Iniezione diretta di un vettore lentivirale evidenzia più vie motorie del midollo spinale del ratto

Riepilogo

Questo protocollo dimostra iniezione di un vettore virale retrogradely trasportabile nel tessuto del midollo spinale del ratto. Il vettore è preso alla sinapsi e trasportato al corpo cellulare dei neuroni bersaglio. Questo modello è adatto per l'analisi retrograda di importanti vie spinali o cellule targeting per applicazioni di terapia genica.

Abstract

L'introduzione di proteine di interesse nella cellule nel sistema nervoso è impegnativo a causa delle barriere biologiche innate che limitano l'accesso alla maggior parte delle molecole. Iniezione direttamente nel tessuto del midollo spinale ignora queste barriere, fornendo accesso ai corpi cellulari o sinapsi dove molecole possono essere incorporati. Combinando la tecnologia di vettore virale con questo metodo consente di introduzione di geni bersaglio in tessuto nervoso ai fini della terapia genica o la traccia del tratto. Qui un virus progettato per trasporto retrogrado altamente efficiente (HiRet) è stato introdotto alle sinapsi di interneuroni propriospinal (PNs) per incoraggiare il trasporto specifico ai neuroni nel midollo spinale e dei nuclei del tronco cerebrale. Targeting PNs sfrutta le numerose connessioni che ricevono da vie del motore come i tratti nucleo e reticulospinal, nonché la loro interconnessione con a vicenda durante segmenti del midollo spinale. Rappresentante l'analisi utilizzando il vettore HiRet con dettagli di alta fedeltà spettacoli costitutivamente attiva proteina fluorescente verde (GFP) di corpi cellulari, assoni e pergole dendritiche in PNs toracica e in neuroni di reticulospinal nella formazione reticolare di Pontina. HiRet incorpora bene nella vie del tronco cerebrale e PNs ma mostra età dipendente integrazione nei neuroni del tratto corticospinale. In sintesi, l'iniezione del midollo spinale usando vettori virali è un metodo adatto per introduzione di proteine di interesse in neuroni dei tratti mirati.

Introduzione

Vettori virali sono importanti strumenti biologici che possono introdurre materiale genetico nelle cellule al fine di compensare i geni difettosi, proteine di sovraregolare l'importante crescita o fabbricare proteine marker che mettono in risalto la struttura e le connessioni sinaptiche del loro obiettivi. Questo articolo si concentra su iniezione diretta di un vettore lentivirale retrogradely trasportabile altamente efficiente nel midollo spinale del ratto al fine di evidenziare le principali vie del motore con l'analisi fluorescente.  Questo metodo è anche molto adatto per studi di rigenerazione e la ricrescita assonali per introdurre le proteine di interesse in diverse popolazioni di neuroni ed è stato utilizzato per mettere a tacere i neuroni per mappatura funzionale studi^1,2.

Molti dei dettagli anatomici delle vie motorie spinali sono stati chiariti attraverso studi di iniezione diretta con traccianti classici quali BDA e fluoro-oro^{3,4,5,6,7 , 8}. tali rivelatori sono considerati il gold standard ma possono avere alcuni svantaggi come l'assorbimento dagli assoni danneggiati, o assoni in passaggio nella materia bianca che circonda un'iniezione sito^9,10,11 . Questo potrebbe portare a errate interpretazioni della connettività via e può essere uno svantaggio negli studi di rigenerazione dove assorbimento della tintura da assoni danneggiati o mozzati potrebbe essere scambiato per la rigenerazione delle fibre durante la successiva analisi¹².

Vettori lentivirali sono popolari in studi di terapia genica, in quanto forniscono espressione stabile, a lungo termine in popolazioni neuronali^{13,14,15,16,17,18 ,19}. Tuttavia, tradizionalmente confezionati vettori lentivirali può avere limitata trasporto retrogrado e può innescare la risposta del sistema immunitario quando utilizzato in vivo^4,20,21. Un vettore di trasporto retrogrado efficiente chiamato HiRet è stato prodotto da Kato et modificando la busta virale con una glicoproteina del virus di rabbia per creare un vettore di ibrido che migliora il trasporto retrogrado^22,23.

Analisi retrograda introduce un vettore nello spazio sinaptico di un neurone bersaglio, permettendo così di essere ripreso da assone di tale cella e trasportati al corpo cellulare. Trasporto di successo di HiRet è stata dimostrata da sinapsi neuronali nel cervello di topi e primati^23,24 e dal muscolo nei motoneuroni²². Questo protocollo dimostra iniezione nel midollo spinale lombare, specificamente destinati i terminali sinaptici di propriospinal interneuroni e neuroni del tronco cerebrale. PNs ricevere connessioni da molte diverse vie spinali e quindi può essere utilizzato per indirizzare una popolazione diversificata di neuroni nel midollo spinale e del tronco cerebrale. Neuroni identificati in questo studio rappresentano circuiti che innervano motoneurone piscine relative alla funzione motoria hindlimb. Etichettatura robusto è visto nel midollo spinale e del tronco cerebrale, compresi i dettagli ad alta fedeltà di pergolati dendritiche e terminali assonici. Abbiamo anche utilizzato questo metodo negli studi precedenti all'interno del midollo spinale cervicale per etichettare propriospinal e del tronco cerebrale reticulospinal vie²⁵.

Questo protocollo dimostra l'iniezione di un vettore virale nel midollo spinale lombare di un ratto. Come si vede nel film 1, l'incisione è mirata individuando la vertebra L1 che si trova presso l'ultima costola. Viene utilizzato come punto di riferimento caudale per un'incisione di 3-4 cm che espone la muscolatura sopra la colonna vertebrale L1-L4. Laminectomies degli aspetti dorsali delle vertebre T11-T13 vengono eseguite e un ago di vetro smussato è diretto 0.8 mm laterale dalla linea mediana e abbassato 1,5 mm profondità nella materia grigia per iniettare il virus.

Protocollo

Tutte le seguenti procedure di cura chirurgica e animale sono state approvate dalla cura degli animali e uso Comitato della Temple University.

1. pre-operatoria preparazioni

1. Preparare il vetro tirato aghi per iniezione virale pochi giorni prima dell'intervento chirurgico utilizzando pipette capillari 3,5 in vetro nanolitro progettati per nanolitro iniettori. Tirare ogni pipetta un estrattore di ago in due fasi secondo le istruzioni del produttore per creare due modelli di aghi.
2. Affinare la punta dei modelli dell'ago con il taglio da circa 1-2 mm di vetro in eccesso con microforbici. Misura approssimativa apertura dimensioni sotto un microscopio con un vetrino di calibrazione per isolare gli aghi con aperture di 30-40 µm.
3. Con l'ago posizionato a 30°, è possibile utilizzare una Smussatrice micropipetta per creare una punta con un'apertura di 30-40 µm e un angolo di smusso di 45°. Verificare la larghezza di apertura con la scala del nonio su vetrino di calibrazione. Passare acqua ed etanolo attraverso l'ago di vetro usando una siringa con un allegato di ago flessibile per lavare via i detriti e contrassegnare l'ago a intervalli regolari con un pennarello nero.
4. Posizionare gli aghi in un piatto coperto di Petri precedentemente puliti con etanolo al 70% e sterilizzare per 30 min in una cappa di biosicurezza ai raggi UV.
5. Preparare dei lentivirus HiRet rimuovendo un volume idoneo dal freezer immediatamente prima della procedura.
   Nota: Un volume idoneo include l'importo necessario per l'iniezione (1 µ l per iniezione x numero di iniezioni) più una piccola quantità di volume in più per tenere conto per il pipettaggio e perdite di carico. Trasportare e conservare il virus su ghiaccio quando non in uso.
6. Preparare l'iniettore inserendolo la micropompa e mettendoli in un micromanipolatore con scala Vernier.
7. Per preparare l'ago di vetro, accuratamente caricare una tintura colorata come olio rosso con una siringa provvisti di un ago flessibile. Garantire che nessun bolle rimangono nell'ago. Usare una tecnica asettica quando si maneggia l'ago e astenersi dal toccare la punta.
8. Inserire l'ago di vetro l'iniettore, assicurando che l'ago sia inserita correttamente nelle rondelle, iniettore è chiusa con il tappo stretto e ago dell'iniettore in acciaio si estende approssimativamente ¾ della lunghezza dell'ago di vetro. Virus possono essere caricati nell'ago in un passaggio successivo.

2. anestesia e preparazione del sito chirurgico

1. Pesare l'animale su una bilancia digitale. Registrare il peso pre-operatorio per determinare il volume di anestetico richiesto e per consentire il monitoraggio di peso post-chirurgia. Ratti Sprague-Dawley femminili circa 200 – 250 g sono stati usati in questo protocollo.
2. Anestetizzare il ratto tramite inalazione isoflurane o una soluzione di chetamina/xilazina iniettata (k / x). Qui, la ketamina è iniettato intraperitonealmente a 67 mg/kg e xilazina ad un dosaggio di 6,7 mg/kg.
3. Confermare un appropriato piano di anestetico pizzicando il piede saldamente. In caso di ritiro riflessivo, attendere alcuni minuti supplementari prima di procedere.
   Nota: Osservare anche i baffi, gli occhi e tasso di respirazione per segni di coscienza. Se i baffi sono spasmi muscolari, l'occhio lampeggia quando viene toccato delicatamente o respirazione è rapido e superficiale, attendere fino a quando il piano di anestetico è più profondo di procedere con il protocollo. Inoltre monitorare questi segni in tutta la chirurgia di laminectomy e iniezione. Se l'animale Visualizza un piano superficiale di anestetico, amministrare un booster shot di sola ketamina uguale a ½ l'originale k / x dosaggio.
4. Radere il ratto lungo la linea mediana dorsale dai fianchi fino all'angolo inferiore delle scapole. Tendere la pelle dell'animale per una rasatura più facile e precisa.
5. Applicare unguento oftalmico in entrambi gli occhi.
6. Applicare antisettico per zona rasata per sterilizzare il sito. Per la prima macchia, bagnare garze sterili con una soluzione di 5% di iodio e pulisca via tutti i capelli e detriti. Seguire questo con uno swipe unidirezionale con garza sterile imbevuta di etanolo al 70%, in modo che nessuna zona è contattata due volte. Utilizzare questa stessa tecnica con alternanza di iodio e garza imbevuta di etanolo di altre due volte.

3. preparazione di campo e strumento chirurgica

1. Preparare un set di strumenti chirurgici sterilizzati nell'autoclave che includono un bisturi, Pinze ossivore, ratto dente pinze, forbici di primavera, emostatiche, punto medio curvata forcipe e divaricatori o ganci ponderate di scartare l'involucro sterile per creare un campo sterile.
2. Aprire un pacchetto di guanti chirurgici sterili e posizionare l'involucro sterile guanto sul tavolo. Utilizzare questo come un campo sterile supplementare per gli strumenti utilizzati per prevenire la contaminazione dell'involucro sterile.
3. Lasciar cadere una lama per bisturi #10 sul campo sterile. Fissare la lama ad un manico con emostatiche. Soluzione salina sterile posizione, 4,0 catgut cromico sutura e materiali per controllare lo spurgo come un cauterizzatore, garza sterile, applicatori di cotone con punta sterili (per le sbavature del muscolo), o gelfoam o bonewax (per le sbavature dell'osso) in un luogo accessibile.
4. Recuperare l'animale e impostarlo su un panno sterile. Posizionare la garza sotto la vescica per raccogliere l'urina. Puntellare l'area di destinazione con un asciugamano arrotolato sotto l'addome. Se disponibile, posto un rilievo di riscaldamento chirurgico sotto il panno sterile, soprattutto per le procedure più lunghe.
   Nota: La sterilità è importante durante la chirurgia di sopravvivenza. Tenere una bottiglia dello spruzzo di etanolo al 70% a disposizione per mantenere la sterilità delle mani guantate e uno sterilizzatore di perlina di uso se è stata compromessa la sterilità dello strumento, o tra singoli interventi chirurgici.

4. esponendo la colonna vertebrale e identifica il sito di laminectomia

1. Identificare l'area in cui un'incisione della pelle verrà effettuata premendo delicatamente le dita presso l'ultima costola per individuare la vertebra L1. Usando questo come un punto di riferimento, fare un'incisione cutanea di 3-4 cm con un bisturi chirurgico #10 termina appena inferiore a L1 per esporre il muscolo. Tendete la pelle delicata diffondendo e premere con forza con la lama del bisturi per garantire un'incisione pulita.
2. Tagliare e diffondere il grasso superficiale con pinze e le forbici se necessario. (A seconda sulla vertebra di destinazione, ci può o non essere un grande rilievo grasso superficiale al muscolo).
3. Sento per i processi spinous con il piatto della lama bisturi o un dito. Spesso la zona del midline sarà delineata da una "V" della fascia bianca su entrambi i lati. Fare un piccolo taglio rostrale per consentire di afferrare saldamente su un processo superiore con il forcipe di ratto del dente, poi fare 2 lunghi, profondi tagli più vicino i processi possibili. Il punto più profondo del taglio, la superficie dorsale delle vertebre può essere sentita con il bisturi.
4. Tenere i muscoli laterali da parte con divaricatori o ponderate ganci per migliorare la visibilità. Muscolare chiaro circa i processi con un bisturi, forbici di primavera o Pinze ossivore per determinare la forma delle loro teste.
   Nota: Ricordare che il midollo spinale non si estende l'intera lunghezza della colonna vertebrale, come le fermate di tessuto del midollo spinale prima nello sviluppo di osso in crescita. Ciò significa che il livello spinale di destinazione potrebbe essere sotto una vertebra diversamente denominata.
5. Individuare il T11 e i processi di T12 e T13 adiacenti.
   Nota: Assistenza di mira i corretti livelli vertebrali è reperibile in un Atlante di midollo spinale del ratto e gli studi precedenti che delinea luoghi d'interesse al mouse, che ha una molto simile struttura vertebrale^6,33. Un processo spinous rostrale come T9. lasciare riposare per dare un punto di riferimento del midline.

5. esecuzione di una laminectomia

1. Una volta identificata correttamente l'area di destinazione, eseguire i laminectomies degli aspetti dorsali di T11-T13. Delicatamente e diffondere le vertebre per rivelare legamenti intervertebrali, che sono buoni siti per inserire Pinze ossivore per il morso iniziale dell'osso. Tenere le Pinze ossivore in grado di aumentare il controllo fine chiusa a metà.
2. Rimuovere i processi spinous e funzione dorsale delle vertebre prendendo piccoli morsi con le Pinze ossivore. Fare attenzione a non danneggiare il midollo spinale o disturbare la dura madre. Sollevare leggermente con il forcipe del dente di ratto per contribuire a tirare il midollo spinale dalle vertebre e diminuire la tendenza a colpire il tessuto del midollo spinale.
3. Sgombrare il campo dell'osso dalla linea mediana affinché il linea mediana del vaso sanguigno possono essere osservato. Lasciare una finestra che chiaramente Mostra il tessuto del midollo spinale ed è privo di detriti.
4. Toccare delicatamente il midollo spinale con il forcipe. Alcuni animali possono riflessivamente saltare, anche se il loro aereo anestetico è profondo. Applicare alcune gocce di un agente paralizzante come la lidocaina direttamente al midollo spinale per evitare di saltare durante la procedura di iniezione.
5. Fissare l'animale in un supporto spinale di fissaggio stabilizzante forcipe ai processi spinous rostrali e caudali alla finestra laminectomia. Sollevare l'addome dell'animale usando il titolare spinale per negare l'effetto di movimenti di respirazione. Ciò aumenterà la stabilità dell'ago e garantire adeguata profondità di iniezione.

6. caricamento virus e posizionamento dell'iniettore

1. Caricare virus nell'iniettore di pipettaggio circa 5 µ l su un pezzo di parafilm e posizionare l'ago in modo che la punta è dentro la goccia.
2. Utilizzare la micropompa per prelevare fino a 4 µ l di virus ad un tasso di 20 – 100 nL/s.
3. Impostare il controller per iniettare e rilasciare una piccola quantità di virus dall'ago affinché che la punta dell'ago non sia ostruita. Eliminare virus in eccesso con un panno da laboratorio.
   Nota: Una siringa Hamilton con un ago d'acciaio può essere utilizzata come alternativa alle pipette in vetro tirato.
4. Posizionare il micromanipolatore, in modo che la scala del nonio è visibile e posizionare l'ago al midline del midollo spinale.
   Nota: La linea mediana può trovarsi a volte da un grande vaso sanguigno in esecuzione sulla superficie anteriore del midollo spinale. Tuttavia, questo può variare in ratti individuali e il targeting del midline dovrebbe essere confermato dal confronto con un processo spinous intatto.
5. Dirigere l'ago lateralmente da 0,8 mm utilizzando la scala di Vernier il micromanipolatore.
6. Abbassare l'ago al midollo spinale fino al rientro, ma non perforare, la dura madre. Con un rapido movimento rotatorio, la puntura dura con l'ago fino a quando ha affondato ad una profondità di 1,5 mm.

7. iniettare il virus nel midollo spinale

1. Una volta che l'ago è in posizione, programma l'iniettore per iniettare a una velocità di 400 nL/min., a conferma che il virus sta entrando il midollo spinale di osservare l'andamento della parte anteriore di tintura. Ci dovrebbe essere nessuna perdita evidente o rigonfiamento del tessuto del midollo spinale. Se la perdita è osservata, a volte possono essere alleviato riducendo la velocità di iniezione di 200 nL/min.
2. Una volta terminata l'iniezione, consentire l'ago riposare nel midollo spinale per 2 – 5 min (a seconda del volume iniettato) per facilitare la diffusione del virus.
3. Lentamente, ritirare l'ago e spostare il prossimo sito di iniezione. Iniettare 1 µ l di virus in ognuno dei 6 siti uniformemente spaziati circa 1 mm di distanza lungo la lunghezza del tessuto spinale L1-L4. L'ago stesso può essere utilizzato per ogni iniezione, purché continui a funzionare correttamente.

8. cura di chiusura e post-operatorio della ferita

1. Rimuovere l'animale dal titolare spinale ed estrarre divaricatori o ganci utilizzati per diffondere il muscolo laterale. Assicurarsi che la ferita sia libera da tutti i detriti prima della chiusura.
2. Suturare il muscolo utilizzando una sutura 4.0 catgut cromico. Tagliate i fili di sutura vicino il nodo per ridurre il rischio di irritazione della pelle interna.
3. Fiocco la pelle chiusa utilizzando clip 9 mm della ferita. Per consentire una guarigione ottimale, allineare i bordi della pelle prima di pinzatura.
4. Metti l'animale su una convezione di acqua riscaldamento pad e monitor fino a quando il vigile.
5. Iniettare 5 – 10 mL di soluzione fisiologica sterile per via sottocutanea per reintegrare i liquidi e un antibiotico come cefazolin per prevenire l'infezione. Quando l'animale è ambulatorio, inserirlo indietro nella sua gabbia a casa e fornire analgesici iniziali.  I ratti di qualsiasi segno di dolore e l'angoscia di monitorare e trattare secondo la procedura IACUC approvato per alleviamento di dolore.

Risultati

Iniezione di successo e di trasporto del vettore virale dovrebbe comportare di trasduzione di una popolazione robusta dei neuroni unilaterale nel midollo spinale ed in alcuni nuclei del tronco cerebrale. Figura 1 di seguito viene illustrato l'etichettatura stereotipata dei neuroni ed assoni nel midollo spinale toracico e nella formazione reticolare Pontina del tronco cerebrale ad post-iniezione quattro settimane. Espressione significativa di GFP è visto in neuroni in mat...

Discussione

Manipolazione genetica dei neuroni nel cervello e nel midollo spinale è servito ad evidenziare sensoriali, motorie e autonomiche vie tramite l'analisi fluorescente e di esplorare il potenziale di ricrescita dei tratti neuronale dopo lesione^{27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33}. diretto iniezione di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections.
10mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309604	For injecting saline into the animal, post-surgery.
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility.
Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Antibiotic (Cefazolin)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	To seal up bone in the case of bone bleeding.
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00	To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Gelfoam	Pfizer	H68079	To seal up bone in the case of bone bleeding.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.
Hair Clippers	Oster	111038-060-000	For clearing the surgical site of hair.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Kimwipes	Kimtech	34155	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
Ophthalamic Ointment	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	To protect the animal's eyes during surgery.
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rimadyl Tablets	Bio Serv	MP275-050	For pain management post-surgery.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Stainless Steal Wound Clips	CellPoint	201-1000	To bind the skin of the surgical wound during closing.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
T/Pump Heat Therapy Water Pump	Gaymar	TP500C	To pump warm water into the water convection warming pad.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.