JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Ретроградная транспорт белков от поверхности клетки Golgi имеет важное значение для поддержания гомеостаза мембраны. Здесь мы описываем метод биохимически анализа клеток поверхности Гольджи транспорта рекомбинантных белков с помощью функционализированных nanobodies в клетки HeLa.

Аннотация

Транспорт белков и мембран от поверхности клетки Golgi и за ее пределами имеет важное значение для гомеостаза, органелл идентичности и физиологии. Для изучения движение ретроградное белка, мы недавно разработали универсальный инструментарий на основе наночастицы для анализа транспорта от поверхности клеток Гольджи комплекс, либо по фиксированной и живой клетки изображений, электронной микроскопии, или биохимически. Мы инженерии функционализированных анти Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) nanobodies — маленький, мономерных, высокоспецифичных белка связующих — которые могут применяться для клеточных линий, выражая мембранных белков интерес с внеклеточного GFP остаток. Дериватные nanobodies привязан к журналистам GFP конкретно учитываются и транспортируется контрейлерных перевозок по маршрутам сортировки журналистов. Nanobodies были функционализированных с флуорофоров следуют микроскопии флуоресцирования Ретроградная транспорта и жить изображений, с аскорбатпероксидазы 2 (APEX2) расследовать ультраструктурных локализации репортер наночастицы комплексов электрона микроскопия и с сульфатация (TS) мотивы тирозин оценить кинетику транс Гольджи сети (TGN) прибытия. В этом методологические статьи мы приводим общие процедуры бактериально Экспресс и очистить функционализированных nanobodies. Мы иллюстрируем мощный использование нашего инструмента, с помощью nanobodies mCherry-TS-изменены и анализировать endocytic поглощения и TGN прибытия грузов белков.

Введение

Ретроградное движение белков и липидов из клеточной поверхности различных внутриклеточных отделений имеет решающее значение для поддержания гомеостаза мембраны в противовес секрецию и перерабатывать компоненты антероградная транспортных механизмов1 , 2. После интернализации через Клатрин зависимые или - независимые эндоцитоза, белков и липидов грузов сначала заполнить рано endosomes от где они дальнейшее перенаправление либо вдоль Эндо лизосомальных системы, переработанных в плазматической мембране, или для транс Гольджи сети (TGN). Рециркуляции из endosomes и/или поверхности клетки к TGN является частью функциональной цикла количество рецепторов антероградная трансмембранного груза, например катион зависимых и катион независимые рецепторы маннозы-6-фосфат (CDMPR и CIMPR) доставки недавно синтезированных лизосомальных гидролаз в конце endosomes и лизосом3,4,5, sortilin и SorLA6,7и Wntless (WLS) транспортировки Wnt лигандов на поверхности клеток от TGN 8 , 9 , 10 , 11. другие белки, полученные обратно к TGN являются TGN46 и ее смежных изоформ12,13,14, сковывания (растворимые N- ethylmaleimide-чувствительных фьюжн фактор вложение рецепторы) 15 , 16 , 17, амилоида прекурсоров протеина (APP)18,19, прогрессивный Анкилоз (АНК) белка20, металла перевозчиков например ATP7A/B или DMT121,22и трансмембранного переработки ферментов, включая Карбоксипептидаза D, Фурин или BACE123,24,25. Помимо этих эндогенных белков завод и бактериальные токсины (например, Сига и холера токсин, рицин и Абрин) угона Ретроградная транспортных механизмов для достижения ER для retrotranslocation в цитозоль26,27, 28,29.

Для того, чтобы непосредственно анализировать ретроградного движения, мы разработали ранее на основе наночастицы Инструментарий ярлык и следовать груз белки от поверхности клетки внутриклеточных отсеков30. Nanobodies представляют собой новое семейство белков вяжущих материалов, полученных от м.в тяжелые цепи только-антител (hcAbs) естественно возникающие в верблюдовых и хрящевых рыб31,32. Они представляют собой переменной домена тяжелых цепей (VHH) hcAbs и имеют много преимуществ перед обычными антител (например, IgGs): они мономерных, малые (~ 15 кДа), высоки soluble, лишенный дисульфидными облигаций, может быть бактериально выражена и для Высокоспецифичные связывающие33,34,35,36. Чтобы сделать наш инструмент наночастицы, универсальным и широко применимые, мы заняты функционализированных анти GFP nanobodies поверхность лейбл и трек белки, отмеченных GFP в их lumenal/внеклеточного домена. Функционализация nanobodies с mCherry, аскорбатпероксидазы 2 (APEX2)37, или сульфатация (TS) последовательности тирозин, ретроградная транспорта bonafide трансмембранного грузов белков может быть проанализирован либо фиксированной и жить клеток изображений, Электронная микроскопия, или биохимически. Поскольку сульфатация тирозина, опосредовано tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 и TPST2) является Посттрансляционная модификация ограничивается транс Гольджи/TGN, мы можем непосредственно изучать транспорта и кинетика протеинов интереса от поверхности клетки к этому внутриклеточных Гольджи отсека38,,3940.

В этой статье методы мы описываем простота производства функционализированных nanobodies (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry и производные) подходит для ряда приложений для анализа Ретроградная транспорт в mammalian клетках30. Мы главным образом сосредоточиться на использовании TS сайт изменен наночастицы для анализа внутриклеточных трафика от поверхности клетки в отделение сульфатация.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. бактериальные преобразование с функционализированных Nanobodies

Примечание: Этот протокол был оптимизирован для выражения, очистки и анализа функционализированных анти GFP nanobodies как описано30. Деривации с другими белками постановление могут потребовать изменения это стандартный протокол.

  1. Размораживание chemocompetent бактерий (~ 100 мкл) подходит для выражения протеина (например, Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) клетки), поместив их на льду.
    Примечание: Подготовка chemocompetent бактериальной клетки согласно стандартных лабораторных процедур. Кроме того химически компетентным бактериальные клетки могут быть приобретены коммерчески.
  2. Добавьте 50 нг плазмида кодирования функционализированных nanobodies. Чтобы разрешить достаточным участкам biotinylation репортер наночастицы при бактериальных выражение, также добавить три избыток (150 нг) бактериальной выражение плазмидной кодирования биотина лигаза Бира (см. также таблицу 1 плазмида сведения). Аккуратно накапайте вверх и вниз.
    Примечание: Если наночастицы biotinylation не является необходимым или Репортеры наночастицы лишены биотина акцептора пептид (БАП), Сопредседатель преобразования с плазмида кодирования Бира не требуется.
  3. Инкубируйте бактериальные клетки для 30 мин на льду.
  4. Тепловой шок бактериальные клетки, поместив их в течение 1 мин при 42 ° C в водяной бане или Отопление блока.
  5. Добавьте 1 mL комнатной температуры (RT) Лурия бульон (LB) среднего и инкубировать преобразованные бактерий в греющую за 1 ч при 37 ° C разрешить фенотипические экспрессии генов сопротивления. Подготовить 1 Л LB средних, баланс 5 г дрожжей экстракт, 10 g Триптон и 10 г NaCl, залейте водой и стерилизация автоклавированием. Если функционализированных наночастицы были subcloned в вектора выражения, содержащие сопротивление ампициллин/carbenicillin, шаг 1.5 может быть опущен.
  6. Пелле бактерий на 11000 x g за 1 мин и Ресуспензируйте в 100 мкл свежие LB среды.
  7. Плиты подвесные бактерии на ФУНТ пластин, содержащие соответствующие антибиотики (например, с 50 мкг/мл канамицин и 50 мкг/мл carbenicillin, когда бактерии были совместно превращается с репортером наночастицы и бира, как указано выше (шаг 1.2)).
  8. Поместите пластины для LB в инкубаторе при 37 ° C и пусть растут на ночь (O/N).
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь, сохраняя LB пластины с выросли колонии при 4 ° C. Использование парафина для уплотнения фунтов пластин.

2. бактериальных культур в жидкой среде и индукции функционализированных наночастицы выражения

  1. Выберите бактериальные колонии, содержащий вектор интересов от плиты и пусть растут в колбе, содержащий 20 мл среды LB дополнена O/N антибиотиков в трястия инкубатора при 37 ° C (см. также шаг 1.7 относительно выделения антибиотиков).
  2. Следующий день, разбавляют выросли 20 мл бактериальной культуры во флакон, содержащий 1 Л LB среды с выбор антибиотиков.
  3. Продолжать инкубировать бактериальной культуры при 37 ° C, пока достигнет ОД600 0,6-0,7. Разрешить культуры остыть до RT перед вызывая выражения протеина.
  4. Побудить выражение протеина функционализированных nanobodies и бира путем добавления 1 мл 1 М изопропил β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) до конечной концентрации 1 мм индуктором (1:1, 000 разрежения). Также добавьте 10 мл раствора 20 мм d биотина запасов привело 200 мкм d биотина в среднего роста позволяют biotinylation epitope БАП в функционализированных nanobodies (см. также таблицу 1 плазмида сведения)
    Примечание: D биотина Стоковый раствор готовится ddH2O и принес в раствор drop-wise добавлением 500 мм NaH2PO4. Кроме того d биотина, также могут быть распущены в ДМСО. Для производства nanobodies сливается с APEX2 (VHH-APEX2), средний LB должна дополняться Кроме 1 мм 5-аминолевулиновой кислоты (dALA) гидрохлорида содействовать включению гема. dALA готовится как Стоковый раствор 100 мм в ddH2O.
  5. Инкубировать IPTG-индуцированной 1 Л бактериальной культуры при 30 ° C на 4 ч для VHH-2xTS, на 20 ° C или RT O/N за VHH-APEX2 или на 16 ° C O/N за VHH-mCherry (см. также таблицу 1 плазмида сведения).
    Примечание: Выражение условия для новой конструкции наночастицы должны быть оптимизированы, экспериментатора.
  6. Передача бактериальной культуры от колбу в 1 Л бутылку центрифугирования и Пелле клетки на 5000 x g при 4 ° C на 45 мин Decant супернатант и продолжать с очистки.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь путем сохранения бактериальных Пелле-80 ° c на неопределенный срок. Пелле VHH-APEX2 или VHH-mCherry обычно коричневатые (благодаря встроенным гема) или розовый, соответственно.

3. Очистка функционализированных Nanobodies

  1. При необходимости, оттепель замороженных бактериальных гранул на льду (см. также шаг 2.6).
  2. Добавить 30 мл ледяной привязки буфера (20 мм имидазола в однократном ПБС) в бактериальной клетке гранулы и Ресуспензируйте, закупорить вверх и вниз. Передача ресуспензированы бактерий в обозначенные 50 мл трубки.
  3. Дополнение привязки 30 мл буфера с 200 мкг/мл лизоцима, 20 мкг/мл DNase I, 1 мм MgCl2 и 1 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF) и инкубировать впервые за 10 мин на RT и затем за 1 час при 4 ° C на конце над конец шейкер.
  4. Механически лизируют бактериальные клетки в 50 мл трубки, поместив кончик sonicator в подвеска. Примените постоянные 3 x 1 мин импульсов с 1 мин охлаждения периоды между ними.
  5. Центрифуга lysate на 15000 x g при 4 ° C на 45 мин для пеллет от мусора и нетронутым клеток бактерий. Передача sonicated бактериальной клетке lysate либо в соответствующей центрифугирования бутылку для центрифугирования или lysate разделить несколько 5 мл трубки для настольной центрифуги.
  6. Перевести супернатант в новой 50 мл трубки и отбросить гранулированных мусора.
  7. Хранить очищенные lysate на льду при подготовке очистки на иммобилизованных металла аффинной хроматографии (ИАЦ). Чтобы изолировать гистидин тегами функционализированных nanobodies, используют одноразовые его столбцы (см. Таблицу материалов) позволяет быстро и просто гравитации потока очистки.
    Примечание: Кроме того пакет очистки вместо коммерческой столбцов может использоваться также.
  8. Установка его столбцы в металическая подставка.
    1. Сокращаться столбцы для хранения решения и сбалансировать его столбец с 10 мл привязки буфера (20 мм имидазола в однократном ПБС).
    2. Пустой, самотечный поток (поток через может быть удален).
  9. Постепенно Загрузите очищается бактериальных lysate (~ 30 мл) на столбец. Пустой, самотечный поток (поток через может быть удален).
  10. Мыть его колонка 2 x 10 мл привязки буфера (20 мм имидазола в однократном ПБС).
  11. Элюировать nanobodies с 2 мл буфера (500 мм имидазола в ПБС) в 2-мл пробирку и применить буфер обмена.
  12. Буфер обмена.
    1. Сбалансировать обессоливания столбец (см. Таблицу материалы) помещены в 50 мл трубки Колоночный адаптер 5 раз с 5 мл ПБС.
    2. Разрешить буфер для ввода Упакованные кровати. Отказаться от потока через.
    3. После пятого уравновешивания PBS спина столбца на 1000 x g на 2 мин.
    4. Отказаться от потока через.
    5. Место столбец с адаптером на новый Тюбик 50 мл. Загрузить по 2 мл eluted функционализированных наночастицы (от шага 3.11) на достижение равновесного уровня PBS опреснительной столбец и спина на 1000 x g на 2 мин и собирать элюата.
      Примечание: Вместо коммерческих опреснительной столбцов диализа может применяться для обмена буфера композиции.
  13. Определите концентрацию белка (наночастицы) элюата, используя bicinchoninic (BCA) или assay Брадфорд согласно инструкциям производителя.
    Примечание: Для анализов поглощение наночастицы, GFP репортер клеточных линий запасов концентрация 2-10 мг/мл является оптимальным.

4. Проверка функционализированных наночастицы выражения (Окрашивание Кумасси)

  1. Подготовка 10-12,5% гели натрия Додециловый сульфат полиакриламидных гель-электрофорез (SDS-PAGE) согласно стандартных протоколов.
    Примечание: Кроме того использование коммерчески доступных сборного градиента гели.
  2. Накапайте 20 мкг очищенного функционализированных наночастицы в 1,5 мл трубки и варить в буфер образца на 95 ° C за 5 мин.
    Примечание: В качестве примера добавьте 10 мкл раствора штока 2 мг/мл наночастицы в 1,5 мл трубку с 10 мкл 2 x пример буфера. Если объем слишком мал, дальнейшего разбавления наночастицы в PBS перед добавлением буфер образца.
  3. Загрузить очищенный наночастицы, сваренный в буфер образца на SDS-Полиакриламид-гель и запустить по стандартному протоколу страницы до тех пор, пока краска ссылка (например, бромфеноловый синий) достиг конца отделяя гель, а затем Окрашивание Кумасси и минигелей.
  4. Кумасси гель окрашивание и минигелей.
    1. Uncast гель и пятна с Кумасси окрашивание раствора (5% 10 г/л Кумасси Стоковый раствор в 10% уксусной кислоты и 45% метанола в ddH2O) для 20-30 мин в РТ на движущейся платформе встряхивания. Геля должны быть полностью покрыты окрашивание раствора.
    2. Отмойте гель 2 - 3 раза с Отмойте решение (7,5% уксусной кислоты и 15% метанола в ddH2O) за 1 ч на RT, прежде чем покинуть гель O/N для дальнейшего минигелей.
      Примечание: Избыток Кумасси может быть эффективно всасывается, поместив Кухонные бумажные полотенца вокруг геля.
  5. Гель с помощью формирователя изображений или камеры выбора изображения.
    Примечание: Наночастицы выражение может быть также проверен immunoblot анализ с использованием антител против его эпитопам (см. также рис. 1A).

5. усвоение функционализированных Nanobodies культивируемых клеток для флуоресценции пятнать

  1. В капюшоне культуры клетки, клетки HeLa семян ~ 400 000 до 500 000, стабильно выражая белка GFP-тегами репортер на coverslips (№ 1,5 H) стекла 18-мм в 35-мм блюда или 6-ну кластеров с полного среднего, содержащие антибиотики (Дульбекко изменение орел средняя, DMEM с 10% плода телячьей сыворотки (FCS), 100 единиц/мл стрептомицина, 2 мм l глютамина и puromycin 1,5 мкг/мл).
    Примечание: Здесь мы используем клетки HeLa, стабильно выражая EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR и СКР-EGFP для целей иллюстрации. Отдельно от стабильных клеточных линий может использоваться также временно transfected клеток HeLa. Стабильных клеточных линий может быть совместно культивируемых на этот шаг с родителей не преобразованы НеЬа клетки, для прямого сравнения.
  2. Инкубируйте клетки O/N при 37 ° C в 7,5% CO2 инкубатора размножаться.
    Примечание: Клетки должны иметь confluency ~ 80% на следующий день.
  3. Пипетки 2 мкл наночастицы Стоковый раствор 2 мг/мл в 15 или 50 мл, содержащие 2 мл полного среднего (этот объем является достаточным для покрытия блюдо 35 мм или одной скважиной 6-ну кластера, отрегулировать громкость среднего и наночастицы пропорционально, чтобы включать больше d культуры клетки уменьшает или кластеры).
    Примечание: Для целей иллюстрации мы здесь использовать VHH-mCherry, так как без дальнейших Пятнать антитела требуется чтобы увидеть наночастицы внутреннюю EGFP журналистов (см. рис. 2 c).
  4. Удалите средство роста из клеток и добавить 2 мл подогретую полный носитель, содержащий 2 мкг/мл функционализированных наночастицы за блюдо 35 мм или 6-ну единицу.
  5. Инкубируйте клетки за 1 ч при 37 ° C в 7,5% CO2 инкубатора разрешить поглощение репортер опосредованной наночастицы.
    Примечание: В зависимости от запланированного эксперимента то время наночастицы поглощения необходимо скорректировать. Для эксперимента, показанный здесь достаточно для достижения устойчивого состояния наночастицы поглощения EGFP-CDMPR и СКР-EGFP 1 h.
  6. Удаление среды и вымыть клетки 2 - 3 раза с 1 мл раствора 1 x PBS на RT.
  7. Исправить клеток в 1 мл 3% параформальдегида (PFA) для 10 мин на RT.
  8. Удаление решения PFA и погасить оставшиеся фиксатором с 1 мл 50 мм NH4Cl в ПБС за 5 мин на RT.
    Примечание: 3% PFA должны утилизироваться отдельно как фиксирующие отходов.
  9. Вымыть клетки 3 раза с 1 мл раствора 1 x PBS на RT.
  10. Разрушения клеток в 1 мл 0,1% тритон X-100 в однократном ПБС втечение 10 мин на RT.
    Примечание: Хотя permeabilization не является обязательным, EGFP и mCherry флуоресценции лучше, когда потом клетки внедряются в среде монтажа.
  11. Вымыть клетки 3 раза с 1 мл раствора 1 x PBS на RT.
  12. Место coverslips с щипцами на падение (~ 100 мкл) 1% BSA в ПБС, содержащий 5 мкг/мл DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) за 5 мин на RT.
  13. Место coverslips обратно в блюдо/Ну и мыть 3 раза с 1 мл раствора 1 x PBS на RT.
  14. Ярлык стеклянных скольжениях и смонтировать клетки с Fluoromount-G. Пусть монтажа средних затвердевают в темноте для 3-4 ч и хранить слайды стекла на 4 ° C под охраной света.
  15. Изображение, окрашивание шаблонов с помощью микроскопа выбора (например, точка сканирования Конфокальный микроскоп вертикально).

6. поглощение функционализированных Nanobodies культивируемых клеток (для сульфатация анализа)

  1. В капюшоне культуры клеток семя ~ 400 000 до 500 000 клеток HeLa стабильно выражая белка GFP-тегами репортер блюдах 35 мм или 6-ну кластеров с полной средней содержащих антибиотики (Дульбекко изменение Eagle средний, DMEM, дополнена плода теленка 10% сыворотка (FCS), 100 единиц/мл стрептомицина, 2 мм l глютамина и puromycin 1,5 мкг/мл).
    Примечание: Как упоминалось выше, мы здесь используем клетки HeLa, стабильно выражая EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR и СКР-EGFP для целей иллюстрации. Отдельно от стабильных клеточных линий может использоваться также временно transfected НеЬа.
  2. Инкубируйте клетки O/N при 37 ° C в 7,5% CO2 инкубатора размножаться.
    Примечание: Клетки должны иметь confluency ~ 80% на следующий день.
  3. Удаление полного среднего, мыть 2 раза с ПБС в РТ и голодать клетки с сульфат бесплатно среднего (УЛП) за 1 ч при 37 ° C в 7,5% CO2 инкубатора.
    Примечание: УЛП готовится путем добавления 10 мл раствора (50 x) аминокислоты MEM, L-глютамин (200 мм), 5 мл раствора витамина (100 x) и 900 мкл CaCl2·2H2O 5 мл до 500 мл орла сбалансированных солей. Проходят через 0,22 мкм фильтром и Алиготе.
  4. В вентилированные капюшон или скамейке, предназначенных для работы радиоактивности Подготовьте сульфат маркировки носитель, содержащий сульфат 0,5 mCi/мл [35S] в виде натриевой соли в целях обеспечения УЛП.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Тщательно обработайте все растворы, содержащие радиоактивности. Работают только в назначенный вытяжки или скамейки. Все материалы (советы, трубы, пластины, и т.п.) или мыть буферов при контакте с радиоактивности должны быть собраны и утилизировать отдельно. Сделайте это для всех шагов ниже (шаг 6,5-6.20) также.
  5. Добавьте VHH-2xTS в 1 x PBS в сульфат маркировки среднего до конечной концентрации 2 мкг/мл.
    Примечание: Элемент управления также включайте VHH-std или другой наночастицы лишенный TS сайтов для демонстрации конкретных маркировки.
  6. Заменить УЛП на 0,7 мл сульфата маркировки средних содержащих сульфат 0,5 mCi/мл [35S] и 2 мкг/мл VHH-2xTS и инкубировать клетки за 1 ч при 37 ° C в 7,5% CO2 инкубатора, предназначенных для работы с радиоактивностью.
    Примечание: В зависимости от запланированного эксперимента то время наночастицы сульфатация необходимо скорректировать. Кроме того чтобы определить TGN прибытия кинетики, маркировка выполняется для разное время (например, за 10 мин, 20 мин, 30 мин и т.д.).
  7. Удалите средство маркировки и вымыть клетки 2 - 3 раза с ледяной ПБС на охлаждения пластины или льда.
  8. Добавьте 1 mL буфера lysis (PBS содержащие 1% тритон X-100 и 0,5% Дезоксихолат) с 2 мм PMSF и 1 x ингибитор протеазы коктейль и инкубации клеток для 10-15 мин на качающейся платформе при 4 ° C.
  9. Скрип и передачи lysate в 1,5 мл трубку, вихревой lysate и место для 10-15 мин на конец над конец ротатор при 4 ° C.
  10. Подготовить шпагу lysate центрифугированием на 10000 x g 10 мин при 4 ° C.
  11. С помощью новой 1,5 мл трубки, подготовить 20-30 мкл суспензии бусины никеля в 1,5 мл трубку и мыть раз с ПБС, нежно грануляции их на 1000 x g за 1 мин.
    Примечание: Вместо того чтобы никель может использоваться бусы, стрептавидина бусины (если наночастицы биотинилированным) или протеин A бусины с IgG против epitope наночастицы (T7 - или ха тегов).
  12. Передача шпагу lysate в 1,5 мл трубку содержащие никель бусины и инкубировать 1 час при 4 ° C на конце над конец ротатор изолировать nanobodies. Удаление Алиготе (50-100 мкл) о шпагу lysate и варить в буфер образца SDS для анализа последующих immunoblot всего связанные ячейки наночастицы, репортер GFP и загрузки элемента управления.
  13. Мыть бисер 3 раза с 1 x буфера lysis или PBS, нежно гранулирование на 1000 x g за 1 мин.
    Примечание: Для более строгие стирки бисера, имидазола 20 мм могут быть включены в буфере lysis или PBS.
  14. Тщательно удалить все Отмывающий буфер из бисера, добавьте 50 мкл 2 x буфер образца и варить 5 мин при 95 ° C.
  15. Нагрузки и вареной бусы на midi 12,5% гель SDS-PAGE и запускаться согласно стандартному протоколу страницы до тех пор, пока краска ссылка (например, бромфеноловый синий) достиг конца отделяя гель.
    Примечание: Иммуноблот анализ всего связанные ячейки наночастицы, репортер GFP и контроля загрузки может также выполняться с помощью мини-12,5% SDS-PAGE или сборного градиента гель.
  16. Исправьте отделяя гель в ~ 30 мл фиксации буфера (10% уксусной кислоты и 45% метанола в ddH2O) за 1 ч на RT, Промойте гель три раза с ~ 50 мл деионизированной воды и подготовить для сушки геля.
  17. Сушка гелях SDS-PAGE.
    1. Тщательно место фиксированного гель на натянутой цепляться пленки и накрыть precut фильтр-бумаги.
    2. Поместите гель с фильтровальной бумаги вниз поверх платформы сушки, место вакуумной крышкой и включите вакуумный насос для сушки геля. Сухие гель для 3-5 ч.
    3. Снимите пленку и сушеные гель в кассеты авторадиографии, оснащен экраном фосфора.
  18. Авторадиография изображения с помощью формирователя изображений экрана фосфора. Следуйте инструкциям производителя.
    Примечание: В зависимости от силы сигнала сушеные гели необходимости подвергаться больше с люминофором экранов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Расследовать Ретроградная белков транспорт в различные пункты назначения внутриклеточные, мы недавно создали анти GFP наночастицы-инструмент для обозначения и следовать рекомбинантных синтез белков из клеток поверхности30. Здесь мы демонстрируем бактер?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Nanobodies представляют собой возникающих класса белка связыватель подмости с много преимуществ перед обычными антитела: они небольшие, стабильной, мономерных, может быть выбран для высокое сродство и отсутствие дисульфида облигации33,35, 44...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Грант 31003A-162643, Швейцарский Национальный научный фонд. Мы благодарим, Николь Beuret и Biozentrum Imaging основного фонда (IMCF) для поддержки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GFP antibodySigma-Aldrich118144600001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibodyBethyl LaboratoriesA190-114A
Anti-actin antibodyEMD MilliporeMAB1501
Goat anti-rabbit HRPSigma-AldrichA-0545
Goat anti-mouse HRPSigma-AldrichA-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)ApplichemA3672
D-biotinSigma-AldrichB4501dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochlorideSigma-AldrichA3785dissolved in sterile water
DNase IApplichemA3778dissolved in sterile water
LysozymeSigma-Aldrich18037059001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA)Sigma-AldrichB5936
PuromycinInvivogenant-pr-1
Penicillin/StreptomycinBioconcept4-01F00-H
L-glutamineApplichemA3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Fetal calf serum (FCS)BiowestS181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfateHartmann AnalyticsARS0105Product contains 5 mCi
Earle's balanced saltsSigma-AldrichE6267
MEM amino acids (50x) solutionSigma-AldrichM5550
MEM vitamin solution (100x)Sigma-AldrichM6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836153001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)ApplichemA1008dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium saltApplichemA1491dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfateApplichemA1493dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue)Sigma-AldrichB-0149
Paraformaldehyde (PFA)ApplichemA3813
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Ni Sepharose High PerformanceGE Healthcare17-5268-01
His GraviTrap columnsGE HealthcareGE11-0033-99
His buffer kitGE HealthcareGE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columnsGE HealthcareGE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-wellBio-Rad456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
35 mm dishesFalcon353001
6-well platesTPP92406
Glass coverslips (No. 1.5H)VWR631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)ApplichemA0999.0025dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
TryptoneApplichemA1553
Yeast extractApplichemA1552
Magnesium chloride hexahydrateMerck Millipore105833dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrateMerck Millipore102382dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chlorideMerck Millipore106404dissolved in sterile water, stock is 5 M

Ссылки

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737(2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15 Unit 15 10 (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

144nanobodiesradiolabelingEGFPHeLa

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены