レンチ ウイルスのベクトルの直噴ハイライト ラット脊髄における複数の運動経路

要約

このプロトコルは、ラット脊髄組織への逆行性可搬型ウイルスのベクトルの注入を示します。ベクトルはシナプスでとらし、ターゲット ニューロンの細胞体に運ばれます。このモデルは、重要な脊髄経路またはターゲット細胞遺伝子治療用の逆行のトレースに適しています。

要約

神経系の細胞に興味の蛋白質を導入は、生来の生物学的障壁ほとんど分子へのアクセスを制限するために挑戦です。脊髄組織に直接注射を細胞体へのアクセスを提供する、これらの障壁を無視またはシナプス分子を組み込むことができます。この方法とウイルスベクター技術を組み合わせることで標的遺伝子の遺伝子治療や管トレースを目的として神経組織への導入はします。ここで脊髄固有のニューロン脊髄と脳幹の核のニューロンへの特定輸送を促進する (PNs) のシナプスに非常に効率的な逆行性輸送 (HiRet) 用に設計されたウイルスを導入します。PNs をターゲットに核および網様体脊髄路として脊髄セグメントを通して互いの相互接続などの運動経路から受け取った多数の接続の活用します。代表的なトレース HiRet ベクトルを用いた恒常活性緑色蛍光タンパク質 (GFP) 細胞体、軸索と胸部の PNs と橋の網様体網様体脊髄ニューロン樹状突起のアーバーの忠実度の高い詳細を表示します。HiRet 脳幹経路と PNs に組み込まれていますが、年齢依存の皮質脊髄路ニューロンの統合を示しています。要約すると、ウイルスのベクトルを使用して脊髄注射は興味の蛋白質の標的器官の細胞への導入に適した方法です。

概要

ウイルスのベクトル、欠陥遺伝子の活性を上昇させる重要な成長タンパク質を補うまたは構造とのシナプス接続をハイライト マーカー蛋白質を製造するために細胞に遺伝物質を導入することが重要な生物学的ツール彼らの目標です。蛍光トレースと主要な運動経路を強調するためにラットの脊髄に非常に効率的な逆行性輸送レンチウイルスベクターの直接注入について説明します。 このメソッドは、神経細胞の多様な集団に興味の蛋白質を導入する軸索の再生と再生の研究に非常に適しても、沈黙ニューロン機能マッピング研究^1,2のために使用されています。

脊髄運動経路の解剖学的な詳細の多くを BDA とフッ素金^3,4,5,6,7など古典的なトレーサーと直噴研究を通して解明しました。^,8しますこれらのトレーサーのゴールド スタンダードであるが、損傷した軸索によって吸収など特定の欠点がありますまたは注射を周囲白質の通路の軸索サイト^9,10,11。.これは経路接続が誤って解釈する可能性があります、破損または切断された軸索によって色素の吸収が後の分析¹²中に繊維を再生のためと誤解されるおそれ再生研究の欠点があります。

レンチウイルスベクターは遺伝子療法の研究で人気のある神経集団^{13,14,15,16,17,18 で安定した、長期的な表現を提供するよう ,19}。ただし、従来パッケージ レンチウイルスベクター逆行性輸送に限られていることができるし、した場合の免疫応答を引き起こす可能性があります生体内で^4,20,21。HiRet と呼ばれる高効率の逆行輸送ベクトルは逆行輸送^22,23を向上させるハイブリッド ベクトルを作成する狂犬病ウイルス糖蛋白質のウイルスのエンベロープを変更することにより加藤らによって生産されています。

逆行のトレースは、その細胞の軸索によってとらし、細胞体に輸送することができますターゲット ニューロンのシナプスの空間にベクトルを紹介します。HiRet の成功の輸送は、マウスや霊長類^23,24の脳に神経シナプスと運動ニューロン²²に筋肉から実証されています。このプロトコルは、腰椎脊髄、脳幹ニューロンと脊髄固有のニューロンのシナプス終末を具体的にターゲットへの注入を示します。PNs では、多くの異なる脊髄経路から接続を受信し、脊髄と脳幹の神経細胞の多様な人口を対象とするこのように利用できます。本研究ではラベル付きニューロン回路を支配する運動ニューロン プール後肢運動機能に関連を表します。堅牢なラベリングは、脊髄と脳幹、アーバーの樹状突起と軸索端末の忠実度の高い詳細などに見られます。またメソッドを使いましたこの頸髄内先行研究で脊髄固有および脳幹の網様体脊髄経路²⁵にラベルを付ける。

このプロトコルは、ラットの腰部脊髄へのウイルスのベクトルの注入を示します。映画 1に見られるように、最後の肋骨にある L1 椎体を識別することによって切開は対象します。これは L1 L4 脊髄を通して筋肉を公開する 3-4 cm の切開の尾のランドマークとして使用されます。T11 T13 脊椎骨の背側面の laminectomies が実行され、ベベルガラス針は 0.8 mm 下げた 1.5 mm の正中線から外側を指示されるウイルスを注入する灰白質に深く。

プロトコル

以下の手術と動物のケア手順のすべては、ケアおよび使用委員会のテンプル大学によって承認されています。

1. 術前準備

1. ウイルス注入ナノリットル インジェクター用に設計された 3.5 ナノリットル ガラス毛細管ピペットを使用して手術前に数日の引っ張られたガラス針を準備します。針の 2 つのテンプレートを作成するための製造元の指示に従って二段針引き手を引いて、各ピペット。
2. 刀で余分なガラスの約 1-2 mm を切断して針テンプレートの先端を絞り込みます。測定針 30-40 μ m の開口部を分離する顕微鏡校正スライドを顕微鏡下でおおよその口径。
3. 30 ° に位置する針、ピペット beveller を使用して 30-40 μ m の絞り値と 45 ° の傾斜角度で先端を作成します。校正スライドのバーニア スケールで開口幅を確認します。柔軟な針の付いた注射器を使用して破片を洗い流すと、一定の間隔で針を黒のマーカーでマーク ガラス針を水とエタノールを通過します。
4. 以前 70% エタノールで洗浄屋根付きシャーレに針を置き、紫外線の下でバイオ セーフティ フードで 30 分間殺菌します。
5. HiRet レンチを準備するには、手順の直前に冷凍庫から適当なボリュームを削除します。
   注: 適切な音量には注入に必要な量が含まれています (1 μ L 注入/注射の数 x) 少量ピペッティングおよび損失の読み込みを考慮して余分なボリュームのプラス。輸送し、使用しないときに氷にウイルスを格納します。
6. マイクロ ポンプにそれを差し込むとバーニア スケール マイクロマニピュレーターに配置することによって、インジェクターを準備します。
7. ガラス針を準備、慎重に注射器で赤色の油などの着色された染料をロードするには、柔軟な針が備わっています。針で気泡が残っていないことを確認します。無菌技術を使用して、針を処理するとき、先端に触れるを控えます。
8. ガラス針を挿入、ワッシャーに針が正しく装着されて、インジェクター キャップはタイトでねじで締まるし、鋼インジェクター針を拡張を確保、インジェクター約 ¾ ガラス針の長さ。ウイルスは、後の手順で針に読み込むことができます。

2. 麻酔や手術部位の準備

1. 動物のデジタル スケールで重量を量る。麻酔薬の必要量を判断し、減量手術後のモニタリングを可能にする術前の体重を記録します。Sprague-dawley ラット約 200-250 g は、このプロトコルで使用されていた。
2. イソフルラン吸入または挿入されたケタミン ・ キシラジン ソリューションを使用してラットの麻酔 (k/x)。ここでは、ケタミンは 67 mg/kg とキシラジン 6.7 mg/kg の用量で腹腔内注入されます。
3. しっかりと足を締めつけることにより適切な麻酔平面を確認します。反射的撤退が発生した場合は、続行する前にいくつかの追加分を待ちます。
   注: またひげ、目と意識の兆しの呼吸数を観察します。ひげがけいれん、目に優しく、触れたとき点滅または呼吸は速く浅く場合、麻酔の飛行機は深いプロトコルを続行するまで待ちます。また椎弓切除術および注入の手術を通してこれらの兆候を監視します。動物には、浅い麻酔平面が表示されている場合管理ケタミンだけ同等のブースター ショット 1/2 に元の k/x の投与量。
4. 肩甲骨の劣った角度に腰から背側の正中線に沿ってラットのひげをそる。簡単より正確なひげをそるのピンと張った、動物の皮膚を引き出します。
5. 両方の目に眼軟膏を適用されます。
6. サイトを消毒する剃毛エリアに消毒薬を塗る。最初のスクラブすべての髪やがれき 5% ヨウ素溶液と拭きに滅菌ガーゼを浸します。2 回エリアは連絡なし、70% エタノールに浸した滅菌ガーゼでこれをフォロー方向スワイプで。これと同じ手法を使用して、倍のヨウ素とエタノールに浸したガーゼを交互に。

3. 手術の準備のフィールドと器

1. 滅菌フィールドを作成する滅菌ラップをアンラップにメス、rongeurs、ラット歯の鉗子、春はさみ、止血剤、中ポイント カーブ鉗子とリトラクターや重み付きフックを含むオートクレーブの手術器具のセットを準備します。
2. 滅菌手術用手袋のパッケージを開き、滅菌グローブ ラップをテーブルに置きます。滅菌ラップの汚染を防ぐために使用されるツールの追加滅菌フィールドとして使用します。
3. #10 メス刃を滅菌フィールドにドロップします。止血剤のハンドルに刃を保護します。位置滅菌生理食塩水、4.0 のクロム腸線縫合糸、材料、師、滅菌ガーゼ、(の筋肉出血)、滅菌綿棒や弁 (骨出血) のアクセス可能な場所での bonewax などの出血のコントロールに。
4. 動物を取得し、滅菌布でそれを設定します。尿を収集するために膀胱の下にガーゼを配置します。腹部の下で巻きタオルでターゲット地域を支えます。可能な場合、特に長い手順のため、滅菌布の下に外科的加熱パッドを配置します。
   注: 不妊手術生存中に重要です。手袋をはめた手の使用ビーズ滅菌器不妊が侵害された場合、または個々 の手術の間は無菌性を維持する一方、70% のエタノールのスプレー ボトルを維持します。

4. 公開脊柱、椎弓切除術のサイトを識別します。

1. 皮膚切開がなされる最後の肋骨に指を軽く押して L1 椎体を検索する領域を識別します。筋肉を公開する L1 だけ劣って終了 #10 手術メスで 3-4 cm の皮膚切開を作るランドマークとして、これを使用して。穏やかな広がりによってピンと張った肌を保持し、きれいな切開を確保するためメス刃でしっかりと押します。
2. カットし、鉗子、はさみに応じて表在性脂肪を広めます。(対象椎骨によって異なります可能性があります。 または大きいの脂肪パッドの表面的な筋肉ではない)。
3. メスの刃または指のフラットな棘突起の感触。しばしばどちら側でも白い筋膜の"V"が正中線エリアを概説します。ラット歯の鉗子で上流工程にしっかりとつかむし、可能な限りプロセスに近い 2 つの長い、深いカットを作るように小さな吻側カットを作る。カットの深い時点では、脊椎骨の背側表面をメス刃で感じることができます。
4. リトラクターや視認性を改善するために重み付けのフックと脇の外側の筋肉を保持します。メス、春はさみや頭の形状を決定する rongeurs プロセスを明確な筋。
   注意: 脊髄組織停止前の骨よりも開発に成長としては、脊髄に、脊柱の完全な長さを超えない。これは、ターゲットの脊髄レベルが異なる名前椎の下にあるかもしれないことを意味します。
5. T11、T12 ・ T13 の隣接するプロセスを探します。
   注: 適切な椎骨レベルをターゲットに援助は、ラット脊髄アトラスと非常によく似ているマウスでランドマークをアウトライン前の調査で見つけることができます脊椎構造^6,33。T9 など吻側棘突起を正中線ランドマークを与えるため行わないでください。

5、椎弓切除術を行う

1. ターゲット領域が正しく識別されて、一度は、T11 T13 の背側面の laminectomies を実行します。優しく広がる脊椎骨の初期制動の rongeurs を挿入するのには良いサイトである椎間靭帯を明らかにします。細かい制御を高めるため半分閉じている位置で、rongeurs を保持します。
2. Rongeurs と軽食を取って、棘突起と椎の背側面を削除します。脊髄の損傷または硬膜を邪魔しないように注意します。引くのためラット歯の鉗子で脊髄椎骨からを少し持ち上げ、脊髄組織をヒットする傾向を減らします。
3. 正中線の血管を観察することができますので、正中線から骨を離れてクリアします。明らかに脊髄組織を表示し、障害物がないウィンドウを残します。
4. 鉗子で脊髄がそっと触れます。その麻酔の平面が深い場合でも、いくつかの動物がジャンプ反射的。直接注入のプロシージャの間にジャンプを防ぐために脊髄にリドカインなどの麻酔剤を数滴を適用します。
5. 棘突起吻側と尾側椎弓切除術ウィンドウに安定用のピンセットを留めることによって脊髄のホルダーに動物を保護します。呼吸運動の効果を否定する脊髄のホルダーを使用して動物の腹部を上げます。これは針の安定性を高めるし、挿入の適切な深さを確保します。

6. ウイルスをロードとインジェクターを位置決め

1. パラフィルムの部分の上に約 5 μ L を分注して先端がドロップの中に移動するには、針インジェクターにウイルスを読み込みます。
2. 20-100 nL/秒のレートでウイルスの最大 4 μ L を撤回するのに、マイクロ ポンプを使用します。
3. 挿入し、針の先端がブロックされないように、針からのウイルスの少量を解放するコント ローラーを設定します。拭き取ってください余分なウイルス研究室で拭きます。
   注: 鋼の針でハミルトンのシリンジは引っ張られたガラス ピペットの代替として使えます。
4. バーニア スケールが表示されるようにマニピュレーターを配置し、脊髄の正中線に針を配置します。
   注: 正中線は、脊髄の前面で実行されている大きな血管でも配置できます。これは個々 のラットで異なることができ、そのままの棘突起と正中線をターゲットを確認すべき。
5. バーニア スケールを用いたマニピュレーター 0.8 mm で横方向に針を直接します。
6. インデントがない、硬膜穿刺までに脊髄に針を下ろします。1.5 mm の深さに沈んでいるそれまで針で硬膜を穿刺迅速なひねりを使用して、.

7. 脊髄にウイルスを注入します。

1. 針は、完了後プログラム 400 nL/分確認、ウイルスの割合で注入するインジェクターは色素フロントの進行状況を観察することによって脊髄に入る。明らかな漏れ無しまたは脊髄組織の膨張があるはずです。漏れを確認すると、時々 200 nL/min に射出速度を減らすことによって緩和されるこのすることができます。
2. 注入が完了すると、脊髄 (注入量) に応じて 2-5 分のための残りの部分に針を許可するウイルスの拡散を促進します。
3. ゆっくりと針を撤回し、次の注射部位に移動します。ウイルスの 1 μ L を各 6 等間隔サイト約 1 mm L1 L4 脊髄組織の長さに沿う間隔に注入します。同じ針は、それが正しく機能し続ける限り、各インジェクションで使用される可能性があります。

8. 創傷閉鎖と手術後のケア

1. 脊髄のホルダーから動物を削除、リトラクターまたは外側筋を広めるために使用フックを取り出してください。傷は閉じる前にすべての破片の明確を確認します。
2. 4.0 クロム腸線縫合糸を使用して筋肉を縫合します。内部皮膚の炎症の可能性を減らすには結び目の近くに縫合糸をカットします。
3. 閉じた傷 9 ミリメートルのクリップを使用して皮膚を定番します。最適の治療を可能にする、ホチキス止めする前に皮膚のエッジをラインします。
4. 温暖化パッドとモニターまで覚醒水の対流に動物を配置します。
5. 5-10 mL の皮下水分や感染を防ぐためセファゾリンなどの抗生物質を補充するために滅菌生理食塩水を注入します。動物は外来はその家のケージに戻したと初期鎮痛剤を提供します。 痛みや苦痛の兆候をラットを監視し、痛みの緩和、承認 IACUC 手順に従って治療します。

結果

成功した注入およびウイルスのベクトルのトランスポートは、一方的なニューロン脊髄および特定の脳幹の核の堅牢な人口の伝達になります。ニューロンと脊髄、投与 4 週間後で脳幹の橋の網様体は軸索のステレオタイプ的なラベリングを図 1に示します。重要な GFP 発現は、注入 (図 1 a、ボックス領域) と同側の側胸部脊髄の灰白質のニュー...

ディスカッション

脳や脊髄の神経細胞の遺伝子操作はハイライト感覚、運動と傷害^27,28,後神経管の再生可能性を探索する蛍光トレースを介して自律神経経路に務めています。^{29,30,31,32,33}. 直接脊髄への逆行性可搬型ウイルスのベクトルの...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections.
10mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309604	For injecting saline into the animal, post-surgery.
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility.
Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Antibiotic (Cefazolin)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	To seal up bone in the case of bone bleeding.
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00	To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Gelfoam	Pfizer	H68079	To seal up bone in the case of bone bleeding.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.
Hair Clippers	Oster	111038-060-000	For clearing the surgical site of hair.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Kimwipes	Kimtech	34155	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
Ophthalamic Ointment	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	To protect the animal's eyes during surgery.
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rimadyl Tablets	Bio Serv	MP275-050	For pain management post-surgery.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Stainless Steal Wound Clips	CellPoint	201-1000	To bind the skin of the surgical wound during closing.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
T/Pump Heat Therapy Water Pump	Gaymar	TP500C	To pump warm water into the water convection warming pad.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.