Injeção direta de um vetor de Lentivirus destaca várias vias motoras na medula espinhal de ratos

Resumo

Este protocolo demonstra a injeção de um vetor viral retrogradely transportável em tecido de medula espinhal de ratos. O vetor é tomado no sinapse e transportado para o corpo celular dos neurônios do alvo. Este modelo é apropriado para rastreamento retrógrado de importantes vias da coluna vertebral ou células alvos para aplicações da terapia de gene.

Resumo

Introdução de proteínas de interesse em células do sistema nervoso é um desafio devido às barreiras biológicas inatas que limitam o acesso à maioria das moléculas. Injeção diretamente no tecido da medula espinhal ignora estas barreiras, fornecendo o acesso aos corpos celulares ou sinapses onde moléculas podem ser incorporadas. Combinando a tecnologia de vetor viral com este método permite a introdução de genes-alvo no tecido nervoso, com a finalidade de terapia genética ou rastreamento de trato. Aqui um vírus projetado para o transporte retrógrado altamente eficiente (HiRet) é introduzido nas sinapses dos interneurônios propriospinal (PNs) para incentivar o transporte específico de neurônios na medula espinhal e núcleos do tronco cerebral. Direcionamento de PNs tira proveito das inúmeras conexões que recebem de vias motoras como o trato rubrospinal e reticulospinal, bem como a sua interligação com os outros ao longo de segmentos da medula espinhal. Representante rastreamento usando o vetor de HiRet com constitutivamente ativo proteína verde fluorescente (GFP) mostra detalhes de alta fidelidade de corpos celulares, axônios e mandris dendríticas no PNs torácicas e nos neurônios reticulospinal na formação reticular Pontinas. HiRet incorpora bem em vias no tronco cerebral e PNs mas mostra integração dependente de idade nos neurônios do trato corticoespinhal. Em resumo, a medula espinhal injeção usando vetores virais é um método adequado para a introdução de proteínas de interesse em neurônios de extensões específicas.

Introdução

Vetores virais são importantes ferramentas biológicas que podem introduzir material genético em células a fim de compensar os genes defeituosos, proteínas de crescimento importante upregulate ou fabricar proteínas marcador que destacam a estrutura e as conexões sinápticas de seus alvos. Este artigo enfoca a injeção direta de um vetor de Lentivirus retrogradely transportável altamente eficiente para a medula espinhal de ratos a fim de destacar os principais vias motoras com rastreamento fluorescente.  Esse método também é altamente adequado para estudos de regeneração e crescimento axonal introduzir proteínas de interesse em diversas populações de neurônios e tem sido usado para silenciar os neurônios para estudos de mapeamento funcional^1,2.

Muitos dos detalhes anatômicos das vias motoras da coluna vertebral foram elucidados através de estudos de injeção direta com marcadores clássicos como BDA e fluoro-ouro^{3,4,5,6,7 , 8}. estes marcadores são considerados padrão-ouro, mas podem ter alguns inconvenientes tais como captação por axônios danificados ou axônios na passagem na substância branca em torno de uma injeção local de^9,10,11 . Isto poderia levar a interpretações incorrectas de conectividade via e pode ser uma desvantagem em estudos de regeneração onde a absorção de corante por axônios danificados ou cortados poderia ser confundida com regenerar fibras durante a posterior análise¹².

Vetores de Lentivirus são populares em estudos de terapia de gene, que proporcionam uma expressão estável, a longo prazo em populações neuronal^{13,14,15,16,17,18 ,19}. No entanto, tradicionalmente embalados vetores Lentivirus pode ter limitado transporte retrógrado e podem desencadear a resposta do sistema imunológico quando usado na vivo^4,20,21. Um vetor de transporte retrógrado altamente eficiente, denominado HiRet foi produzido por Kato et al., modificando o envelope viral com uma glicoproteína do vírus da raiva para criar um vetor de híbrido que melhora o transporte retrógrado^22,23.

Rastreamento retrógrado introduz um vetor no espaço sináptico de um neurônio alvo, permitindo que ele seja retomado pelo axônio da célula que e transportados para o corpo celular. Transporte bem sucedido de HiRet foi demonstrada de sinapses neuronais no cérebro de ratos e primatas^23,24 e do músculo em neurônios motores²². Este protocolo demonstra injeção na medula espinhal lombar, alvejando especificamente os terminais sinápticos dos propriospinal interneurônios e neurônios do tronco cerebral. PNs recebem conexões de muitos diferentes caminhos da coluna vertebral e, assim, podem ser utilizados para atingir uma população diversa de neurônios na medula espinhal e tronco cerebral. Rotulada de neurônios neste estudo representam circuitos que inervam o neurônio motor piscinas relativas a função motora do membro posterior. Etiquetando robusto é visto na medula espinhal e tronco cerebral, incluindo detalhes de alta fidelidade de mandris dendríticas e axônio terminal. Também usamos este método em estudos anteriores no interior da medula espinhal cervical para rotular propriospinal e tronco cerebral reticulospinal vias²⁵.

Este protocolo demonstra a injeção de um vetor viral na medula espinhal lombar de um rato. Como visto no filme 1, identificando a vértebra L1 localizada da última costela, destina-se a incisão. Isso é usado como um marco de caudal para uma incisão de 3-4 cm que expõe a musculatura ao longo da medula espinhal de L1-L4. Laminectomies dos aspectos dorsais das vértebras T11-T13 são executadas e uma agulha de vidro chanfrado é dirigida a 0.8 mm lateral da linha média e baixou 1,5 mm profundamente na matéria cinzenta para injetar o vírus.

Protocolo

Todos os procedimentos de cuidados cirúrgicos e animais a seguir foram aprovados pelo Animal cuidados e uso Comitê da Temple University.

1. pré-cirúrgicas preparações

1. Prepare-se agulhas de vidro puxado para injeção viral alguns dias antes da cirurgia usando 3,5 nanolitros capilar pipeta de vidro projetada para injetores de nanolitros. Puxe cada pipeta um puxador de agulha de duas etapas de acordo com as instruções do fabricante para criar dois modelos de agulha.
2. Refine a dica dos modelos de agulha cortando aproximadamente 1-2 mm do excesso de vidro com micro-tesouras. Tamanho de abertura aproximada de medida sob um microscópio com uma lâmina de microscópio de calibração para isolar as agulhas com aberturas de 30-40 µm.
3. Com a agulha posicionada em 30°, use um chanfrador micropipeta para criar uma ponta com um 30-40 µm abertura e um ângulo de 45° chanfrada. Verifique se a largura de abertura com a escala Vernier do slide de calibração. Passe água e etanol através da agulha de vidro usando uma seringa com um acessório de agulha flexível para lavar os restos e marcar a agulha em intervalos regulares com um marcador preto.
4. Coloque as agulhas em um prato coberto de Petri previamente limpado com 70% de etanol e esterilizar por 30 min em uma capa de biossegurança sob luz UV.
5. Prepare HiRet lentivirus removendo um volume adequado do freezer imediatamente antes do procedimento.
   Nota: Um volume adequado inclui a quantidade necessária para a injeção (1 µ l por injecção x número de injeções) e mais uma pequena quantidade de volume extra para dar conta pipetagem e perdas de carga. Transportar e armazenar o vírus no gelo quando não estiver em uso.
6. Prepare o injector, conectá-lo à microbomba e colocá-lo em um micromanipulador com escala Vernier.
7. Para preparar a agulha de vidro, com cuidado, carregar um corante colorido como óleo vermelho com uma seringa, equipado com uma agulha flexível. Certifique-se de que não há bolhas permanecem na agulha. Utilizar técnica asséptica ao manusear a agulha e abster-se de tocar a ponta.
8. Insira a agulha de vidro o injector, garantindo que a agulha está encaixada corretamente para as anilhas, tampa do injector é na apertadas e estende-se a agulha de aço injector aproximadamente ¾ do comprimento da agulha vidro. Vírus podem ser carregado na agulha em uma etapa posterior.

2. anestesia e preparação do local cirúrgico

1. Pese o animal em uma balança digital. Registro do peso pré-operatório para determinar o volume de anestésico necessário e para permitir o acompanhamento do pós-operatório de peso. Femininos ratos Sprague-Dawley cerca de 200 – 250 g foram utilizados no presente protocolo.
2. Anestesiar o rato usando uma solução de xilazina/cetamina injetada ou inalação de isoflurano (k / x). Aqui, a cetamina é injetada intraperitonealmente em 67 mg/kg de xilazina com uma dose de 6,7 mg/kg.
3. Confirme um plano adequado de anestesia por beliscar o pé firmemente. Se ocorrer retirada reflexiva, espere alguns minutos adicionais antes de prosseguir.
   Nota: Também observe os bigodes, olhos e taxa de respiração de sinais de consciência. Se os bigodes são espasmos, o olho pisca quando tocou suavemente, ou respiração é rápida e superficial, espere até que o plano anestésico é mais profundo para prosseguir com o protocolo. Também monitore estes sinais durante a cirurgia de laminectomia e injeção. Se o animal exibe um plano superficial de anestesia, administrar uma injeção de cetamina somente igual a ½ o original k / x dosagem.
4. Raspe o rato ao longo da linha média dorsal dos quadris para o ângulo inferior das escápulas. Puxe a pele do animal esticada para um barbear mais fácil e mais preciso.
5. Aplica a pomada oftálmica de ambos os olhos.
6. Aplica anti-séptico para a área depilada para esterilizar o local. Para o esfoliante primeiro, embeba gaze estéril com uma solução de iodo 5% e limpe afastado todo o cabelo e detritos. Siga isto com um furto unidirecional com gaze estéril embebida em álcool 70%, para que nenhuma área é contactada duas vezes. Use essa mesma técnica com a alternância de iodo e gaze embebida em álcool etílico mais duas vezes.

3. cirúrgico campo e instrumento de preparação

1. Prepare um conjunto de instrumentos cirúrgicos esterilizados em autoclave que incluem um bisturi, ruginas, pinça dente de rato, tesoura de mola, hemostatos, fórceps de ponto médio curvado e retractores ou ganchos ponderados por desembrulhar o envoltório estéril para criar um campo estéril.
2. Abrir um pacote de luvas cirúrgicas estéreis e colocar o envoltório da luva estéril sobre a mesa. Use isto como um campo estéril adicional para ferramentas usadas para evitar a contaminação do envoltório estéril.
3. Solte uma lâmina de bisturi de #10 no campo estéril. Fixe a lâmina de um identificador com hemostatos. Soro fisiológico estéril de posição, 4,0 sutura catgut crómico e materiais para controle do sangramento como um cauterizador, gaze estéril, estéril aplicadores com ponta de algodão (para hemorragias musculares), ou gelfoam ou bonewax (para sangramentos de osso), em local acessível.
4. Recuperar o animal e defini-la em um pano estéril. Coloque gaze por baixo da bexiga para coletar a urina. Escorar a área do alvo com uma toalha enrolada sob o abdômen. Se estiver disponível, coloque uma compressa cirúrgica por baixo do pano estéril, especialmente para procedimentos mais longos.
   Nota: A esterilidade é importante durante a cirurgia de sobrevivência. Mantenha uma garrafa de spray de etanol a 70% na mão para manter a esterilidade de mãos enluvadas e um esterilizador de grânulo de uso se a esterilidade do instrumento está comprometida, ou entre cirurgias individuais.

4. expor a coluna vertebral e identificando o site laminectomia

1. Identifica a área onde uma incisão de pele será feita pressionando suavemente os dedos da última costela para localizar a vértebra L1. Usando isto como um marco, faça uma incisão de pele de 3-4 cm com um bisturi cirúrgico #10 terminando apenas inferior ao L1 para expor o músculo. Estique a pele espalhando suave e pressione firmemente com a lâmina de bisturi para garantir uma incisão limpa.
2. Corte e espalhar a gordura superficial com fórceps e a tesoura, se necessário. (Dependendo da vértebra alvo, lá pode ou não ser um grande do tecido superficial ao músculo).
3. Sente-se para os processos espinhosos com o apartamento de um dedo ou a lâmina de bisturi. Muitas vezes a área de linha média vai ser esboçada por um "V" da fáscia branco em ambos os lados. Fazer um pequeno corte rostral para permitir espaço agarrar firmemente um processo superior com pinça dente de rato e, em seguida, fazer 2 cortes longas e profundas mais próximo dos processos quanto possível. No ponto mais profundo do corte, a superfície dorsal das vértebras pode ser sentida com a lâmina de bisturi.
4. Mantenha os músculos laterais lado com retractores ou ganchos ponderados para melhorar a visibilidade. Clara muscular em torno dos processos com um bisturi, tesoura de mola ou ruginas para determinar a forma de suas cabeças.
   Nota: Lembre-se que a medula espinhal não abrange todo o comprimento da coluna vertebral, como paradas de tecido de medula espinhal crescendo mais cedo no desenvolvimento do osso. Isto significa que o nível da coluna vertebral do alvo pode ser por baixo de uma forma diferente nomeada vértebra.
5. Localize a T11 e os processos de T12 e T13 adjacentes.
   Nota: A assistência no direcionamento corretos níveis vertebrais pode ser encontrada em anteriores estudos delineando Marcos no mouse, que tem um muito semelhante e um atlas da medula espinhal de ratos estrutura vertebral^6,33. Um processo espinhoso rostral como T9 deixe intacta a dar um marco na linha média.

5. executar uma laminectomia

1. Uma vez que o alvo foi identificado corretamente, execute laminectomies aspectos dorsal do T11-T13. Espalhe suavemente as vértebras para revelar os ligamentos intervertebrais, que são bons locais para inserir ruginas para a mordida inicial do osso. Segure as ruginas numa posição semi-cerrados para aumentar o controle fino.
2. Remova os processos espinhosos e a face dorsal das vértebras, tendo pequenas mordidas com as ruginas. Tenha cuidado para não danificar a medula espinhal ou perturbar a dura-máter. Levante ligeiramente com a pinça dente de rato para ajudar a puxar a medula espinhal, longe das vértebras e diminuir a tendência de bater o tecido da medula espinhal.
3. Limpe osso fora da linha média para que o vaso sanguíneo da linha média pode ser observado. Deixe uma janela que claramente mostra o tecido da medula espinhal e é livre de detritos.
4. Toca suavemente a medula espinhal com fórceps. Alguns animais podem pular reflexivamente mesmo se seu plano anestésico é profundo. Aplica algumas gotas de um anestésico como a lidocaína diretamente para a medula espinhal para evitar saltar durante o procedimento de injeção.
5. Prenda o animal em um suporte da coluna vertebral, estabilização fórceps para processos espinhosos rostrais e caudais para a janela de laminectomia de fixação. Levante o abdômen do animal usando o titular da coluna vertebral para anular o efeito de movimentos de respiração. Isto aumentará a agulha estabilidade e garantir a adequada profundidade de injeção.

6. carregar vírus e posicionamento do injector

1. Carregar vírus para o injector de pipetagem aproximadamente 5 µ l em um pedaço de parafilm e posicionando a agulha para que a ponta está dentro da gota.
2. Use a microbomba para retirar até 4 µ l do vírus a uma taxa de 20-100 nL/s.
3. Coloque o controlador para injetar e liberar uma quantidade pequena de vírus da agulha para garantir que a ponta da agulha não está bloqueada. Limpe o excesso vírus com uma limpeza de laboratório.
   Nota: Uma seringa com uma agulha de aço de Hamilton pode ser usada como uma alternativa para pipetas de vidro puxado.
4. Posicione o micromanipulador, de modo que a escala Vernier é visível e posicione a agulha à linha média da medula espinhal.
   Nota: A linha média às vezes pode ser localizada por um grande vaso sanguíneo, correndo na superfície anterior da medula espinhal. No entanto, isso pode variar em ratos individuais e direcionamento da linha média deve ser confirmada por comparação com um processo espinhoso intacto.
5. Direto da agulha lateralmente por 0,8 mm, utilizando a escala Vernier sobre o micromanipulador.
6. Abaixe a agulha até a medula espinhal até é recuo, mas não à punção, a dura-máter. Usando um rápido movimento de torção, perfure a dura-máter com a agulha até que tem afundado a uma profundidade de 1,5 mm.

7. injectar vírus da medula espinhal

1. Quando a agulha estiver em vigor, programa o injector para injetar a uma taxa de 400 nL/min. confirmar que o vírus está entrando a medula espinhal, observando o andamento da parte dianteira de tintura. Deve haver nenhum escapamento óbvio ou abaulamento do tecido da medula espinhal. Se for observado vazamento, isso às vezes pode ser atenuado, reduzindo a velocidade de injeção para 200 nL/min.
2. Finalizada a injeção, permitir que a agulha descansar na medula espinhal por 2 – 5 min (dependendo do volume injetado) para facilitar a difusão do vírus.
3. Lentamente, retirar a agulha e mover para o próximo local da injeção. Injete 1 µ l de vírus em cada um dos 6 sites uniformemente espaçados aproximadamente 1 mm de distância ao longo do comprimento do tecido na coluna L1-L4. A mesma agulha pode ser utilizada para cada injecção, enquanto continua a funcionar corretamente.

8. fechamento e pós-operatório cuidados da ferida

1. Remova o animal do suporte da coluna vertebral e tirar retractores ou ganchos utilizados para espalhar o músculo lateral. Certifique-se de que a ferida é clara de todos os detritos antes de fechar.
2. Suture o músculo usando uma sutura catgut crómico 4.0. Corte fios de sutura, perto do nó para reduzir a probabilidade de irritação da pele interna.
3. Grampeie a pele fechada usando clipes de 9mm a ferida. Para permitir a cura ideal, alinhe as bordas da pele antes de grampeamento.
4. Coloque o animal em uma convecção da água aquecimento pad e monitor até sono.
5. Injete 5 – 10 mL de solução salina estéril por via subcutânea para repor líquidos e um antibiótico como a cefazolina para prevenir a infecção. Quando o animal é ambulatório, colocá-lo de volta à sua jaula em casa e fornecer analgésicos iniciais.  Monitorar os ratos para qualquer sinal de dor e angústia e tratar de acordo com seu procedimento IACUC aprovado para alívio da dor.

Resultados

Bem sucedida injeção e transporte do vetor viral devem resultar na transdução de uma população robusta de unilaterais neurônios na medula espinhal e em certos núcleos do tronco cerebral. A Figura 1 demonstra rotulagem estereotipada dos neurônios e axônios na medula espinhal torácica e na Pontinas formação reticular do tronco cerebral no pós-injeção de quatro semanas. Expressão significativa de GFP é visto nos neurônios na massa cinzenta da medula espinh...

Discussão

Manipulação genética de neurônios do cérebro e da medula espinhal tem servido para destaque sensorial, motor e autonômicos caminhos via rastreamento fluorescente e para explorar o potencial de rebrota dos tratos neuronais após lesões^{27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33}. direto a injeção d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#10 Scalpel Blades	Roboz	RS-9801-10	For use with the scalpel.
1 mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309659	For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections.
10mL Syringes	Becton, Dickinson and Company	309604	For injecting saline into the animal, post-surgery.
4.0 Chromic Catgut Suture	DemeTECH	NN374-16	To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution	Purdue Products L.P.	L01020-08	For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol	N/A	N/A	For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility.
Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution)	Zoetis	240048	For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Antibiotic (Cefazolin)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery.
Bead Sterilizer	CellPoint	5-1450	To heat sterilize surgical instruments.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	To seal up bone in the case of bone bleeding.
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00	To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss.
Digital Scale	Okaus	REV.005	For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Gelfoam	Pfizer	H68079	To seal up bone in the case of bone bleeding.
Glass Capillary Tubes	World Precision Instruments	4878	For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors.
Hair Clippers	Oster	111038-060-000	For clearing the surgical site of hair.
Hemostats	Roboz	RS-7231	For general use in surgery.
Kimwipes	Kimtech	34155	For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps	Roboz	RS-5136	For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale	Kanetec	N/A	For precise targeting during surgery.
Microscissors	Roboz	RS-5621	For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller	Narishige	PC-100	To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
Ophthalamic Ointment	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	To protect the animal's eyes during surgery.
Parafilm	Bemis	PM-996	To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps	Roboz	RS-5152	For griping spinous processes.
Red Oil	N/A	N/A	To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors	Roboz	RS-6510	To hold open the surgical wound.
Rimadyl Tablets	Bio Serv	MP275-050	For pain management post-surgery.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle	Roboz	RS-9843	To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors	Roboz	RS-5980	For general use in surgery.
Stainless Steal Wound Clips	CellPoint	201-1000	To bind the skin of the surgical wound during closing.
Staple Removing Forceps	Kent Scientific	INS750347	To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth	Phenix Research Products	BP-989	To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators	Puritan	806-WC	To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze	Covidien	2146	To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline	Baxter Healthcare Corporation	281324	For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves	N/A	N/A	For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad	N/A	N/A	For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope	N/A	N/A	For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler	Kent Scientific	INS750546	To apply the staples.
T/Pump Heat Therapy Water Pump	Gaymar	TP500C	To pump warm water into the water convection warming pad.
Water Convection Warming Pad	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks	N/A	N/A	To hold open the surgical wound.