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Résumé

Transport rétrograde des protéines de la surface de la cellule de l’appareil de Golgi est essentielle pour maintenir l’homéostasie de la membrane. Nous décrivons ici une méthode pour analyser biochimiquement transport de surface-à-Golgi cellulaire des protéines recombinantes, nanocorps fonctionnalisés dans les cellules HeLa.

Résumé

Transport des protéines et les membranes de la surface de la cellule à l’appareil de Golgi et au-delà est essentiel pour l’homéostasie, l’identité de l’organite et physiologie. Afin d’étudier les protéines rétrograde trafic, nous avons récemment développé une boîte à outils polyvalent basé sur nanobody pour analyser des transports de la surface cellulaire pour le complexe de Golgi, soit par l’imagerie fixe et de cellules vivantes, en microscopie électronique, ou biochimique. Nous avons conçu le nanocorps fonctionnalisés anti-vert protéine fluorescente (GFP) — reliures petit, monomère, haute affinité des protéines — qui peut être appliqué aux lignées de cellules exprimant des protéines de la membrane d’intérêt avec une portion extracellulaire de GFP. Nanocorps dérivés liés aux reporters GFP sont spécifiquement internalisés et transporté piggyback le long des routes de tri des journalistes. Nanocorps ont été fonctionnalisés avec des fluorophores à suivre le transport rétrograde en microscopie par fluorescence et de vivre l’imagerie, avec peroxydase d’ascorbate 2 (APEX2) pour étudier la localisation ultrastructurale de journaliste-nanobody complexes par les électrons microscopie et avec des motifs de sulfatation (TS) de tyrosine pour évaluer la cinétique d’arrivée du réseau (TGN) trans-Golgi. Dans cet article méthodologique, nous décrivons la procédure générale pour exprimer par les bactéries et de purifier nanocorps fonctionnalisés. Nous illustrons l’utilisation puissante de notre outil à l’aide de la nanocorps mCherry - et TS-modification pour analyser l’absorption endocytose et arrivée de TGN des protéines de la cargaison.

Introduction

Le trafic rétrograde des protéines et des lipides de la surface de la cellule aux différents compartiments intracellulaires est crucial pour le maintien de l’homéostasie de la membrane afin de contrebalancer la sécrétion et de recycler les composants d’antérograde transport machineries1 , 2. après internalisation par endocytose clathrine dépendant ou - indépendant, cargaison de protéines et de lipides commencez par remplir tôt endosomes d'où ils sont encore redirigé soit le long du système endo-lysosomale, recyclé à la membrane plasmique, ou ciblées au réseau trans-Golgi (TGN). Recyclage des endosomes et/ou la surface de la cellule vers le TGN fait partie du cycle fonctionnel d’un certain nombre de récepteurs transmembranaires fret antérograde comme les récepteurs de mannose-6-phosphate cation-dépendants et indépendants de cation (CDMPR et CIMPR) de livraison nouvellement synthétisé hydrolases lysosomales de la TGN à fin endosomes et lysosomes3,4,5, sortiline et SorLA6,7, Wntless (WLS) transportant des ligands Wnt à la surface des cellules 8 , 9 , 10 , 11. autres protéines récupérées vers le TGN sont TGN46 et ses isoformes connexes12,13,14, SNAREs (récepteurs solubles de fixation de fusion - éthylmaléimide-sensible-facteur des N) 15 , 16 , 17, précurseur de l’amyloïde (APP) de protéines18,19, ankylose progressive (ANK) protéines20métalliques transporteurs transmembranaires et comme ATP7A/B ou DMT121,22, traitement des enzymes dont la carboxypeptidase D, la furine ou BACE123,24,25. En dehors de ces protéines endogènes, les toxines bactériennes et végétales (p. ex., toxine de Shiga et le choléra, ricine et abrin) détournent les mécanismes de transport rétrograde pour atteindre l’ER pour retrotranslocation dans le cytosol26,,27, 28,29.

Afin d’analyser directement les trafic rétrograde, nous avons précédemment développé un ensemble d’outils axés sur les nanobody pour étiqueter une suivre protéines cargo de la surface de la cellule à compartiments intracellulaires30. Nanocorps représentent une nouvelle famille de protéines liants dérivés de homodimérique heavy-chain-seulement anticorps (hcAbs) qui se produisent naturellement dans les poissons cartilagineux et camélidés31,32. Ils constituent le domaine variable de chaîne lourde (HHV) de hcAbs et ont de nombreux avantages par rapport aux anticorps traditionnels (p. ex., IgG) : ils sont monomères, petit (~ 15 kDa), hautement soluble, dépourvu de ponts disulfures, peut être exprimée par les bactéries et sélectionné pour liaison de haute affinité33,34,35,36. Pour rendre notre outil nanobody polyvalente et largement applicable, nous avons utilisé fonctionnalisés anti-GFP nanocorps aux protéines de surface-étiquette et piste taggés GFP à leur domaine extracellulaire/lumière. Par fonctionnalisation de nanocorps avec mCherry, peroxydase d’ascorbate 2 (APEX2)37, ou séquences de tyrosine de sulfatation (TS), transport rétrograde des protéines transmembranaires de cargaison de bonne foi peut être analysé par soit fixe et imagerie cellulaire, en direct de microscopie électronique, ou biochimique. Puisque la sulfatation tyrosine médiée par des sulfotransférases tyrosylprotéine (TPST1 et TPST2) est une modification post-traductionnelle restreinte pour le trans-Golgi/TGN, nous pouvons étudier directement transport et la cinétique des protéines d’intérêt de la surface de la cellule à cette intracellulaire Golgi compartiment38,39,40.

Dans cet article des méthodes, nous décrivons la facilité de production des nanocorps fonctionnalisés (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry et dérivés), adapté pour un certain nombre d’applications pour analyser le transport rétrograde dans les cellules de mammifères,30. Nous nous concentrons principalement sur l’utilisation de TS site-modifié nanobody pour l’analyse du trafic intracellulaire de la surface cellulaire vers le compartiment de sulfatation.

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Protocole

1. bactérienne Transformation avec Nanocorps fonctionnalisés

Remarque : Ce protocole a été optimisé pour l’expression, purification et analyse des fonctionnalisées anti-GFP nanocorps comme décrit précédemment30. Dérivation avec les autres fractions de protéine peut nécessiter une modification du présent protocole standard.

  1. Décongeler les bactéries chemocompetent (~ 100 µL) adaptés à l’expression de la protéine (par exemple, Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) cellules) en les plaçant sur la glace.
    Remarque : Préparer les chemocompetent des cellules bactériennes conformément aux procédures standard de laboratoire. Sinon, les cellules bactériennes chimiquement compétents peuvent être achetés dans le commerce.
  2. Ajouter 50 ng d’un plasmide codant nanocorps fonctionnalisés. Afin de permettre suffisamment biotinylation in site du reporter nanobody au cours de l’expression bactérienne, aussi ajouter un excès triple (150 ng) d’un plasmide bactérien expression encodage ligase biotine BirA (voir également le tableau 1 pour plus d’informations de plasmide). Pipette doucement de haut en bas.
    Remarque : Si nanobody biotinylation n’est pas nécessaire ou les journalistes nanobody sont dépourvues d’un peptide d’accepteur de biotine (BAP), co transformation avec un plasmide codant BirA n’est pas nécessaire.
  3. Incuber les cellules bactériennes pendant 30 minutes sur la glace.
  4. Chaleur de choc les cellules bactériennes en les plaçant pendant 1 min à 42 ° C dans un bain d’eau ou un bloc de chauffage.
  5. Ajouter 1 mL de température ambiante (RT) moyen de bouillon (LB) de Luria et incuber les bactéries transformées dans un thermoshaker pendant 1 h à 37 ° C, afin de permettre l’expression phénotypique des gènes de résistance. Pour préparer 1 L LB moyen, extrait de balance 5 g de levure, 10 g de tryptone et 10 g de NaCl, remplit d’eau et stériliser à l’autoclave. Si le nanobody fonctionnalisé a été sous-cloné dans un vecteur d’expression contenant la résistance à l’ampicilline/carbénicilline, étape 1.5 peut être omise.
  6. Les bactéries à 11 000 x g pendant 1 min de granule et remettre en suspension dans 100 µL de milieu LB frais.
  7. Plaque les bactéries en suspension sur des plaques LB contenant les antibiotiques respectifs (par exemple, avec 50 µg/mL kanamycine et 50 carbénicilline µg/mL lors de la bactérie ont été transformée conjointement avec nanobody journaliste et BirA comme indiqué ci-dessus (étape 1,2)).
  8. Placer les plaques LB dans un incubateur à 37 ° C et laissez pousser pendant la nuit (O/N).
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici en stockant le plat de livre avec des colonies cultivées à 4 ° C. Parafilm permet de sceller les plaques LB.

2. Culture liquide et Induction de l’Expression Nanobody fonctionnalisés

  1. Prélever une colonie bactérienne contenant le vecteur d’intérêt de la plaque et laisser pousser dans un flacon contenant 20 mL de milieu LB additionné d’antibiotiques O/N dans un incubateur à agitation à 37 ° C (voir aussi l’étape 1.7 au sujet de la sélection antibiotiques).
  2. Lendemain, diluer la culture bactérienne cultivé 20 mL dans un flacon contenant 1 L de milieu LB avec des antibiotiques de choix.
  3. Continuer à incuber la culture bactérienne à 37 ° C jusqu'à ce qu’il atteigne un OD600 de 0,6 à 0,7. Permettre la culture se refroidir à RT avant d’induire l’expression de la protéine.
  4. Induire l’expression de la protéine de nanocorps fonctionnalisés et BirA par l’addition de 1 mL de 1 M isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) à une concentration finale de 1 mM de l’inducteur (1:1, 000 de dilution). Ajouter 10 mL d’a 20 mM d-biotine solution aboutissant à 200 µM d-biotine dans le milieu de croissance pour permettre la biotinylation de l’épitope BAP présent dans nanocorps fonctionnalisés (voir également le tableau 1 pour plus d’informations de plasmide)
    Remarque : La solution d-biotine est préparée en FD2O et mises en solution par addition goutte-à-goutte NaH2PO4à 500 mm. Par ailleurs, d-biotine peut également être dissous dans le DMSO. Pour produire nanocorps fondue à APEX2 (VHH-APEX2), le milieu LB doit être complété en outre avec le chlorhydrate de (dALA) l’acide 5-aminolévulinique 1 mM pour promouvoir l’incorporation de l’hème. dALA est préparé comme une solution stock de 100 mM à FD2O.
  5. Incuber les cultures bactériennes induite par l’IPTG 1 L à 30 ° C pendant 4 h pour VHH-2xTS, à 20 ° C ou RT O/N pour VHH-APEX2 ou à 16 ° C O/N pour VHH-mCherry (voir également le tableau 1 pour plus d’informations de plasmide).
    Remarque : Conditions d’expression d’une nouvelle construction de nanobody doivent être optimisées par l’expérimentateur.
  6. Transférer la culture bactérienne de la fiole dans un flacon de 1 L centrifugation et les cellules à 5 000 x g à 4 ° C pendant 45 min. décanter le liquide surnageant de granule et continuer avec la purification.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici en stockant le culot bactérien à-80 ° C indéfiniment. La pastille pour VHH-APEX2 ou HHV-mCherry est généralement brunâtre (à cause de l’hème incorporé) ou rose, respectivement.

3. purification des Nanocorps fonctionnalisés

  1. Si nécessaire, décongeler le culot bactérien congelé sur la glace (voir aussi l’étape 2.6).
  2. Ajouter 30 mL de tampon de liaison glacee (imidazole de 20 mM dans du PBS 1 x) pour le culot cellulaire bactérienne et remettre en suspension par pipetage de haut en bas. Transfert des bactéries remises en suspension dans un tube marqué 50 mL.
  3. Supplément de la liaison de 30 mL de tampon au lysozyme de 200 µg/mL, 20 µg/mL de DNase I, 1 mM MgCl2 et le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) de 1 mM et incuber tout d’abord pendant 10 min à RT et ensuite pendant 1 h à 4 ° C dans un agitateur sur la fin.
  4. Mécaniquement, lyse des cellules bactériennes dans un tube de 50 mL en plaçant un sonicateur pointe dans la suspension. Appliquer des impulsions constante 3 x 1 min avec 1 min de refroidissement périodes intermédiaires.
  5. Centrifuger le bactérienne lysat à 15 000 x g à 4 ° C pendant 45 min granuler les débris et les cellules intactes. La cellule bactérienne aux ultrasons lysate de transfert soit dans une bouteille de centrifugation appropriée pour la centrifugation ou diviser le lysat en plusieurs tubes de 5 mL pour la centrifugation sur table.
  6. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de 50 mL et jeter les débris de granulés.
  7. Stocker les lysats sur glace tout en préparant la purification par chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC). Pour isoler nanocorps fonctionnalisés histidine-étiquetées, emploient jetables ses colonnes (voir la Table des matières) permettant la purification de l’écoulement par gravité simple et rapide.
    Remarque : Alternativement, purification lot au lieu de colonnes commerciales peut être également utilisée.
  8. Montage de ses colonnes à un support métallique.
    1. À cône large de solution de stockage des colonnes et équilibrer sa colonne avec 10 mL de tampon de liaison (imidazole de 20 mM dans du PBS 1 x).
    2. Vide par écoulement gravitaire (le cheminement peut être jetée).
  9. Peu à peu charger le défrichées bactérienne lysat (~ 30 mL) dans la colonne. Vide par écoulement gravitaire (le cheminement peut être jetée).
  10. Laver sa colonne 2 x 10 ml de tampon de liaison (imidazole de 20 mM dans du PBS 1 x).
  11. Éluer les nanocorps avec 2 mL de tampon d’élution (imidazole de 500 mM en solution 1 PBS x) dans un tube de 2 mL et demander un échange de la mémoire tampon.
  12. Échange de la mémoire tampon.
    1. Equilibrer un dessalage colonne (voir Table des matières) placée dans un adaptateur de colonne de tube de 50 mL 5 fois avec 5 mL de PBS 1 x.
    2. Laisser le tampon entrer dans le lit emballé. Jeter le cheminement.
    3. Après la cinquième équilibration de PBS, tourner la colonne à 1 000 x g pendant 2 min.
    4. Jeter le cheminement.
    5. Placer la colonne avec l’adaptateur sur un nouveau tube de 50 mL. Charger le 2 mL d’élution nanobody fonctionnalisé (de l’étape 3.11) sur la colonne de dessalement PBS-équilibré et un essorage à 1 000 x g pendant 2 min et recueillir l’éluat.
      Remarque : Au lieu de colonnes de dessalement commerciales, dialyse peut être appliquée pour échanger la composition du tampon.
  13. Déterminer la concentration de protéine (nanobody) de l’éluat utilisant le bicinchoninic (BCA) ou analyse de Bradford selon les instructions du fabricant.
    Remarque : Pour les tests de captation nanobody de lignées cellulaires GFP journaliste, une concentration stock de 2 à 10 mg/mL est optimale.

4. validation de l’Expression Nanobody fonctionnalisés (coloration de Coomassie)

  1. Préparer des gels de 10 à 12,5 % sodium dodécyl sulfate-électrophorèse sur gel polyacrylamide (SDS-PAGE) selon des protocoles standard.
    Remarque : Sinon, utiliser des gels de gradients préfabriqués disponibles dans le commerce.
  2. Pipeter 20 µg de purifiée nanobody fonctionnalisé dans un tube de 1,5 mL et les faire bouillir dans un tampon échantillon à 95 ° C pendant 5 min.
    Remarque : Par exemple, ajoutez 10 µL d’une solution mère de nanobody 2 mg/mL dans un tube de 1,5 mL avec 10 µL de tampon de 2 x. Si le volume est trop petit, diluer davantage nanobody dans du PBS avant d’ajouter la solution tampon.
  3. Charger le nanobody purifiée bouilli dans du tampon échantillon sur un gel SDS-polyacrylamide et exécuter selon le protocole standard de PAGE jusqu'à ce que la teinture de référence (p. ex., bleu de bromophénol) a atteint la fin du gel de séparation, suivi par coloration au bleu de Coomassie et de décoloration.
  4. Bleu de Coomassie Gel de coloration et de décoloration.
    1. Uncast gel et souiller avec solution colorante de Coomassie (5 % d’une solution mère de Coomassie dans 10 % d’acide acétique et 45 % de méthanol dans ddH2O 10 g/L) pendant 20-30 min à ta sur une plate-forme vibrante mobile. Le gel doit être complètement recouvert de la solution colorante.
    2. Décolorer le gel 2 - 3 fois avec destain solution (7,5 % d’acide acétique et 15 % méthanol ddH2O) pendant 1 h chaque RT, avant de quitter le gel O/N pour plus de décoloration.
      NOTE : Excès Coomassie peut être efficacement absorbent en plaçant des serviettes de papier de cuisine autour du gel.
  5. Le gel avec un imageur ou caméra de choix de l’image.
    Remarque : Nanobody expression pouvant être encore validée par l’analyse par immunotransfert utilisant des anticorps ciblant ses épitopes (voir aussi Figure 1 a).

5. l’absorption des Nanocorps fonctionnalisés par les cellules cultivées pour la coloration de la Fluorescence

  1. Dans une hotte de culture cellulaire, les cellules HeLa semence ~ 400 000 à 500 000 exprimant de manière stable une protéine GFP-étiquetée journaliste sur verre 18 mm lamelles couvre-objet (no 1,5 H) 35 mm plats ou grappes de 6 puits avec milieu complet contenant des antibiotiques (milieu Eagle modifié de Dulbecco, DMEM additionné de 10 % de sérum de veau foetal (FCS), 100 unités/mL de streptomycine, 2 mM de l-glutamine et la puromycine de 1,5 µg/mL).
    Remarque : Ici, nous utilisons les cellules HeLa exprimant de manière stable la calnexine-EGFP, EGFP-CDMPR et ISF-EGFP fins d’illustration. En dehors de lignées cellulaires stables, utilisable aussi transitoirement HeLa transfectées. Lignées cellulaires stables peuvent être conjointement cultivées à cette étape avec non-transduites HeLa cellules parentales, pour une comparaison directe.
  2. Incuber les cellules O/N à 37 ° C dans une étuve à 7,5 % CO2 à proliférer.
    Remarque : Les cellules doivent avoir une confluence d’environ 80 % le lendemain.
  3. Pipeter 2 µL d’une solution mère de nanobody 2 mg/mL dans un tube de 15 ou 50 mL contenant 2 mL de milieu complet (ce volume est suffisant pour couvrir un plat de 35 mm ou d’un puits d’une grappe de 6 puits, ajuster le volume du milieu et nanobody proportionnellement à inclure plus de cellule culture d ishes ou clusters).
    Remarque : Aux fins d’illustration, nous utilisons ici VHH-mCherry, puisque aucune souillure d’anticorps supplémentaire n’est nécessaire pour voir nanobody internalisé par les journalistes EGFP (voir Figure 2).
  4. Enlever le milieu de croissance des cellules et ajouter 2 mL de préchauffée milieu complet contenant 2 nanobody µg/mL fonctionnalisé par plat 35 mm ou unité de 6 puits.
  5. Incuber les cellules pendant 1 h à 37 ° C dans une étuve à 7,5 % CO2 pour permettre l’absorption nanobody induite par le journaliste.
    Remarque : Selon l’expérience prévue, le temps d’absorption nanobody doit être ajustée. Pour l’expérience a montré ici, 1 h est suffisant pour atteindre l’équilibre d’absorption nanobody par EGFP-CDMPR et ISF-EGFP.
  6. Retirez le support et laver les cellules 2 - 3 fois avec 1 mL de solution de 1 PBS x à température ambiante.
  7. Fixer les cellules avec 1 mL de paraformaldéhyde à 3 % (PFA) pendant 10 min à température ambiante.
  8. Enlever la solution de la PFA et étancher le fixateur restant avec 1 mL de 50 mM NH4Cl dans 1 x PBS pendant 5 min à température ambiante.
    Remarque : 3 % PFA pour éliminer les déchets séparément comme fixateur.
  9. Laver les cellules 3 fois avec 1 mL de solution de 1 PBS x à température ambiante.
  10. Permeabilize les cellules avec 1 mL de 0.1 % Triton X-100 dans du PBS 1 x pendant 10 min à température ambiante.
    Remarque : Bien qu’aucun perméabilisation n’est requise, fluorescence EGFP et mCherry vaut mieux lorsqu’ils sont par la suite les cellules sont incorporés dans le milieu de montage.
  11. Laver les cellules 3 fois avec 1 mL de solution de 1 PBS x à température ambiante.
  12. Placer les lamelles couvre-objet avec une pince sur une goutte d’eau (~ 100 µL) de 1 % de BSA à 1 x PBS contenant 5 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole) pendant 5 min à température ambiante.
  13. Placer les lamelles dans le plat/puits et laver 3 fois avec 1 mL de PBS 1 x à température ambiante.
  14. Étiqueter les lames de verre et de monter les cellules avec Fluoromount-G. Laisser le milieu de montage se durcir dans l’obscurité pendant 3-4 h et mettre les plaques en verre à 4 ° C sous protection contre la lumière.
  15. Images de colorations à l’aide d’un microscope de choix (par exemple, un microscope droit Point Scanning Confocal).

6. absorption des Nanocorps fonctionnalisés par les cellules cultivées (pour l’analyse de sulfatation)

  1. Sous une hotte de culture cellulaires, des semences ~ 400 000 à 500 000 les cellules HeLa exprimant de manière stable une protéine GFP-étiquetée journaliste dans les plats de 35 mm ou sur des clusters de 6 puits complet moyen contenant des antibiotiques (milieu Eagle modifié de Dulbecco, DMEM, additionné de 10 % de veau foetal sérum (FCS), 100 unités/mL de streptomycine, 2 mM de l-glutamine et la puromycine de 1,5 µg/mL).
    Remarque : Comme mentionné ci-dessus, nous utilisons ici les cellules HeLa exprimant de manière stable la calnexine-EGFP, EGFP-CDMPR et ISF-EGFP fins d’illustration. En dehors de lignées cellulaires stables, utilisable aussi transitoirement transfectée HeLa.
  2. Incuber les cellules O/N à 37 ° C dans une étuve à 7,5 % CO2 à proliférer.
    Remarque : Les cellules doivent avoir une confluence d’environ 80 % le jour suivant.
  3. Enlever le milieu complet, laver 2 fois avec la solution de 1 PBS x à ta et affamer les cellules avec un milieu sans sulfate (SFM) pendant 1 h à 37 ° C dans une étuve à 7,5 % CO2 .
    Remarque : GDF est préparé en ajoutant 10 mL de solution MEM acides aminés (50 x), 5 mL de L-glutamine (200 mM), 5 mL de solution de vitamine (x 100) et 900 µL de CaCl2·2H2O à 500 mL de sels équilibrées de l’aigle. Passer à travers un 0,22 µm filtre et partie aliquote.
  4. Dans une hotte ventilée ou banc désigné pour les travaux de la radioactivité, préparer le sulfate étiquetage milieu contenant du sulfate de mCi/mL [35S] 0,5 comme sel de sodium dans la GFD.
    Mise en garde : Soigneusement gérer toutes les solutions contenant de la radioactivité. Ne fonctionnent que dans les hottes désignés ou bancs. Tous matériel (conseils, tubes, plaques, etc.) ou des tampons de lavage au contact de la radioactivité doivent être collectés et éliminés. Cela aussi bien pour toutes les étapes ci-dessous (étape 6.5-6.20).
  5. Ajouter VHH-2xTS en solution 1 PBS x en sulfate étiquetage moyen à une concentration finale de 2 µg/mL.
    Remarque : Comme contrôle, comprennent également VHH-std ou un autre nanobody dépourvues de sites TS pour démontrer un étiquetage spécifique.
  6. Remplacer la gestion durable des forêts par 0,7 mL de sulfate de marquage moyen contenant du sulfate de 0,5 mCi/mL [35S] et 2 µg/mL VHH-2xTS et incuber les cellules pendant 1 h à 37 ° C dans une étuve à 7,5 % CO2 désignée pour travailler à la radioactivité.
    Remarque : Selon l’expérience prévue, le temps de sulfatation nanobody doit être ajustée. En outre, pour déterminer la cinétique d’arrivée TGN, étiquetage est effectué à des moments différents (par exemple, pour 10 min, 20 min, 30 min, etc..).
  7. Retirez le support de l’étiquetage et laver les cellules 2 - 3 fois avec du PBS glacée 1 x sur une plaque de refroidissement ou de la glace.
  8. Ajouter 1 mL de tampon de lyse (PBS contenant 1 % Triton X-100 et 0,5 % désoxycholate) additionné de PMSF à 2 mM et 1 x inhibiteur de la protéase cocktail et incuber les cellules pendant 10-15 min sur une plate-forme bascule à 4 ° C.
  9. Gratter et transférer le lysat dans un tube de 1,5 mL, le lysat, vortex et placer pendant 10-15 min sur une coiffe plus fin à 4 ° C.
  10. Préparer un post-nucléaire lysat par centrifugation à 10 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
  11. En utilisant un nouveau tube de 1,5 mL, préparer 20-30 µL d’une suspension de billes de Nickel dans un tube de 1,5 mL et laver une fois avec du PBS 1 x par leur enrobage doucement à 1 000 x g pendant 1 min.
    Remarque : Au lieu de Nickel, perles, perles de streptavidine (si nanobody est biotinylé) ou perles A protéine avec une IgG contre un épitope de la nanobody (T7 - ou HA-tag) peuvent être utilisés.
  12. Transférer le post-nucléaire lysat dans un tube de 1,5 mL contenant des perles de Nickel et incuber pendant 1 heure à 4 ° C sur une coiffe plus fin pour isoler les nanocorps. Supprimer une partie aliquote (50-100 µL) de la post-nucléaire lysate et faire bouillir dans un tampon échantillon SDS pour immunobuvardage ultérieures de total associé aux cellules nanobody, journaliste GFP et contrôle de chargement.
  13. Laver les billes 3 fois avec 1 x tampon PBS ou lyse par granulation doucement à 1 000 x g pendant 1 min.
    Remarque : Pour un lavage plus strict des perles, imidazole 20 mM peut être inclus dans le tampon PBS ou lyse.
  14. Retirez délicatement toutes les tampon de lavage des perles, ajouter 50 µL de 2 x solution tampon et faire bouillir pendant 5 min à 95 ° C.
  15. Charge les deux bouilli perles sur un midi 12,5 % de gel SDS-PAGE et exécuter selon le protocole standard de PAGE jusqu'à ce que la teinture de référence (p. ex., bleu de bromophénol) a atteint la fin du gel de séparation.
    Remarque : Immunobuvardage de total associé aux cellules nanobody, journaliste GFP et contrôle de chargement peut également être effectuée à l’aide d’un mini 12,5 % SDS-PAGE ou gel en gradient préfabriqué.
  16. Fixer le gel de séparation dans environ 30 mL de tampon de fixation (10 % d’acide acétique et 45 % méthanol ddH2O) pendant 1 h à RT, laver le gel trois fois avec environ 50 mL d’eau désionisée et préparer pour le séchage du gel.
  17. Séchage de Gels SDS-PAGE.
    1. Placez le gel fixe sur tendue s’accrochent film délicatement et couvrez-la avec intercalaires papier filtre.
    2. Placer le gel avec le papier filtre vers le bas sur le dessus de la plate-forme de séchage, posez le couvercle sous vide et mettre en marche la pompe à vide pour le séchage du gel. Sécher le gel pendant 3-5 h.
    3. Retirez le papier film et placer le gel séché dans une cassette d’autoradiographie équipée d’un écran phosphorescent.
  18. Autoradiogramme d’image à l’aide d’un imageur d’écran de phosphore. Suivez les instructions du fabricant.
    Remarque : Selon la force du signal, séché gels il fallait être plus exposés avec des écrans de phosphore.

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Résultats

Afin d’étudier le transport des protéines rétrograde vers diverses destinations intracellulaires, nous avons récemment créé un outil anti-GFP nanobody pour étiqueter des protéines de fusion recombinantes découlent de la surface cellulaire30. Ici, nous démontrons la production bactérienne de ces dérivés nanocorps et démontrer leur application pour étudier l’absorption endocytose par microscopie à fluorescence et immunoblotting, ainsi que leur uti...

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Discussion

Nanocorps représentent une nouvelle classe d’échafaudages de liant de protéine avec nombreux avantages par rapport aux anticorps traditionnels : ils sont petits, stable, monomère, peuvent être sélectionnés pour les obligations de haute affinité et manque le disulfure33,35, 44 , 45. ils sont utilisés dans un certain nombre d’applications, tels que dans les systèmes de cultures cel...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par Grant 31003A-162643 par la Swiss National Science Foundation. Nous remercions Nicole Beuret et le Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) pour la prise en charge.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GFP antibodySigma-Aldrich118144600001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibodyBethyl LaboratoriesA190-114A
Anti-actin antibodyEMD MilliporeMAB1501
Goat anti-rabbit HRPSigma-AldrichA-0545
Goat anti-mouse HRPSigma-AldrichA-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)ApplichemA3672
D-biotinSigma-AldrichB4501dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochlorideSigma-AldrichA3785dissolved in sterile water
DNase IApplichemA3778dissolved in sterile water
LysozymeSigma-Aldrich18037059001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA)Sigma-AldrichB5936
PuromycinInvivogenant-pr-1
Penicillin/StreptomycinBioconcept4-01F00-H
L-glutamineApplichemA3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Fetal calf serum (FCS)BiowestS181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfateHartmann AnalyticsARS0105Product contains 5 mCi
Earle's balanced saltsSigma-AldrichE6267
MEM amino acids (50x) solutionSigma-AldrichM5550
MEM vitamin solution (100x)Sigma-AldrichM6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836153001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)ApplichemA1008dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium saltApplichemA1491dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfateApplichemA1493dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue)Sigma-AldrichB-0149
Paraformaldehyde (PFA)ApplichemA3813
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Ni Sepharose High PerformanceGE Healthcare17-5268-01
His GraviTrap columnsGE HealthcareGE11-0033-99
His buffer kitGE HealthcareGE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columnsGE HealthcareGE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-wellBio-Rad456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
35 mm dishesFalcon353001
6-well platesTPP92406
Glass coverslips (No. 1.5H)VWR631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)ApplichemA0999.0025dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
TryptoneApplichemA1553
Yeast extractApplichemA1552
Magnesium chloride hexahydrateMerck Millipore105833dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrateMerck Millipore102382dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chlorideMerck Millipore106404dissolved in sterile water, stock is 5 M

Références

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