEMD MilliporeMAB1501
Goat anti-rabbit HRPSigma-AldrichA-0545
Goat anti-mouse HRPSigma-AldrichA-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)ApplichemA3672
D-biotinSigma-AldrichB4501dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochlorideSigma-AldrichA3785dissolved in sterile water
DNase IApplichemA3778dissolved in sterile water
LysozymeSigma-Aldrich18037059001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA)Sigma-AldrichB5936
PuromycinInvivogenant-pr-1
Penicillin/StreptomycinBioconcept4-01F00-H
L-glutamineApplichemA3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Fetal calf serum (FCS)BiowestS181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfateHartmann AnalyticsARS0105Product contains 5 mCi
Earle's balanced saltsSigma-AldrichE6267
MEM amino acids (50x) solutionSigma-AldrichM5550
MEM vitamin solution (100x)Sigma-AldrichM6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836153001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)ApplichemA1008dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium saltApplichemA1491dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfateApplichemA1493dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue)Sigma-AldrichB-0149
Paraformaldehyde (PFA)ApplichemA3813
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Ni Sepharose High PerformanceGE Healthcare17-5268-01
His GraviTrap columnsGE HealthcareGE11-0033-99
His buffer kitGE HealthcareGE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columnsGE HealthcareGE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-wellBio-Rad456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
35 mm dishesFalcon353001
6-well platesTPP92406
Glass coverslips (No. 1.5H)VWR631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)ApplichemA0999.0025dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
TryptoneApplichemA1553
Yeast extractApplichemA1552
Magnesium chloride hexahydrateMerck Millipore105833dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrateMerck Millipore102382dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chlorideMerck Millipore106404dissolved in sterile water, stock is 5 M

参考文献

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737(2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15 Unit 15 10 (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

144 nanobodies EGFPHeLa

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved