Прямой впрыск лентивирусные вектора выделяет несколько мотор путей спинного мозга крысы

Резюме

Этот протокол демонстрирует инъекции retrogradely переносные вирусный вектор в ткани спинного мозга крысы. Вектор take up в синапсе и перевезены в клетки тела нейронов целевой. Эта модель подходит для ретроградного отслеживания важных путей спинного мозга или ориентации клетки для генной терапии приложений.

Аннотация

Представляя протеинов интереса в клетки нервной системы является сложной задачей из-за врожденной биологические барьеры, которые ограничивают доступ к большинство молекул. Инъекции непосредственно в ткани спинного обходит эти барьеры, обеспечивая доступ к Сотовые органов или синапсов, где молекулы могут быть включены. Сочетание вирусных векторной технологии с помощью этого метода позволяет для внедрения целевых генов в нервной ткани для генной терапии или тракта трассировки. Здесь вирус инженерии для высокоэффективных Ретроградная транспорта (HiRet) вводится в синапсах propriospinal интернейронов Латвийской почты (PNs) для поощрения конкретных видов транспорта для нейронов спинного мозга и ядрах ствола головного мозга. Ориентация ПНС использует многочисленные соединения, которые они получают из мотора, таких как rubrospinal и вставочные участки, а также их взаимосвязи друг с другом на протяжении сегментов спинного мозга. Представитель трассировки с помощью вектора HiRet с конститутивно активных Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) показывает высокоточных деталей органов ячейки, аксоны и дендритных беседки в грудной ПНС и вставочные нейроны в Понтийские ретикулярной формации. HiRet включает в себя хорошо в пути ствола мозга и ПНС, но показывает возраст зависит от интеграции в кортикоспинальных путей нейронов. В целом спинного инъекций с использованием вирусных векторов является подходящим методом для внедрения протеинов интереса в нейроны целевых участков.

Введение

Вирусных векторов являются важными биологического инструментами, которые можно ввести генетического материала в клетки для того чтобы компенсировать дефектных генов, upregulate существенный рост белки или производство маркер белки, которые подчеркивают структуру и синаптических связей их цели. Эта статья посвящена прямым впрыском высокоэффективных retrogradely переносные лентивирусные вектора в спинной мозг крыс для того чтобы выделить основные моторные пути с флуоресцентные трассировки.  Этот метод также является весьма уместным для аксональное регенерации и отрастания исследований ввести протеинов интереса в разнообразных популяций нейронов и был использован для замолчать нейронов для сопоставления функциональных исследований^1,2.

Многие анатомические детали позвоночника моторные пути были выяснены путем прямого впрыска исследований с классической Трейсеры как BDA и фтор золото^{3,4,5,6,7 , 8}. Эти Трейсеры считаются золотой стандарт, но может иметь определенные недостатки, такие, как поглощение повреждения аксонов, или аксоны в проход в белого вещества, окружающих инъекции сайта^9,10,11 . Это может привести к неправильной интерпретации путь подключения и может быть недостаток в регенерации исследования где поглощение красителя поврежденные или отрезанные аксоны может быть ошибочно принято за регенерирующее волокна во время последующего анализа¹².

Лентивирусные векторы популярны в генной терапии исследований, поскольку они обеспечивают стабильные, долгосрочные выражение в нейрональных популяций^{13,14,,1516,17,18 ,19}. Тем не менее, традиционно упакованных лентивирусные векторы могут ограничили Ретроградная транспорта и может вызвать реакцию иммунной системы при использовании в естественных условиях^4,,2021. Высоко эффективная Ретроградная транспорта вектор называется HiRet был подготовлен по Kato et al., изменяя вирусный конверт с гликопротеин вирус бешенства для создания гибридных вектор, который улучшает Ретроградная транспорта^22,23.

Ретроградная трассировки представляет вектор в синаптических пространство целевого нейрона, позволяя ему быть принятые этой ячейки аксона и перевезены в клетки тела. Успешной перевозки HiRet была продемонстрирована из нейрональных синапсах в мозг мышей и приматов^23,24 и мышцы в двигательных нейронов²². Этот протокол демонстрирует инъекции в поясничного отдела спинного мозга, предназначенная специально для синаптических терминалы propriospinal интернейронов и нейронов мозга. ПНС получать соединения от многих различных путей спинного мозга и таким образом могут быть использованы для различных слоев населения нейронов спинного мозга и ствола мозга. Приклеенные этикетку нейронов в этом исследовании представляют цепей, иннервирующих мотонейрона бассейны, связанных с моторной функции задних конечностей. Надежной маркировки рассматривается в спинного мозга и ствола мозга, включая высокой четкости деталей дендритных беседки и аксон терминалов. Мы также использовали этот метод в предыдущих исследованиях в рамках шейного отдела спинного маркировать propriospinal и ствола мозга вставочные пути²⁵.

Этот протокол демонстрирует инъекции вирусный вектор в поясничного отдела спинного мозга крысы. Как видно в кино 1, разрез является мишенью для выявления L1 позвонка, расположенный у последнего ребра. Это используется в качестве хвостовой вехой для 3-4 см разрез, предоставляющий мускулатура через спинной мозг L1-L4. Laminectomies спинной аспектов T11-T13 позвонков, выполняются и скошенные стеклянные игла направлена 0,8 мм сбоку от средней линии и опустил 1,5 мм глубоко в сером веществе придать вирус.

протокол

Все следующие хирургические и животных ухода процедуры были одобрены Уход за животными и использование комитета университета Темпл.

1. предварительно хирургические препараты

1. Подготовьте вытащил стекла иглы для вирусных инъекций за несколько дней до операции, используя 3,5 nanoliter стекла капиллярные пипетки предназначены для nanoliter форсунок. Тяните каждый дозатор иглы съемник двухэтапный согласно инструкциям производителя для создания двух шаблонов иглы.
2. Уточните кончик иглы шаблонов, отрезав примерно 1-2 мм излишки стекла с microscissors. Мера приблизительное диафрагмы под микроскопом с калибровки микроскопа изолировать иглы с отверстиями 30-40 мкм.
3. С иглой, дислоцированные в 30° используйте микропипеткой beveller для создания подсказка с 30-40 мкм диафрагмы и скошенный угол 45°. Проверка ширины диафрагмы с нониуса масштаба на слайде калибровки. Пройти через стеклянный иглу с помощью шприца с насадкой гибкой иглой смыть мусора и Марк иглы на регулярной основе с черным маркером воды и этанола.
4. Иглы в крытой Петри, ранее очищен с 70% этанола и стерилизовать 30 мин в капюшоне биобезопасности под УФ светом.
5. Подготовка HiRet человека, удалив соразмерную громкость из холодильника непосредственно перед процедурой.
   Примечание: Соразмерную громкость включает суммы, необходимой для инъекций (1 мкл на инъекцию x количество инъекций) плюс небольшое количество дополнительного объема для учета закупорить и погрузка потерь. Перевозить и хранить вирус на льду когда не в пользе.
6. Подготовьте инжектор, подключить его в микронасосом и поместив его в микроманипулятор с нониуса масштаба.
7. Подготовить стеклянных иглу, тщательно загрузить цветной краситель например Красного масла с помощью шприца оснащен гибкой иглой. Убедитесь, что нет пузырьков остаются в иглу. Используйте асептические технику при обращении с иглой и воздерживаться от прикосновения кончика.
8. Вставить иглу стекла в инжектор, обеспечивающ что игла установлена правильно в шайбы, форсунки колпачок ввинчивается на жесткой, и стали инжектор иглу распространяется приблизительно на ¾ длины иглы стекла. Вирус может быть загружена в иглу на более позднем этапе.

2. анестезии и хирургических сайт подготовка

1. Вес животного на цифровой шкале. Запись предоперационное вес для определения объема необходимых анестетика и для контроля веса после хирургии. Самок Sprague-Dawley приблизительно 200 – 250 g использовались в настоящем Протоколе.
2. Анестезировать крыс с помощью изофлюрановая ингаляции или вводят раствора кетамина/Ксилазина (k / x). Здесь кетамин внутрибрюшинно вводили в 67 мг/кг и ксилазина в дозировке 6,7 мг/кг.
3. Подтвердите соответствующие анестетиков плоскости, щипать ноги твердо. Если рефлексивного выхода происходит, подождите несколько дополнительных минут, прежде чем продолжить.
   Примечание: Также наблюдать за усы, глаза и частота дыхания для признаков сознания. Если подергивания усы, глаз мигает, когда коснулся нежно, или дыхание быстрое и неглубокие, подождите, пока плоскости обезболивающий глубже приступить к протоколу. Также контролировать эти знаки на протяжении Ламинэктомия и инъекции хирургии. Если животное показывает мелкой обезболивающий плоскости, администрировать руля выстрел кетамин только равный ½ оригинальный k / x дозировки.
4. Бритье крыса вдоль спинной midline от бедра до нижнего угла лопатки. Потяните кожу животного тугой легче и более точного бритья.
5. Применить глазная мазь для обоих глаз.
6. Применяются антисептические бритая район для стерилизации на сайте. Для первого скраб Замочите марлевый стерильный раствор 5% йода и стереть прочь все волосы и мусор. Следить за этим с однонаправленной пальцем с стерильной марлей, пропитанной 70% этиловом спирте, таким образом, чтобы ни один район направляется дважды. Используйте эту же технику с чередующимися йода и этанола, пропитанной марлевые вдвое больше.

3. хирургического поля и инструмент подготовки

1. Подготовьте набор газобетона хирургических инструментов, которые включают скальпель, rongeurs, Крысиный зуб щипцы, Весна ножницы, hemostats, средней точки Изогнутый пинцет и ретракторы или взвешенных крюки развертки стерильных обертывание для создания поля, стерильный.
2. Откройте пакет стерильные хирургические перчатки и поместите обернуть стерильных перчаток на столе. Используйте это в качестве дополнительного стерильные поля для используемых инструментов для предотвращения загрязнения запасов стерильных wrap.
3. Перетащите поле стерильным лезвием скальпеля #10. Закрепите лезвие на ручку с hemostats. Позиция стерильного физиологического раствора, 4.0 Хромовой Кетгуд шов и материалы для контроля кровотечения, таких как cauterizer, стерильную марлю, стерильным ватным наконечником аппликаторы (для мышц кровоточит), или gelfoam или bonewax (для костей кровоточит) в доступном месте.
4. Получить животных и установите его на стерильной тканью. Поместите марлю под мочевого пузыря для сбора мочи. Подпирать целевой области с проката полотенце под живот. Если возможно, место хирургические грелку под стерильной тканью, особенно для больше процедур.
   Примечание: Бесплодие имеет важное значение во время хирургии выживания. Держите бутылку спрей под рукой, чтобы поддерживать стерильность перчатках, и использование бисера стерилизатор если стерильность инструмента компрометации, или между отдельными операций на 70% спирте.

4. выявление позвоночника и выявления Ламинэктомия сайт

1. Определите области, где разрез кожи будут приниматься путем нажатия пальцами нежно последнего ребра найти L1 позвонка. Используя это в качестве ориентира, делают разрез кожи 3-4 см с #10 хирургическим скальпелем заканчивается просто уступает L1 подвергать мышцы. Придерживайте кожу подтянутой распространяя нежный и зафиксируйте с лезвием скальпеля для обеспечения чистого разреза.
2. Вырезать и распространение поверхностный жир с щипцы и ножницы, в случае необходимости. (В зависимости от целевой позвонка, там может быть или не быть большой жировой ткани, поверхностные мышцы).
3. Почувствовать остистого отростка с плоским лезвием скальпеля или палец. Часто будет озвучена срединная область «V» белый фасции с обеих сторон. Сделайте небольшой надрез ростральной разрешить обслуживание надежно ухватиться верхней процесс пинцетом крысиный зуб, а затем сделать 2 длинные, глубокие порезы как можно ближе к процессы как можно скорее. В глубокой точке разреза спинной поверхности позвонков может ощущаться с лезвием скальпеля.
4. Держите боковые мышцы сторону с ретракторы или взвешенных крючки для улучшения видимости. Четкие мышцы вокруг процессов с скальпель, Весна ножницы или rongeurs чтобы определить форму головы.
   Примечание: Помните, что спинного мозга не распространяется полная длина позвоночника, как спинного тканей останавливается растет ранее в развитии чем кости. Это означает, что целевой уровень спинного мозга могут быть под по-разному именем позвонка.
5. Найдите T11 и смежные процессы T12 и T13.
   Примечание: Помощь в ориентации правильные позвоночного уровня можно найти в Атлас спинного мозга крыс и предыдущих исследований, описанием достопримечательностей в мышь, которая имеет очень похожи позвоночных структура^6,33. Оставьте ростральной остистого отростка, например T9 спокойно дать ориентир срединной линии.

5. выполнение Ламинэктомия

1. После того, как был правильно определен целевой области, выполняют laminectomies спинной аспектов T11-T13. Аккуратно распространение позвонков раскрыть межпозвонковых связок, которые являются хорошие сайты для вставки rongeurs для первоначального укус кости. Держите rongeurs в положении, полузакрытыми, увеличить штраф контроль.
2. Удаление остистого отростка и спинной позвонок, принимая небольшие закуски с rongeurs. Будьте осторожны, чтобы не повредить спинной мозг или нарушить Дура. Слегка приподнимите пинцетом зуб крысы, чтобы помочь вытащить спинного мозга от позвонков и уменьшить тенденцию к хит спинного тканей.
3. Убрать кости от средней линии так, что может наблюдаться срединной кровеносного сосуда. Оставьте окно, которое ясно показывает ткани спинного мозга и мусора.
4. Нежно коснуться спинного мозга с щипцами. Некоторые животные могут рефлекторно прыгать, даже если их обезболивающий самолет глубоко. Нанести несколько капель онемение агента как лидокаин непосредственно на спинной мозг для предотвращения прыжки во время процедуры инъекции.
5. Закрепите животного в спинномозговой держатель крепления стабилизирующим щипцы для остистого отростка ростральной и каудально к окну Ламинэктомия. Поднимите брюшке животного с помощью держателя позвоночника инвертировать эффект дыхательных движений. Это увеличит иглы стабильности и обеспечения соответствующей глубины инъекций.

6. Загрузка вируса и позиционирование инжектор

1. Загрузить вирус в инжектор, закупорить приблизительно 5 мкл на кусок парафина и позиционирования иглы, таким образом, чтобы кончик внутри падение.
2. Используйте микронасосом снять до 4 мкл вируса со скоростью 20 – 100 nL/сек.
3. Установите контроллер инъекционные и выпустить небольшое количество вируса от иглы, чтобы убедиться, что кончик иглы не блокируется. Стереть избыток вируса Лаборатория салфеткой.
   Примечание: Гамильтон шприц с иглой стальной может использоваться как альтернатива вытащил стеклянной пипетки.
4. Поместите микроманипулятор так, что видна нониуса масштаба и положение иглы в средней линии спинного мозга.
   Примечание: Midline иногда может быть расположен на большой кровеносный сосуд на передней поверхности спинного мозга. Однако это может варьироваться в отдельных крыс, и ориентации срединной линии должны быть подтверждены по сравнению с нетронутыми остистого отростка.
5. Прямые иглы боково на 0,8 мм, используя нониуса масштаба на микроманипулятор.
6. Опустите иглу в спинном до тех пор, пока это отступов, но не прокола, дура. Используя быстрый вращательные движения, прокол дура с иглой, до тех пор, пока она упала на глубину 1,5 мм.

7. инъекции вируса в спинного мозга

1. Когда игла находится в месте, программа инжектор впрыснуть в размере 400 нл/мин подтвердить что вирус вступает спинного мозга, наблюдая прогресс краситель фронта. Там должно быть без очевидных утечки или выпячивание тканей спинного мозга. Если наблюдается утечки, это иногда может быть уменьшена путем уменьшения скорости впрыска до 200 nL/мин.
2. По окончании инъекции позволяют иглы на отдых в спинном мозге для 2-5 мин (в зависимости от объёма инъекции) для облегчения распространения вируса.
3. Медленно снять иглу и перейти на следующий сайт инъекции. Inject 1 мкл вируса в каждой из 6 сайтов равномерно около 1 мм друг от друга по длине L1-L4 позвоночника ткани. Той же иглой может использоваться для каждой инъекции, пока он продолжает функционировать должным образом.

8. Закрытие и послеоперационный уход за ранами

1. Удалите животное из держателя позвоночника и вывезти ретракторы или крючки, используемые для распространения боковые мышцы. Убедитесь, что раны ясно все мусора перед закрытием.
2. Шов мышц с помощью 4.0 Хромовой Кетгуд швов. Вырежьте шовные потоков вблизи узел для уменьшения вероятности раздражения внутренних кожи.
3. Сшивание кожи закрыты с использованием 9-мм раны клипы. Чтобы разрешить для оптимального лечения, линия до края кожи до сшивания.
4. Поместите животное на воде конвекции потепление площадку и монитор до бодрствующем.
5. Придать 5 – 10 мл стерильного физиологического раствора подкожно для пополнения жидкости и антибиотик например Цефазолин для предотвращения инфекции. Когда животное амбулаторно, поместите его обратно в свои дома клетке и обеспечить первоначальный анальгетиков.  Контролировать крыс для любого знака боли и страданий и лечить согласно вашей IACUC утверждения процедуры для облегчения боли.

Результаты

Успешное инъекций и транспорта вирусный вектор должно привести к трансдукции надежные населения односторонних нейронов спинного мозга и в некоторых ядрах ствола головного мозга. Рисунок 1 демонстрирует, стереотипные маркировки нейронов и аксоны в грудного ...

Обсуждение

Генетические манипуляции нейронов в головном и спинном служил для выделения чувств, мотор и вегетативная пути через флуоресцентные трассировки и исследовать потенциал отрастания нейрональных участки после травмы^{27,28, 29 ,}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections.
10mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309604	For injecting saline into the animal, post-surgery.
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility.
Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Antibiotic (Cefazolin)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	To seal up bone in the case of bone bleeding.
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00	To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Gelfoam	Pfizer	H68079	To seal up bone in the case of bone bleeding.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.
Hair Clippers	Oster	111038-060-000	For clearing the surgical site of hair.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Kimwipes	Kimtech	34155	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
Ophthalamic Ointment	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	To protect the animal's eyes during surgery.
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rimadyl Tablets	Bio Serv	MP275-050	For pain management post-surgery.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Stainless Steal Wound Clips	CellPoint	201-1000	To bind the skin of the surgical wound during closing.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
T/Pump Heat Therapy Water Pump	Gaymar	TP500C	To pump warm water into the water convection warming pad.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.