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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Retrograder Transport von Proteinen von der Zelloberfläche an die Golgi unbedingt Membran Homöostase. Hier beschreiben wir eine Methode um biochemisch Zelle Oberfläche-Golgi Transport von rekombinanten Proteinen mit funktionalisierten Nanobodies in HeLa-Zellen zu analysieren.

Zusammenfassung

Transport von Proteinen und Membranen von der Zelloberfläche, die Golgi und darüber hinaus ist wichtig für die Homöostase, Organell Identität und Physiologie. Um die retrograde Protein Verkehr zu untersuchen, haben wir vor kurzem eine vielseitige gemeinnützige-basierte Toolkit zu analysieren, Transport von der Zelloberfläche, die Golgi-Komplex, entweder von festen und live Cell imaging, mittels Elektronenmikroskopie oder biochemisch entwickelt. Wir entwickelten funktionalisierten Anti-grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Nanobodies – klein, Monomere, hohe Affinität Protein Bindemittel – die auf Zell-Linien mit dem Ausdruck Membranproteine von Interesse mit einer extrazellulären GFP glyko-angewendet werden können. Derivatisierte Nanobodies verpflichtet, die GFP-Reporter sind speziell verinnerlicht und Huckepack Sortierung Routen die Reporter transportiert. Nanobodies wurden funktionalisiert mit Fluorophore zu folgen retrograden Transport durch Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging mit Ascorbat-Peroxidase 2 (APEX2) zu untersuchen, die Ultrastrukturforschung Lokalisierung der Reporter-gemeinnützige komplexe von Elektron zu leben Mikroskopie und mit Tyrosin Sulfatierung (TS) Motive zur Kinetik der Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) Ankunft zu beurteilen. In diesem methodischen Artikel erläutern wir das allgemeine Verfahren um bakteriell auszudrücken und funktionalisierten Nanobodies zu reinigen. Wir veranschaulichen die starke Verwendung von unserem Tool mit mCherry und TS geändert Nanobodies, endocytic Aufnahme und TGN Ankunft der Ladung Proteine zu analysieren.

Einleitung

Retrograde Verkehr von Proteinen und Lipiden von der Zelloberfläche an verschiedenen intrazellulären Kompartimenten ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase der Membran, Sekretion auszugleichen und Komponenten von Anterograde Transport Maschinen1 zu recyceln , 2. nach Internalisierung über Clathrin-abhängige oder -unabhängige Endozytose, Protein- und Lipid-Ladung zuerst früh bevölkern Endosomen aus, wo sie weitere sind entweder entlang der Endo-lysosomalen System recycelt, die Plasmamembran umgeleitet oder gezielt mit dem Trans-Golgi-Netzwerk (TGN). Recycling aus Endosomen und/oder der Zelloberfläche, die TGN ist Teil des funktionalen Zyklus einer Reihe von Anterograde transmembranen Fracht-Rezeptoren, wie z. B. die kationen-abhängige und kation-unabhängige Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren (CDMPR und CIMPR) liefern neu synthetisiert lysosomale Hydrolasen aus der TGN zu späten Endosomen und Lysosomen3,4,5, Sortilin und SorLA6,7und Wntless (WLS) Transport von Wnt-Liganden an die Zelloberfläche 8 , 9 , 10 , 11. andere Proteine, die zurück zu der TGN abgerufen werden TGN46 und seine Verwandten Isoformen12,13,14, SNAREs (lösliche N- Ethylmaleimide-Sensitive Fusion Faktor Anhaftung Rezeptoren) 15 , 16 , Amyloid-Precursor-Protein (APP)18,19, progressive Ankylose (ANK) Protein20, 17, Metal Transporter wie ATP7A/B oder DMT121,22, und transmembranen Verarbeitung von Enzymen einschließlich Carboxypeptidase D, Furin oder BACE123,24,25. Abgesehen von dieser körpereigene Proteine entführen Bakterien- und Pflanze Giftstoffe (z.B., Shiga und Cholera-Toxin Rizin und Ranker) retrograder Transport Maschinen, die ER für Retrotranslocation in der Zellflüssigkeit26,27zu erreichen, 28,29.

Um direkt retrograde Datenverkehr analysieren, haben wir zuvor entwickelt, eine gemeinnützige-basierte Toolkit zu beschriften und Ladung Proteine von der Zelloberfläche zum intrazellulären Kompartimenten30folgen. Nanobodies repräsentieren eine neue Familie von Protein-Bindemittel Homodimeric Heavy-Kette-nur Antikörper (HcAbs), die natürlicherweise in Kameliden und Cartilaginous Fische31,32abgeleitet. Sie bilden die Variable Heavy-Kette-Domäne (LHKW) der HcAbs und haben viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Antikörper (z. B. IgGs): sie sind Monomere, klein (~ 15 kDa), sehr löslich, frei von Disulfid-Bindungen, bakteriell ausgedrückt werden können und für ausgewählte hohe Affinität verbindlichen33,34,35,36. Um unsere gemeinnützige Tool vielseitig und breit anwendbar zu machen, haben wir funktionalisierten Anti-GFP Nanobodies Oberfläche-Label und Track Proteinen getaggt mit GFP in ihrer extrazellulären/lumenal Domain beschäftigt. Durch Funktionalisierung der Nanobodies mit mCherry, Ascorbat-Peroxidase 2 (APEX2)37oder Tyrosin Sulfatierung (TS) Sequenzen, retrograder Transport von Bonafide transmembranen Ladung Proteine analysiert werden kann, indem Sie entweder behoben und live Cell Imaging, von Elektronenmikroskopie, oder biochemisch. Da Tyrosin Sulfatierung vermittelt durch Tyrosylprotein Sulfotransferasen (TPST1 und TPST2) eine posttranslationale Modifikation nur auf das Trans-Golgi ist/TGN, können wir direkt studieren, Transport und die Kinetik der Proteine des Interesses von der Zelloberfläche dazu intrazelluläre Golgi Fach38,39,40.

In diesem Artikel Methoden beschreiben wir die einfache Herstellung von funktionalisierten Nanobodies (LHKW-2xTS, - APEX2, - mCherry und Derivate) eignet sich für vielfältige Anwendungen, retrograden Transport in Säugerzellen30zu analysieren. Wir konzentrieren uns hauptsächlich auf die Verwendung von TS Standort geändert gemeinnützige für Analyse der intrazellulären Verkehr von der Zelloberfläche in das Fach der Sulfatierung.

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Protokoll

(1) bakterielle Transformation mit funktionalisierten Nanobodies

Hinweis: Dieses Protokoll wurde für den Ausdruck, Reinigung und Analyse von funktionalisierten Anti-GFP Nanobodies wie zuvor beschrieben30optimiert. Derivatisierung mit anderen Protein Moieties erfordern Änderung des standard-Protokoll.

  1. Auftauen von Chemocompetent Bakterien (~ 100 µL) geeignet für Protein-Expression (z. B. Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) Zellen) auf Eis gelegt.
    Hinweis: Bereiten Sie Chemocompetent Bakterienzellen nach standard-Lab-Verfahren. Alternativ können chemisch kompetente Bakterienzellen kommerziell erworben werden.
  2. Fügen Sie 50 ng ein Plasmid funktionalisierten Nanobodies-Codierung. Um ausreichende standortspezifische Biotinylierungen der gemeinnützige Reporter während bakterielle Ausdruck zu ermöglichen, auch hinzufügen, eine dreifache Selbstbeteiligung (150 ng) von einer bakteriellen Expressionsplasmid Codierung Biotin Ligase BirA (siehe auch Tabelle 1 Plasmid-Informationen). Pipettieren Sie sanft auf und ab.
    Hinweis: Wenn gemeinnützige Biotinylierungen nicht notwendig ist oder die gemeinnützige Reporter frei von einem Biotin-Akzeptor-Peptid (BAP sind), ist Co-Transformation mit einem Plasmid BirA-Codierung nicht erforderlich.
  3. Inkubieren Sie die Bakterienzellen für 30 min auf Eis.
  4. Hitze Schock die Bakterienzellen werden, indem sie für 1 min bei 42 ° C in einem Wasserbad oder einem Heizblock.
  5. Fügen Sie 1 mL der Raumtemperatur (RT) Luria Brühe (LB) Medium und inkubieren Sie die transformierten Bakterien in eine Thermoshaker für 1 h bei 37 ° C Phänotyp der Resistenz-Gene zu ermöglichen. 1 L LB vorbereiten mittlere, Balance 5 g Hefe Extrakt, 10 g Tryptone und 10 g NaCl, mit Wasser auffüllen und sterilisieren durch Autoklavieren. Wenn die funktionalisierten gemeinnützige in eine Resistenz gegen Ampicillin/Carbenicillin mit Expressionsvektor subcloned worden, kann Schritt 1.5 entfallen.
  6. Pellet-die Bakterien bei 11.000 X g für 1 min und Aufschwemmen in 100 µL frisches LB-Medium.
  7. Platte die schwebenden Bakterien auf LB-Platten mit den entsprechenden Antibiotika (z. B. mit 50 µg/mL Kanamycin und 50 µg/mL Carbenicillin wenn die Bakterien Co transformierten mit gemeinnützige Reporter und BirA gewesen sein, wie oben (Schritt 1.2) angegeben).
  8. Die LB-Platten in einem Inkubator bei 37 ° C und lassen wachsen über Nacht (O/N).
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden, durch die Speicherung der LB-Platte mit gewachsenen Kolonien bei 4 ° C. Verwenden Sie Parafilm, um LB-Platten zu versiegeln.

(2) flüssigen Bakterienkultur und Induktion von funktionalisierten gemeinnützige Ausdruck

  1. Wählen Sie eine bakterielle Kolonie mit dem Vektor des Interesses von der Platte und lassen es wachsen in ein Fläschchen mit 20 mL LB-Medium mit Antibiotika O/N in einem schütteln Inkubator bei 37 ° C ergänzt (siehe auch Punkt 1.7 bezüglich Auswahl Antibiotika).
  2. Verdünnen Sie am nächsten Tag die gewachsene 20 mL Bakterienkultur in eine Flasche mit 1 L LB-Medium mit Auswahl Antibiotika.
  3. Weiterhin die Bakterienkultur bei 37 ° C inkubieren, bis es eine OD600 von 0,6-0,7 erreicht. Ermöglichen Sie die Kultur auf RT abkühlen lassen bevor Induktion der Proteinexpression.
  4. Protein-Expression von funktionalisierten Nanobodies und BirA durch die Zugabe von 1 mL 1 M Isopropyl-β-d-Thiogalactopyranosid (IPTG), eine Endkonzentration von 1 mM von der Induktor (1:1, 000 Verdünnung) zu induzieren. Auch fügen Sie 10 mL einer 20 mM d-Biotin-Vorratslösung wiederum 200 µM d-Biotin mittelfristig Wachstum ermöglichen Biotinylierungen die BAP Epitops im funktionalisierten Nanobodies (siehe auch Tabelle 1 Plasmid-Informationen)
    Hinweis: D-Biotin-Stammlösung ist DdH2O vorbereitet und durch drop-wise Zugabe von 500 mM NaH2PO4in Lösung gebracht. D-Biotin kann alternativ auch in DMSO aufgelöst werden. Nanobodies verschmolzen zu APEX2 produzieren (LHKW-APEX2), die LB-Medium muss zusätzlich ergänzt werden, mit 1 mM 5-Aminolevulinic Säure (dALA) Hydrochlorid Häm Eingliederung zu fördern. dALA ist als eine 100 mM-Stammlösung in DdH2O. bereit.
  5. Brüten die IPTG induziert 1 L Bakterienkultur bei 30 ° C für 4 h für LHKW-2xTS, bei 20 ° C oder RT O/N für LHKW-APEX2 oder bei 16 ° C O/N für LHKW-mCherry (siehe auch Tabelle 1 Plasmid-Informationen).
    Hinweis: Ausdruck-Bedingungen für eine neue gemeinnützige Konstruktion müssen durch den Experimentator optimiert werden.
  6. Übertragen die Bakterienkultur aus der Flasche in eine 1 L-Flasche Zentrifugation und pellet-Zellen bei 5.000 X g bei 4 ° C für 45 min. Dekantieren des Überstandes und weiter mit der Reinigung.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier durch die Speicherung der bakteriellen Pellets bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit pausiert werden. Das Pellet für LHKW-APEX2 oder LHKW-mCherry ist in der Regel bräunlich (wegen der eingebauten Häm) oder rosa, beziehungsweise.

3. Reinigung von funktionalisierten Nanobodies

  1. Falls erforderlich, tauen die gefrorenen bakterielle Pellet auf Eis (siehe auch Punkt 2.6).
  2. Die Bakterienzelle Pellet 30 mL eiskaltes Bindung Puffer (20 mM Imidazol in 1 X PBS) hinzu und Aufschwemmen durch Pipettieren rauf und runter. Übertragen Sie resuspendierte Bakterien in einer beschrifteten 50 mL-Tube.
  3. Ergänzung die Bindung 30 mL Puffer mit 200 µg/mL Lysozym, 20 µg/mL DNase I, 1 mM MgCl2 und 1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) und inkubieren Sie zunächst für 10 min bei RT, und dann für 1 h bei 4 ° C auf eine durchgängige über Shaker.
  4. Mechanisch lösen Sie bakterielle Zellen in ein 50 mL-Tube indem man einen Tipp Sonikator in die Suspension. Gelten Sie konstante 3 x 1 min. Impulse mit 1 min kühlen Perioden dazwischen.
  5. Zentrifugieren Sie die bakterielle lysate bei 15.000 X g bei 4 ° C für 45 min. zu den Schutt und intakte Zellen Pellets. Transfer der beschallten bakteriellen Zelle lysate entweder in eine geeignete Zentrifugation Flasche für Zentrifugation oder in mehreren 5 mL Röhrchen für Tabletop Zentrifugation der lysate unterteilen.
  6. Den Überstand in ein neues 50 mL Röhrchen zu übertragen und gebeizte Schutt entsorgen.
  7. Speichern der geräumten lysate auf Eis während der Vorbereitung Reinigung von immobilisierten Metall Affinitätschromatographie (IMAC). Histidin-markierten funktionalisierten Nanobodies isolieren, beschäftigen Einweg-Kolumnen (siehe Tabelle der Materialien) ermöglicht schnelle und einfache Schwerkraftfluss Reinigung.
    Hinweis: Alternativ kann auch Batch Reinigung anstelle von kommerziellen Spalten verwendet werden.
  8. Seine Kolumnen auf ein Metall-Ständer montieren.
    1. Verjüngen sich die Spalten-Storage-Lösung, und equilibrate seine Spalte mit 10 mL der Bindung Puffer (20 mM Imidazol mit 1 X PBS-Puffer).
    2. Leer durch Schwerkraft (Flow-through kann weggeworfen werden).
  9. Laden Sie allmählich die geräumte bakterielle lysate (~ 30 mL) auf die Säule. Leer durch Schwerkraft (Flow-through kann weggeworfen werden).
  10. Waschen Sie die seine Spalte 2 X mit 10 mL der Bindung Puffer (20 mM Imidazol mit 1 X PBS-Puffer).
  11. Eluieren Sie Nanobodies mit 2 mL Elution Buffer (500 mM Imidazol mit 1 X PBS-Puffer) in eine 2 mL-Tube und wenden Sie einen Buffer Tausch.
  12. Buffer Tausch.
    1. Eine Entsalzung Equilibrate Stütze (siehe Tabelle der Materialien) in einem 50 mL Tube Spalte Adapter 5 x mit 5 mL 1 X PBS platziert.
    2. Lassen Sie den Puffer, die das verpackte Bett geben. Entsorgen Sie den Durchfluss.
    3. Nach der fünften PBS Gleichgewichtherstellung spin der Spalte bei 1.000 X g 2 min. lang.
    4. Entsorgen Sie den Durchfluss.
    5. Setzen Sie die Säule mit dem Adapter auf eine neue 50 mL Tube. Laden Sie die 2 mL eluierten funktionalisierten gemeinnützige (aus Schritt 3.11) auf den PBS-equilibriert Entsalzung Spalte und Spin bei 1.000 X g für 2 min und sammeln Sie das Eluat zu.
      Hinweis: Anstelle von kommerziellen Entsalzung Spalten kann Dialyse angewendet werden, um Puffer Zusammensetzung auszutauschen.
  13. Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins (gemeinnützige) der das Eluat mit Hilfe der Bicinchoninic (BCA) oder Bradford-Test nach den Anweisungen des Herstellers.
    Hinweis: Für gemeinnützige Aufnahme Assays von GFP-Reporter-Zell-Linien ist eine Lager Konzentration von 2-10 mg/mL optimal.

4. Überprüfung der funktionalisierten gemeinnützige Ausdruck (Coomassie-Färbung)

  1. Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Standardprotokollen 10-12,5 % Gele vorbereiten.
    Hinweis: Alternativ können Sie im Handel erhältlichen Betonfertigteile gradient Gele.
  2. Pipettieren 20 µg des gereinigten funktionalisierten gemeinnützige in einen 1,5 mL-Tube und in Probenpuffer bei 95 ° C für 5 min kochen.
    Hinweis: Als Beispiel fügen Sie 10 µL der Stammlösung eine 2 mg/mL gemeinnützige in ein 1,5 mL Röhrchen mit 10 µL 2 X Probenpuffer. Wenn das Volumen zu klein ist, verdünnen Sie weiter gemeinnützige mit PBS-Puffer vor dem Probenpuffer hinzufügen.
  3. Laden Sie die gereinigten gemeinnützige in Probenpuffer auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel gekocht und nach dem Standardprotokoll Seite ausgeführt, bis der Referenz-Farbstoff (z. B. Bromophenol blue) das Ende des trennenden Gels, gefolgt von Coomassie-Färbung erreicht hat und entfärben.
  4. Coomassie Gel färben und entfärben.
    1. Das Gel uncast und färben Sie es mit Coomassie Färbelösung (5 % 10 g/l Coomassie-Stammlösung 10 % Essigsäure und 45 % Methanol in DdH2O) für 20-30 min bei RT auf einer sich bewegenden Plattform schütteln. Das Gel sollte vollständig in der Färbelösung abgedeckt werden.
    2. Destain das Gel 2 - 3 Mal mit destain Lösung (7,5 % Essigsäure und 15 % Methanol in DdH2O) für 1 h bei RT, vor der Abreise des Gels O/N nach weiteren entfärben.
      Hinweis: Überschuss Coomassie kann effizient aufgesogen werden indem man Papier Küchentücher um das Gel.
  5. Bild das Gel mit einem Imager oder Kamera der Wahl.
    Hinweis: Gemeinnützige Ausdruck kann weiter validiert werden, durch Immunoblot Analyse mit Antikörpern, die Ausrichtung ihrer Epitope (siehe auch Abb. 1A).

5. Aufnahme von funktionalisierten Nanobodies von kultivierten Zellen für Fluoreszenz-Färbung

  1. In einer Zelle Kultur Kapuze, Samen ~ 400.000 bis 500.000 HeLa-Zellen stabil mit dem Ausdruck ein Protein GFP-Tags Reporter auf 18 mm Glasdeckgläser (Nr. 1.5 H) in 35-mm-Gerichte oder 6-Well-Cluster mit kompletten Antibiotika (Dulbeccos geändert Eagle Medium, DMEM-haltigem medium ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 100 Einheiten/mL Streptomycin, 2 mM l-Glutamin und Puromycin 1,5 µg/mL).
    Hinweis: Hier verwenden wir HeLa-Zellen stabil EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR und TfR-EGFP zur Veranschaulichung auszudrücken. Neben der stabilen Zelllinien können auch vorübergehend transfizierte HeLa-Zellen verwendet werden. Stabilen Zelllinien können bei diesem Schritt mit elterlichen nicht ausgestrahlt HeLa-Zellen, zum direkten Vergleich nebeneinander angebaut werden.
  2. Inkubieren Sie die Zellen O/N bei 37 ° C in einem 7,5 % CO2 Inkubator zu vermehren.
    Hinweis: Zellen sollten eine Konfluenz von ~ 80 % am nächsten Tag haben.
  3. Pipettieren 2 µL einer 2 mg/mL gemeinnützige Vorratslösung in ein 15 oder 50 mL Röhrchen mit 2 mL des kompletten Medium (dieses Volumen ist ausreichend zu decken, ein 35 mm-Gericht oder einen Brunnen eines 6-Well-Clusters, die Lautstärke des Mediums und gemeinnützige proportional zu mehr Zelle Kultur d gehören nen oder Cluster).
    Hinweis: Zur Veranschaulichung verwenden wir hier LHKW-mCherry, da keine weitere Antikörper Färbung erforderlich ist, um gemeinnützige verinnerlicht durch die EGFP Reporter (siehe Abbildung 2) zu sehen.
  4. Entfernen Sie Wachstumsmedium aus den Zellen zu und 2 mL vorgewärmte komplette Speichermedium mit 2 µg/mL funktionalisiert gemeinnützige pro 35 Millimeter-Teller oder 6-Well-Einheit.
  5. Inkubieren Sie die Zellen für 1 h bei 37 ° C in einem 7,5 % CO2 Inkubator gemeinnützige Reporter-vermittelte Aufnahme zu ermöglichen.
    Hinweis: Abhängig von der geplanten Versuch muss die Zeit der gemeinnützige Aufnahme angepasst werden. Für das hier gezeigte Experiment ist 1 h ausreichend, stationäre gemeinnützige Aufnahme durch EGFP-CDMPR und TfR-EGFP erreichen.
  6. Entfernen Sie das Medium zu und waschen Sie die Zellen 2 bis 3 Mal mit 1 mL 1 X PBS bei RT
  7. Befestigen Sie die Zellen mit 1 mL 3 % Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei RT
  8. PFA-Lösung entfernen und verbleibende Fixativ mit 1 mL 50 mM NH4Cl in 1 X PBS für 5 min bei RT zu stillen
    Hinweis: 3 % PFA separat als Fixativ Abfall entsorgt werden.
  9. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit 1 mL 1 X PBS bei RT
  10. Permeabilize der Zellen mit 1 mL 0,1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer für 10 min bei RT
    Hinweis: Obwohl keine Permeabilisierung erforderlich ist, ist EGFP und mCherry Fluoreszenz besser, wenn danach die Zellen in Eindeckmedium eingebettet sind.
  11. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit 1 mL 1 X PBS bei RT
  12. Legen Sie die Deckgläsern mit der Pinzette auf einem Tropfen (~ 100 µL) von 1 % BSA mit 1 X PBS-Puffer mit 5 µg/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole) für 5 min bei RT
  13. Legen Sie die Deckgläsern zurück in die Schüssel/Brunnen und waschen Sie 3 Mal mit 1 mL 1 X PBS bei RT
  14. Beschriften Sie die Glas-Objektträger und montieren Sie die Zellen mit Fluoromount-G. Lassen Sie das Eindeckmittel verhärten im Dunkeln für 3-4 h und Speichern der Glasplatten bei 4 ° C unter Lichtschutz.
  15. Bild Muster unter Verwendung eines Mikroskops Wahl (z. B. Punkt Scannen Confocal Mikroskop aufrecht) Färbung.

(6) Aufnahme von funktionalisierten Nanobodies von kultivierten Zellen (für Sulfatierung Analyse)

  1. Samen Sie in einer Zelle Kultur Kapuze ~ 400.000 bis 500.000 HeLa-Zellen stabil mit dem Ausdruck ein GLP-Tags Reporter Protein in 35 mm Schalen oder auf 6-Well-Clustern mit komplette mittlere mit Antibiotika (Dulbeccos geändert Eagle Medium, DMEM mit 10 % fetalen Kalb ergänzt Serum (FCS), 100 Einheiten/mL Streptomycin, 2 mM l-Glutamin und Puromycin 1,5 µg/mL).
    Hinweis: Wie bereits erwähnt, verwenden wir hier HeLa-Zellen stabil EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR und TfR-EGFP zur Veranschaulichung auszudrücken. Neben der stabilen Zelllinien kann auch vorübergehend transfizierten HeLa verwendet werden.
  2. Inkubieren Sie die Zellen O/N bei 37 ° C in einem 7,5 % CO2 Inkubator zu vermehren.
    Hinweis: Zellen sollten eine Konfluenz von ~ 80 % nächsten Tag haben.
  3. Entfernen Sie das komplette Medium zu, waschen Sie 2 Mal mit 1 X PBS bei RT und verhungern Sie die Zellen mit sulfatfrei Medium (SFM) für 1 h bei 37 ° C in einem 7,5 % CO2 Inkubator.
    Hinweis: SFM ist vorbereitet, indem man 10 mL MEM Aminosäuren (50 X) Lösung, L-Glutamin (200 mM), 5 mL Vitamin-Lösung (100 X) und 900 µL CaCl2·2H2O 5 mL bis 500 mL des Adlers ausgewogene Salze. 0,22 µm Filter und aliquoten durchlaufen.
  4. Bereiten Sie in einem belüfteten Haube oder Bank für Radioaktivität Arbeit bezeichnet Sulfat Kennzeichnung 0,5 mCi/mL [35S] Sulfat als Natriumsalz in SFM-haltigem Medium.
    Vorsicht: Handhaben Sie alle Lösungen mit Radioaktivität mit Vorsicht. Arbeiten Sie nur in ausgewiesenen Hauben oder Bänke. Alle Material (Tipps, Rohre, Platten, etc.) oder waschen Puffer in Kontakt mit Radioaktivität müssen gesammelt und gesondert entsorgt werden. Dies gilt für alle Schritte unten (Schritt 6.5-6.20) sowie.
  5. Fügen Sie LHKW-2xTS in 1 X PBS in Sulfat Kennzeichnung Medium, eine Endkonzentration von 2 µg/mL.
    Hinweis: Als Kontrolle auch schließen Sie LHKW-std oder eine andere gemeinnützige frei von TS-Websites, um spezifische Kennzeichnung zu demonstrieren ein.
  6. Ersetzen Sie SFM von 0,7 mL Sulfat Kennzeichnung mittlere enthält 0,5 mCi/mL [35S] Sulfat und 2 µg/mL LHKW-2xTS und inkubieren Sie die Zellen für 1 h bei 37 ° C in einem 7,5 % CO2 Inkubator für die Arbeit mit Radioaktivität bezeichnet.
    Hinweis: Abhängig von der geplanten Versuch muss die Zeit der gemeinnützige Sulfatierung angepasst werden. Darüber hinaus ermitteln, TGN Ankunft Kinetik, Kennzeichnung für die verschiedenen Zeiten (z. B. 10 min, 20 min, 30 min) erfolgt.
  7. Entfernen Sie die Kennzeichnung Medium und waschen Sie die Zellen 2 bis 3 Mal mit eiskalten 1 X PBS auf einer Kühlplatte oder Eis.
  8. Fügen Sie 1 mL Lyse-Puffer (PBS mit 1 % Triton x-100 und 0,5 % Deoxycholate) mit 2 mM PMSF und 1 x cocktail-Proteasehemmer ergänzt und inkubieren die Zellen für 10-15 min auf einem schaukelnden Plattform bei 4 ° c
  9. Kratzen und übertragen die lysate in ein 1,5 mL Röhrchen, Vortex lysate, und Platz für 10-15 min auf eine durchgängige über Rotator bei 4 ° C.
  10. Bereiten Sie eine postnukleare lysate durch Zentrifugation bei 10.000 X g für 10 min bei 4 ° C.
  11. Mit einem neuen 1,5 mL-Tube, bereiten Sie 20-30 µL einer Aufschlämmung von Nickel Perlen in einem 1,5 mL Röhrchen und einmal mit 1 X PBS waschen Sie, indem sie sanft bei 1.000 X g für 1 min Pelletierung.
    Hinweis: Anstelle von Nickel können Perlen, Perlen Streptavidin (wenn gemeinnützige biotinylierte ist) oder Protein A Perlen mit einer IgG gegen ein Epitop gemeinnützige (T7 oder HA-Tag) verwendet werden.
  12. Übertragen die postnukleare lysate in ein 1,5 mL Röhrchen mit Nickel Perlen und inkubieren Sie für 1 h bei 4 ° C auf eine durchgängige über Rotator, die Nanobodies zu isolieren. Entfernen Sie eine aliquote (50-100 µL) der die postnukleare lysate und Kochen im SDS-Probenpuffer für nachfolgende Immunoblot Analyse der gesamten Zelle verbunden gemeinnützige, GFP-Reporter und Ladekontrolle.
  13. Waschen Sie die Perlen 3 Mal mit 1 x PBS oder Lyse Puffer von sanft bei 1.000 X g für 1 min Pelletierung.
    Hinweis: Für strengere Waschen von Perlen, kann 20 mM Imidazol in PBS oder Lyse Puffer aufgenommen werden.
  14. Sorgfältig entfernen Sie alle waschen Puffer aus Perlen, 50 µL 2 x Probenpuffer hinzufügen und kochen für 5 min bei 95 ° C.
  15. Laden beide gekocht Perlen auf einem Midi 12,5 % SDS-PAGE gel und nach dem Standardprotokoll Seite ausgeführt, bis der Referenz-Farbstoff (z. B. Bromophenol blue) das Ende des trennenden Gels erreicht hat.
    Hinweis: Immunoblot Analyse der gesamten Zelle verbunden gemeinnützige, GFP-Reporter und Ladekontrolle kann auch durchgeführt werden, mit einem Mini-12,5 % SDS-PAGE oder Betonfertigteilen gradient Gel.
  16. Fixieren Sie das Trennende Gel in ~ 30 mL Fixierung-Puffer (10 % Essigsäure und 45 % Methanol in DdH2O) für 1 h bei RT, waschen Sie das Gel dreimal mit ~ 50 mL entionisiertem Wasser und bereiten für Gel trocknen.
  17. SDS-PAGE Gelen trocknen.
    1. Vorsichtig gestreckt Klarsichtfolie setzen Sie feste Gel auf und bedecken Sie es mit vorgeschnittene Filterpapier.
    2. Legen Sie das Gel mit dem Filterpapier nach unten auf die Trocknung Plattform, Vakuum Deckel und schalten Sie die Vakuumpumpe zum Gel trocknen. Trocknen Sie das Gel für 3-5 h.
    3. Entfernen Sie die Klarsichtfolie und die getrockneten Gel in einer Autoradiographie Kassette mit einem Phosphor-Bildschirm ausgestattet.
  18. Bild Autoradiograph mit einer Phosphor-Bildschirm-Imager. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
    Hinweis: Abhängig von der Stärke des Signals getrocknet Gele müssen mit Phosphor-Bildschirme mehr ausgesetzt werden.

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Ergebnisse

Um retrograde Protein Transport zu verschiedenen intrazellulären Destinationen zu untersuchen, haben wir vor kurzem etabliert, ein Anti-GFP gemeinnützige-basiertes Tool zum Beschriften und rekombinanten Fusionsproteinen aus der Zelle Oberfläche30folgen. Hier zeigen wir die bakterielle Produktion solcher Nanobodies derivatisiert und demonstrieren ihre Anwendung endocytic Aufnahme durch Fluoreszenz-Mikroskopie sowie Immunoblotting und deren Einsatz zur TGN Ankunft...

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Diskussion

Nanobodies repräsentieren eine neue Klasse von Protein Bindemittel Gerüsten mit viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Antikörper: sie sind klein, stabil, Monomere, kann ausgewählt werden, denn hohe Affinität und fehlende Disulfid33,35, Anleihen 44 , 45. sie dienen in einer Reihe von Anwendungen, wie z. B. in Zellkultursystemen und Organismen in der Entwicklungsbiologie...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von Grant 31003A-162643 durch den Schweizerischen Nationalfonds unterstützt. Wir danken Nicole Beuret und das Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) für die Unterstützung.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GFP antibodySigma-Aldrich118144600001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibodyBethyl LaboratoriesA190-114A
Anti-actin antibodyEMD MilliporeMAB1501
Goat anti-rabbit HRPSigma-AldrichA-0545
Goat anti-mouse HRPSigma-AldrichA-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)ApplichemA3672
D-biotinSigma-AldrichB4501dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochlorideSigma-AldrichA3785dissolved in sterile water
DNase IApplichemA3778dissolved in sterile water
LysozymeSigma-Aldrich18037059001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA)Sigma-AldrichB5936
PuromycinInvivogenant-pr-1
Penicillin/StreptomycinBioconcept4-01F00-H
L-glutamineApplichemA3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Fetal calf serum (FCS)BiowestS181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfateHartmann AnalyticsARS0105Product contains 5 mCi
Earle's balanced saltsSigma-AldrichE6267
MEM amino acids (50x) solutionSigma-AldrichM5550
MEM vitamin solution (100x)Sigma-AldrichM6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836153001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)ApplichemA1008dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium saltApplichemA1491dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfateApplichemA1493dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue)Sigma-AldrichB-0149
Paraformaldehyde (PFA)ApplichemA3813
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Ni Sepharose High PerformanceGE Healthcare17-5268-01
His GraviTrap columnsGE HealthcareGE11-0033-99
His buffer kitGE HealthcareGE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columnsGE HealthcareGE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-wellBio-Rad456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
35 mm dishesFalcon353001
6-well platesTPP92406
Glass coverslips (No. 1.5H)VWR631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)ApplichemA0999.0025dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
TryptoneApplichemA1553
Yeast extractApplichemA1552
Magnesium chloride hexahydrateMerck Millipore105833dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrateMerck Millipore102382dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chlorideMerck Millipore106404dissolved in sterile water, stock is 5 M

Referenzen

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