JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Golgi için hücre yüzeyinden proteinlerin retrograd taşıma membran homeostazı korumak için önemlidir. Burada, biyokimyasal olarak hücre yüzey Golgi taşıma rekombinant proteinlerin functionalized nanobodies HeLa hücreleri kullanarak analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Proteinler ve membran hücre yüzeyinden Golgi ve ötesine taşıma Homeostazı, organel kimlik ve Fizyoloji için esastır. Retrograd protein Rating çalışmaya, biz son zamanlarda hücre yüzeyinden ışınlamaya Golgi kompleksi, ya sabit ve canlı hücre Imaging, elektron mikroskobu, ya da biyokimyasal olarak analiz etmek için çok yönlü bir nanobody tabanlı araç geliştirdik. Functionalized Anti-yeşil flüoresan protein (GFP) nanobodies mühendislik — küçük, monomeric, yüksek-benzeşme protein bağlayıcı — membran proteinlerinin bir hücre dışı GFP yan ile ilgi ifade hücre hatları için uygulanabilir. Derivatized nanobodies GFP gazetecilere bağlı özellikle içselleştirilmiş ve gazetecilere sıralama güzergah boyunca sırtlama nakletti. Nanobodies retrograd taşıma Floresans mikroskobu tarafından takip etmek ve askorbat peroksidaz 2 elektron tarafından muhabir-nanobody kompleksleri ultrastructural lokalizasyonu araştırmak için (APEX2) ile görüntülemede canlı fluorophores ile functionalized mikroskobu ve Kinetik trans-Golgi ağ (TGN) varış değerlendirmek için tirozin sulfation (TS) motiflerle. Bu yöntembilimsel makalede, biz bacterially hızlı ve functionalized nanobodies arındırmak için genel yordamı anahat. Biz bizim aracı endositik alımı ve kargo proteinler varış TGN analiz etmek için mCherry ve TS modifiye nanobodies kullanarak güçlü kullanımını göstermektedir.

Giriş

Proteinler ve çeşitli hücre içi bölmeleri için hücre yüzeyinden lipidler retrograd Rating membran homeostazı salgı dengelemek için ve bileşenleri anterograd taşıma makineleri1 geri dönüşüm için bakımı için önemlidir , 2. clathrin bağlı veya - bağımsız endositoz ile içselleştirilmesi, protein ve lipit kargo ilk doldurmak erken endosomes daha fazla nerede üzerinden ya plazma zarı için geri dönüşümlü endo lizozomal sistemi boyunca yönlendirildi veya hedeflenen trans-Golgi ağa (TGN). Endosomes ve/veya hücre yüzeyine gelen TGN için geri dönüşüm anterograd transmembran kargo reseptörleri ba * bağlı ve katyon bağımsız mannoz-6-fosfat reseptörleri (CDMPR ve CIMPR) gibi bir dizi fonksiyonel döngüsünün bir parçası olduğunu teslim etmek Yeni sentezlenen lizozomal TGN geç endosomes ve organellerin3,4,5, sortilin ve SorLA6,7ve Wntless (WLS) Wnt ligandlar hücre yüzeyine taşınması için hidrolazlar 8 , 9 , 10 , 11. TGN46 ve onun ilgili izoformlarının12,13,14, tuzaklarına (çözünür N- ethylmaleimide-duyarlı füzyon faktör eki reseptörleri) geri TGN için alındı diğer proteinler vardır 15 , 16 , 17, amiloid precursor protein (APP)18,19, ilerleyici eklem (ANK) protein20, ATP7A/B veya DMT121,22gibi ve transmembran metal taşıyıcı enzimler Karboksipeptidaz D, furin veya BACE123,24,25gibi işleniyor. Endojen bu proteinler dışında bakteriyel ve bitki toksinler (örneğin, Shiga ve kolera toksini, risin ve abrin) retrotranslocation için ER sitozol26,27ulaşmak için retrograd taşıma makineleri kaçırmak, 28,29.

Doğrudan retrograd trafiğini analiz için biz daha önce etiket ve kargo proteinler hücre yüzeyinden hücre içi bölmeleri30' a takip nanobody tabanlı bir araç geliştirdik. Nanobodies protein bağlayıcı Devegiller ve kıkırdaklı balıklar31,32içinde doğal olarak oluşan homodimeric ağır zinciri yalnızca antikorlar (hcAbs) türetilen yeni bir aile temsil eder. HcAbs değişken ağır zincir etki alanını (VHH) teşkil ve geleneksel antikorlar (örneğin, IgGs) üzerinde pek çok avantajı var: onlar monomeric, küçük (~ 15 kDa), yüksek oranda çözünür, disülfür bağları, yoksun bacterially ifade ve seçilmiş yüksek-benzeşme bağlama33,34,35,36. Bizim nanobody araç çok yönlü ve geniş uygun yapmak için functionalized anti-GFP nanobodies tagged GFP onların hücre dışı/lumenal etki ile yüzey-etiket ve parça proteinlere çalıştırmaya başladık. Nanobodies (APEX2) mCherry, askorbat peroksidaz 2 ile functionalization tarafından37veya tirozin sulfation (TS) dizileri, retrograd taşıma bonafide transmembran kargo proteinlerin sabit ya da-ebilmek var olmak çözümlemek ve hücre görüntüleme, yaşamak elektron mikroskobu, ya da biyokimyasal olarak. Tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 ve TPST2) aracılı tirozin sulfation ardından bir değişiklik için trans-Golgi sınırlı olduğundan/TGN, biz doğrudan çalışma taşıma ve Kinetik bu hücre yüzeyinden ilgi proteinlerin Hücre içi Golgi yuvası38,39,40.

Bu yöntemleri makalede, biz functionalized nanobodies (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry ve türevleri) memeli hücreleri30retrograd Ulaştırma analiz etmek için uygulamalar için uygun üretim kolaylığı tanımlamak. Biz esas olarak TS siteyi değiştiren nanobody kullanım için sulfation yuvası hücre yüzeyinden hücre içi trafik analiz odaklanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Functionalized Nanobodies ile bakteriyel dönüştürme

Not: Bu iletişim kuralı yukarıda açıklanan30ifade, arıtma ve functionalized anti-GFP nanobodies analizi için optimize edilmiştir. Derivatization diğer protein moieties ile bu standart protokol değişikliği gerektirebilir.

  1. Chemocompetent bakteri (~ 100 µL) protein ifade için uygun çözülme (örneğin, Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) hücreleri) buz yerleştirerek.
    Not: Chemocompetent standart laboratuvar yordamlara göre bakteri hücreleri hazırlayın. Alternatif olarak, kimyasal olarak yetkili bakteri hücreleri ticari olarak satın alınabilir.
  2. 50 ekleyin functionalized nanobodies kodlama bir plazmid ng. Yeterli siteye özgü biotinylation bir nanobody muhabir sırasında bakteriyel ifade izin vermek için Ayrıca üç aşamalı bir aşırı ekleyin (150 ng), biotin ligaz BirA kodlama bir bakteriyel ifade plazmid (Ayrıca plazmid bilgi için bkz. Tablo 1 ). Yavaşça damlalıklı yukarı ve aşağı.
    Not: Eğer nanobody biotinylation gerekli değildir veya nanobody gazetecilere bir biotin alıcısı peptid (BAP) yoksun bir plazmid BirA kodlama ile ortak dönüştürme gerekli değildir.
  3. Bakteriyel hücreler buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya.
  4. Isı şok bakteri hücreleri bir su banyosu veya Isıtma blok 42 ° C'de 1 dk. için koyarak.
  5. Oda sıcaklığında (RT) 1 mL ekleyin Luria suyu (LB) orta ve 1 h 37 ° C'de direnç genleri fenotipik ifade izin vermek için bir thermoshaker dönüştürülen bakterilerde kuluçkaya. 1 L LB hazırlamak için orta, denge 5 g maya özü, 10 g tryptone ve 10 g NaCl, su ile doldurun ve ısıyla tarafından sterilize. Functionalized nanobody direnç Ampisilin/carbenicillin içeren bir ifade vektör subcloned adım 1.5 atlanabilir.
  6. Bakteri 11.000 x g 1 dk. için de cips ve taze LB orta 100 µL içinde resuspend.
  7. Askıya alınan bakteri (örneğin, ile 50 µg/mL sefaloridin ve bakteri (yukarıdaki adım 1.2) belirtildiği gibi nanobody muhabir ve BirA ile birlikte dönüştürülmüş zaman 50 µg/mL carbenicillin) anılan sıraya göre antibiyotik içeren LB plakalar üzerinde plaka.
  8. Kuluçka 37 ° C'de LB tabak yerleştirin ve büyümeye izin gecelik (O/N).
    Not: Protokol burada 4 ° C'de yetişkin kolonileri LB plakalı depolayarak duraklatılmış Parafilm LB plakalarının için kullanın.

2. bakteriyel sıvı kültür ve indüksiyon Functionalized Nanobody ifade

  1. Vektör plaka dan ilgi içeren bir bakteriyel koloni almak ve antibiyotik O/N 37 ° C'de titreyen bir kuluçka takıma LB orta 20 mL içeren bir balonun içinde büyümesine izin (Ayrıca bkz: adım 1.7 seçimi antibiyotik ile ilgili).
  2. Ertesi gün, Yetişkin 20 mL bakteri kültürü 1 L LB orta seçim antibiyotik içeren bir şişesi içine oranında seyreltin.
  3. 0.6-0.7 OD600 ulaşıncaya kadar 37 ° C'de bakteri kültürü kuluçkaya devam'i tıklatın. Kültür protein ifade inducing önce RT için soğumasını sağlar.
  4. Functionalized nanobodies ve BirA protein ifadesi 1 M izopropil-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) son bir konsantrasyon uyarıcı (1:1, 000 seyreltme) 1 mm için 1 mL eklenmesiyle neden. Ayrıca 10 mL 200 µM d-biotin BAP epitope functionalized nanobodies (Ayrıca plazmid bilgi için bkz. Tablo 1 ) mevcut biotinylation izin vermek için büyüme orta sonuçlanan bir 20 mM d-biotin stok çözeltisi ekleyin
    Not: D-biotin hisse senedi çözüm GKD2içinde O hazırlanır ve drop-wise buna ek olarak 500 mM NaH2PO4tarafından çözümü haline getirdi. Alternatif olarak, d-biotin de DMSO içinde çözülmüş. APEX2 için erimiş nanobodies üretmek için (VHH-APEX2), LB orta ayrıca heme birleşme tanıtmak için 1 mM 5-Aminolevulinik asit (dALA) hidroklorür ile tamamlanabilir gerekir. dALA GKD2O. bir 100 mM hisse senedi çözüm olarak hazırlanır
  5. 1 L IPTG kaynaklı bakteri kültürü için VHH-2xTS için 4 h 30 ° C'de, 20 ° C veya RT O/N için VHH-APEX2 veya 16 kuluçkaya ° C O/N için VHH-mCherry (Ayrıca plazmid bilgi için bkz. Tablo 1 ).
    Not: Yeni bir nanobody yapı için ifade koşullar tarafından deneyci optimize edilmiş olması gerekir.
  6. Bakteriyel kültür balonun bir 1 L Santrifüjü şişe içine aktarmak ve hücreleri 5000 x g 45 dk. Decant süpernatant için 4 ° C'de de cips ve arıtma ile devam edin.
    Not: Protokol burada-80 ° C'de bakteriyel Pelet süresiz olarak depolayarak duraklatılmış. VHH-APEX2 veya VHH-mCherry için Pelet genellikle kahverengi (nedeniyle eklenen heme) ya da pembe, sırasıyla.

3. Functionalized Nanobodies arıtma

  1. Gerekirse, buzda donmuş bakteriyel Pelet çözülme (Ayrıca bkz: adım 2.6).
  2. Buz gibi bağlama arabellek (1 x PBS 20 mM imidazole) 30 mL bakteri hücre Pelet ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Resuspended bakteri etiketli 50 mL tüp içine aktarın.
  3. 30 mL bağlama arabellek ile 200 µg/mL lizozim, 20 µg/mL Dnaz ben, 1 mM MgCl2 ve 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ve RT, 10 min için ilk ve sonra bitti sıra shaker üzerinde 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya ek.
  4. Mekanik bir ipucu sonicator süspansiyon yerleştirerek 50 mL tüp bakteri hücreleri parçalayıcı. Sabit 3 x 1 dk darbeleri ile 1dk soğutma dönemleri arasında geçerlidir.
  5. 15.000 x g için enkaz ve sağlam hücreleri cips 45 dk 4 ° c de lysate bakteriyel santrifüj kapasitesi. Sonicated bakteri hücre lysate ya Santrifüjü için uygun aralıklarla şişe içine aktarmak veya birkaç 5 mL tüpler için masa üstü Santrifüjü lysate bölün.
  6. Süpernatant yeni 50 mL tüp içine aktarmak ve pelleted enkaz atın.
  7. Temizlenen depolamak arıtma immobilize metal benzeşme Kromatografi (IMAC) tarafından hazırlanırken buzda lysate. Functionalized nanobodies histidin öğesini izole etmek için istihdam tek kullanımlık (bkz. Tablo reçetesi) onun sütunları hızlı ve basit yerçekimi akış arıtma izin.
    Not: Alternatif olarak, toplu iş arıtma ticari sütunlar yerine de kullanılabilir.
  8. Onun sütun bir Metal stand montaj.
    1. Sütunları depolama çözümü konik ve onun equilibrate sütun bağlama arabellek (1 x PBS 20 mM imidazole) 10 mL ile.
    2. Yerçekimi akımını (akış yoluyla atılır) boş.
  9. Yavaş yavaş temizlenen bakteriyel lysate (~ 30 mL) sütuna yerleştirin. Yerçekimi akımını (akış yoluyla atılır) boş.
  10. Onun yıkama sütun 2 x 10 mL bağlama arabellek (1 x PBS 20 mM imidazole) ile.
  11. Nanobodies 2 mL elüsyon arabelleği (1 x PBS 500 mM imidazole) ile 2 mL tüp içine elute ve bir arabellek değişimi uygulayın.
  12. Arabellek Exchange.
    1. Bir desalting equilibrate sütun bir 50 mL tüp sütun bağdaştırıcısıyla 5 kere 5 mL 1 x PBS de yerleştirilir ( Tablo malzemelerigörmek).
    2. Arabellek Paketli yatağa girmek izin. Akışı aracılığıyla atın.
    3. Beşinci PBS denge sonra 1000 x g 2 min için adresindeki sütun spin.
    4. Akışı aracılığıyla atın.
    5. Sütun yeni bir 50 mL tüp üzerine bağdaştırıcısıyla yerleştirin. (Kimden adım 3.11) eluted functionalized nanobody desalting sütun PBS equilibrated ve 1000 x g 2 min için spin üzerine 2 mL yük ve eluate toplamak.
      Not: Ticari desalting sütunları yerine, diyaliz arabellek oluşturma değişimi için uygulanabilir.
  13. Bicinchoninic (BCA) veya üreticinin yönergelerine göre Bradford tahlil kullanarak eluate protein (nanobody) konsantrasyonu belirlemek.
    Not: 2-10 mg/mL stok bir konsantrasyon GFP muhabiri hücre hatları ile nanobody alımını deneyleri için idealdir.

4. doğrulama Functionalized Nanobody ifade (Coomassie boyama)

  1. 10-%12,5 jelleri Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) standart protokolleri göre hazırlayın.
    Not: Alternatif olarak, piyasada bulunan prekast degrade jelleri kullanın.
  2. Saf functionalized nanobody 1,5 mL tüp ve örnek arabelleği 95 ° c 5 min için kaynatın içine damlalıklı 20 µg.
    Not: Örneğin, bir 2 mg/mL nanobody hisse senedi çözüm 10 µL 10 µL 2 x örnek arabelleği ile 1,5 mL tüp içine ekleyin. Birim çok küçük ise, daha fazla örnek arabellek eklemeden önce PBS nanobody sulandırmak.
  3. Örnek arabelleği bir SDS-polyacrylamide jel üzerine haşlanmış arıtılmış nanobody yüklemek ve başvuru boya (örneğin, mavi bromophenol) ayıran jel Coomassie boyama tarafından takip, sonuna ulaşmıştır kadar standart sayfa protokole göre çalıştırmak ve destaining.
  4. Coomassie boyama ve Destaining jel.
    1. Jel uncast ve Coomassie boyama çözüm (10 g/L Coomassie hisse senedi % 10 Asetik asit ve % 45 metanol GKD2O çözümde % 5) 20-30 dk RT az hareketli bir sallayarak platform üzerinde leke. Jel tamamen boyama çözümde örtülmelidir.
    2. Jel destain 2 - 3 kez ile çözüm (% 7.5 Asetik asit ve % 15 metanol GKD2O) için 1 h her RT, jel O/N daha fazla destaining için terk etmeden önce destain.
      Not: Aşırı Coomassie verimli bir şekilde mutfak kağıt havlu jel çevresinde yerleştirerek batırılmış.
  5. Jel bir Imager veya seçtiğiniz kamera ile görüntü.
    Not: Nanobody ifade daha fazla (Ayrıca bkz: şekil 1A) onun epitopları hedefleme antikorlar immunoblot analizi tarafından doğrulanabilir.

5. Functionalized Nanobodies floresan boyama için kültürlü hücreleri tarafından alımını

  1. Bir hücre kültür başlık, tohum ~ 400.000 için 500.000 HeLa hücreleri stabil bir muhabir GFP öğesini protein 18 mm cam coverslips (No 1.5 H) 35 mm yemekleri veya 6-şey kümeleri üzerinde antibiyotikler (Dulbecco'nın modifiye kartal orta, DMEM içeren tam orta ile ifade etme 100 adet/mL streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 1,5 µg/mL puromisindir ile % 10 fetal buzağı serum (FCS)).
    Not: Burada, stabil EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP örnek amacıyla ifade HeLa hücreleri kullanırız. İstikrarlı hücre hatları dışında Ayrıca geçici transfected HeLa hücreleri kullanılabilir. İstikrarlı hücre hatları ile ebeveyn sigara transduced HeLa hücreleri, doğrudan karşılaştırma için bu adımda ortak ekili olabilir.
  2. O/N hücrelerin prolifere için % 7,5 CO2 kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Hücreleri bir confluency ~ %80 ertesi gün olmalıdır.
  3. Damlalıklı 2 µL 2 mg/mL nanobody hisse senedi çözüm tam orta 2 mL içeren bir 15-50 mL tüp içine (Bu birim bir 35 mm yemeği veya bir şey, bir 6-şey kümesinin kapağı, orta ve nanobody orantılı olarak daha fazla hücre kültür d eklemek seviyesini ayarlamak için yeterli değil ishes veya kümeleri).
    Not: Gösterim amacıyla, biz burada kullanmak VHH-mCherry, yok daha fazla antikor boyama nanobody ( şekil 2Cbakınız) EGFP gazeteciler tarafından içselleştirilmiş görmek için gerekli olduğundan.
  4. Büyüme orta hücrelerdeki kaldırmak ve 35 mm çanak veya 6-de birim başına 2 µg/mL functionalized nanobody içeren prewarmed tam orta 2 mL ekleyin.
  5. Muhabir-aracılı nanobody alımını sağlamak için % 7,5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 1 h için hücreleri kuluçkaya.
    Not: Bağlı olarak planlanan deneme, zaman nanobody Alım ayarlanması gerekiyor. Burada gösterilen deneme için 1 h kararlı durum nanobody Alım EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP ulaşmak yeterlidir.
  6. Orta kaldırmak ve bulunduğu hücreleri 1 mL 1 x PBS RT., 2 - 3 kez yıkamak
  7. % 3 paraformaldehyde (PFA) 10 dk RT. az için 1 mL ile hücreleri tamir
  8. İngiltere'de yılın çözümü kaldırmak ve 50 mM NH4Cl 1 x PBS RT., 5 min için 1 mL ile kalan sabitleştirici gidermek
    Not: %3 PFA ayrı ayrı olarak sabitleştirici kaybı atılmalıdır.
  9. Bulunduğu hücreleri 1 mL 1 x PBS RT., 3 kez yıkamak
  10. 1 mL %0.1 hücrelerle permeabilize Triton X-100 1 x PBS RT., 10 dk içinde
    Not: Hiçbir permeabilization gerekli olmasına rağmen daha sonra hücrelerin montaj ortamda katıştırılmış EGFP ve mCherry floresan iyidir.
  11. Bulunduğu hücreleri 1 mL 1 x PBS RT., 3 kez yıkamak
  12. Coverslips üstünde bir damla (~ 100 µL) Forseps ile % 1 BSA RT., 5 min için 5 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) içeren 1 x PBS içinde yerde
  13. Coverslips geri çanak/kuyunun içine yerleştirin ve 3 kez ile 1 mL 1 x PBS RT., yıkama
  14. Cam slayt etiket ve Fluoromount-G. hücrelerle bağlama 3-4 h için karanlıkta sertleşmesine ve cam slaytları lamba koruma altında 4 ° C'de depolama montaj orta izin.
  15. Görüntü desenleri tercih (örneğin, nokta tarama Confocal dik mikroskop) mikroskop kullanarak boyama.

6. Functionalized Nanobodies (için Sulfation analiz) kültürlü hücreleri tarafından alımını

  1. Bir hücre kültür başlık, stabil bir muhabir GFP öğesini protein 35 mm yemekler veya tam orta içeren antibiyotik (Dulbecco'nın modifiye kartal orta, % 10 fetal buzağı ile takıma DMEM, 6-şey kümelerinde ifade ~ 400.000 için 500.000 HeLa hücreleri tohum Serum (FCS), 100 adet/mL streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 1,5 µg/mL puromisindir).
    Not: Yukarıda belirtildiği gibi biz burada HeLa hücreleri stabil EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP örnek amacıyla ifade kullanın. İstikrarlı hücre hatları dışında Ayrıca geçici transfected HeLa kullanılabilir.
  2. O/N hücrelerin prolifere için % 7,5 CO2 kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Hücreleri bir confluency ~ %80 ertesi gün olmalıdır.
  3. Tam orta kaldırmak, 2 kez 1 x PBS RT, yıkayın ve % 7.5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 1 h için orta (SFM) sülfat içermeyen hücrelerle açlıktan.
    Not: SFM kartal dengeli tuzları için 500 mL 10 mL MEM amino asitler (50 x) çözeltisi, 5 mL 5 mL vitamini çözeltisi (100 x) ve 900 µL CaCl2·2H2O L-glutamin (200 mM), de ekleyerek hazırlanır. Bir 0,22 µm filtre ve aliquot üzerinden geçmek.
  4. Havalandırılmış hood veya radyoaktivite iş için belirlenmiş Bank, SFM sodyum tuzu olarak 0.5 MCI/mL [35S] sülfat içeren orta etiketleme sülfat hazırlayın.
    Uyarı: Dikkatle radyoaktivite içeren tüm çözümleri ele. Yalnızca belirlenen davlumbaz veya banklar çalışmak. Bütün malzeme (ipuçları, tüpler, tabaklar, vb) veya yıkama arabellekleri radyoaktivite ile temas halinde toplanan ve ayrı ayrı bertaraf gerekiyor. Bunu tüm adımları (adım 6.5-6.20) için de.
  5. VHH-2xTS 1 x PBS sülfat orta 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon olarak etiketleme içine ekleyin.
    Not: Denetimi olarak da belirli etiketleme göstermek için VHH-std ya da başka bir nanobody yoksun TS siteleri içerir.
  6. SFM tarafından 0.7 mL orta içeren 0.5 MCI/mL [35S] sülfat ve 2 µg/mL VHH-2xTS etiketleme sülfatın değiştirin ve radyoaktivite ile iş için belirlenmiş bir % 7.5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 1 h için hücreleri kuluçkaya.
    Not: Bağlı olarak planlanan deney, nanobody sulfation zaman ayarlanması gerekiyor. Buna ek olarak, TGN varış Kinetik belirlemek için etiketleme için farklı zamanlarda (örneğin, için 10 dk, 20 dk, 30 dk, vb.) gerçekleştirilir.
  7. Etiketleme orta kaldırmak ve bulunduğu hücreleri buz gibi 1 x PBS bir soğutma plaka veya buz üzerinde 2 - 3 kez yıkayın.
  8. 1 mL 2 mM PMSF ve 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ile takıma lizis arabellek (PBS içeren % 1 Triton X-100 ve % 0.5 deoxycholate) ekleyin ve 10-15 dk 4 ° C'de sallanan bir platformda için hücreleri kuluçkaya
  9. Scrape ve lysate 1,5 mL tüp içine, girdap lysate, transfer ve 10-15 dk 4 ° C'de bir bitti sıra rotator üzerinde yer
  10. Bir postnuclear hazırlamak, 10.000 x g 4 ° C'de 10 dakika aralıklarla tarafından lysate
  11. Yeni 1,5 mL tüp kullanarak, bir bulamaç nikel boncuk 1,5 mL tüp içinde 20-30 µL hazırlamak ve bir kez tarafından yavaşça onları 1000 x g 1 dk. için de peletleme 1 x PBS ile yıkayın.
    Not: Nikel yerine boncuk, (nanobody biotinylated ise) streptavidin boncuk veya protein A boncuk nanobody (T7 - veya HA-etiket) bir epitope karşı bir IgG ile kullanılabilir.
  12. Postnuclear transfer lysate 1,5 mL tüp içine içeren nikel boncuk ve nanobodies izole bir bitti sıra dönme-e doğru tarih 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya. Bir aliquot (50-100 µL), postnuclear lysate kaldırın ve SDS örnek arabelleği toplam hücre ilişkili nanobody, GFP muhabir ve denetim yükleme sonraki immunoblot analizi için kaynatın.
  13. Boncuk 3 kez ile 1 PBS veya lizis tampon x 1000 x g 1 dk. için de hafifçe peletleme tarafından yıkayın.
    Not: Boncuk daha sıkı yıkanmasında, 20 mM imidazole PBS veya lizis arabellekte dahil edilebilir.
  14. Dikkatle tüm çamaşır arabellek boncuk kaldırmak, 2 örnek arabellek x 50 µL eklemek ve 95 ° C'de 5 dakika kaynatın
  15. Her iki yük bir MIDI üstündeki SDS-sayfa jel ve başvuru boya (örneğin, mavi bromophenol) ayıran jel ulaştı kadar standart sayfa protokole göre çalıştırmak % 12.5 haşlanmış.
    Not: Toplam hücre ilişkili nanobody, GFP muhabir ve denetim yükleniyor Immunoblot analizi da mini bir %12,5 kullanarak gerçekleştirilebilir SDS-sayfa veya prekast degrade jel.
  16. Ayıran jel RT, 1 h için fiksasyon arabellek (% 10 Asetik asit ve % 45 metanol GKD2O) ~ 30 mL fix, jel üç kez ~ 50 mL deiyonize su ile yıkayın ve jel kurutma için hazırlamak.
  17. SDS-sayfa jelleri kurutma.
    1. Dikkatli bir şekilde sabit jel gergin sarılmak filmde yer ve precut filtre kağıdı ile kapağı.
    2. Filtre kağıdı ile jel kurutma platformu üzerine yerleştirin, vakum kapak yerleştirin ve vakum pompası jeli kurutma için geçiş. 3-5 h için jel kuru.
    3. Sarılmak film kaldırmak ve bir fosfor ekran ile donatılmış bir autoradiography kaset kurutulmuş jel yerleştirin.
  18. Fosfor ekran Imager kullanarak görüntü autoradiograph. Üreticinin yönergeleri izleyin.
    Not: Sinyal gücünü bağlı olarak, artık bu fosfor ekranlarla maruz jelleri ihtiyaç kurumuş.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Retrograd protein taşıma çeşitli hücre içi hedeflere araştırmak için biz son zamanlarda etiket ve rekombinant füzyon proteinler hücre yüzey30takip nanobody tabanlı bir anti-GFP aracı kurduk. Burada, biz böyle bakteri üretimi nanobodies derivatized ve endositik alımını Floresans mikroskobu ve immunoblotting yanı sıra TGN varış göre sulfation analizi araştırmak için bunların kullanımı eğitim için kendi uygulama göstermek göstermek. ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Nanobodies protein bağlayıcı iskele geleneksel antikorlar üzerinden pek çok avantajları ile ortaya çıkan bir sınıfı temsil: Bunlar küçük, istikrarlı, monomeric,33,35, yüksek benzeşme ve eksikliği disülfür bağları için seçilen 44 , 45. hücre kültür sistemleri ve gelişim biyolojisi46,47,organizmalard...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Grant 31003A-162643 tarafından İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Nicole Beuret ve Biozentrum Imaging Core tesisi (IMCF) destek için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GFP antibodySigma-Aldrich118144600001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibodyBethyl LaboratoriesA190-114A
Anti-actin antibodyEMD MilliporeMAB1501
Goat anti-rabbit HRPSigma-AldrichA-0545
Goat anti-mouse HRPSigma-AldrichA-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)ApplichemA3672
D-biotinSigma-AldrichB4501dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochlorideSigma-AldrichA3785dissolved in sterile water
DNase IApplichemA3778dissolved in sterile water
LysozymeSigma-Aldrich18037059001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA)Sigma-AldrichB5936
PuromycinInvivogenant-pr-1
Penicillin/StreptomycinBioconcept4-01F00-H
L-glutamineApplichemA3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Fetal calf serum (FCS)BiowestS181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfateHartmann AnalyticsARS0105Product contains 5 mCi
Earle's balanced saltsSigma-AldrichE6267
MEM amino acids (50x) solutionSigma-AldrichM5550
MEM vitamin solution (100x)Sigma-AldrichM6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836153001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)ApplichemA1008dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium saltApplichemA1491dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfateApplichemA1493dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue)Sigma-AldrichB-0149
Paraformaldehyde (PFA)ApplichemA3813
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Ni Sepharose High PerformanceGE Healthcare17-5268-01
His GraviTrap columnsGE HealthcareGE11-0033-99
His buffer kitGE HealthcareGE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columnsGE HealthcareGE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-wellBio-Rad456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
35 mm dishesFalcon353001
6-well platesTPP92406
Glass coverslips (No. 1.5H)VWR631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)ApplichemA0999.0025dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
TryptoneApplichemA1553
Yeast extractApplichemA1552
Magnesium chloride hexahydrateMerck Millipore105833dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrateMerck Millipore102382dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chlorideMerck Millipore106404dissolved in sterile water, stock is 5 M

Referanslar

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737(2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15 Unit 15 10 (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonsay 144nanobodiesretrograd ta maGolgi kompleksitirozin sulfationradiolabelingEGFPHeLa h creleri bakteri ifade

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır