発色性の発色性ハイブリダイゼーションは、HPV関連の頭頸部癌診断のためのツールを提供する

要約

ヒトパピローマウイルス(HPV)RNA発色発芽は、腫瘍内の活性ヒトパピローマウイルス感染検出のための金基準の一つであると考えられている。それはHPV E6-E7 mRNA発現の可視化を可能にし、そのシグナルの局所化および半定量的評価を可能にする。

要約

ヒトパピローマウイルス(HPV)感染は、アルコールおよびタバコ関連のOPSCCよりも良い結果に関連する傾向がある口腔咽頭扁平上皮癌(OPSCC)のサブタイプの主要な危険因子である。HPVウイルスRNAの発血ハイブリダイゼーション(CISH)における発色性は、発因性タンパク質E6およびE7のウイルス転写物の半定量的評価および良好な空間分解を有するその中の可視化を可能にする可能性がある。この技術は、腫瘍性HPV感染細胞におけるHPV転写の可視化による活性感染の診断を可能にする。この技術の利点は、腫瘍に隣接する非腫瘍性HPV感染細胞からの汚染の回避である。全体的に、その良好な診断性能は、アクティブなHPV感染同定のためのゴールドスタンダードであると考えられています。E6およびE7ウイルスタンパク質と細胞タンパク質pRbおよびp53との相互作用は細胞形質転換に必須であるため、HPV RNA CISHは機能的に関連し、発生性発因性HPV感染を急性的に反映する。この技術は、HPV関連のp16陽性頭頸部癌患者の間で2つの予後群の同定を助けた「低」または「高い」HPV転写レベル以来、臨床的にも関連している。ここでは、メーカーから入手したキットを使用してホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)スライドで実行される手動HPV RNA CISHのプロトコルを紹介します。発色発光の代わりに、その中のRNAは蛍光啓示(RNA FISH)で行うこともできます。また、従来の免疫染色と組み合わせてもよい。

概要

HPV RNA CISHは、オロファリンクスや子宮頸部などの様々な場所で良性または悪性病変で重要な可能性がある活性HPV感染の検出のための強力なツールです。活性HPV感染の検出は、HPV誘発病変の診断をサポートし、それによって、その治療および予後に影響を与える可能性がある。

HPVは最も頻繁に性感染症であり、100以上のウイルス性のゲノムが記載されている1.概略的に、遺伝子型6および11などの低リスク遺伝子型は、性器疣贅、再発性呼吸乳頭腫症、およびその他の良性病変を誘発することが知られているが、遺伝子型16および18などの高リスク遺伝子型は、ほとんどの子宮頸癌を引き起こす。と肛他癌と地域疫学データ2によって説明される可変割合でHNSCC腫瘍形成の役割を果^{たしています.}

HPV感染の検出にはいくつかのツールが用意されています。高リスクHPV感染がウイルス発生タンパク質E6およびE73の発現につながるように、E6およびE7転写物の検出は、活性HPV感染同定4のゴールドスタンダードとして広く見られている。HPV RNA CISHは、様々なHPV関連疾患に苦しむ患者から非常に容易に得られるFFPEサンプルに対して行うことができる。その性能は、子宮頸部、肛他、膣の扁平上皮内新生物、および子宮頸部、肛他および上部空気消化管の侵襲性扁平上皮癌で評価されている:それは98%以上の感受性を達成するHPV DNAポリメラーゼ連鎖反応(PCR)陽性症例の中で。これはp16免疫染色(93%)よりもわずかに優れていますその中でHPV DNAをハイブリダイゼーション(DNA ISH:97%)、より一般的に使用されています。頭頸部領域、生殖器領域、皮膚、尿路から生じる扁平上皮癌(SCC)を有する57人の患者の別のコホートでは、HPV DNA ISHと比較して、HPV RNA CISHはより良い感受性(100%対88%)を達成した特異性(87%対74%)6.

P16免疫染色は、HPV感染4、7によって引き起こされる可能性のある細胞周期破壊を反映する間接マーカーである。この費用対効果の高いテストは、良好な感度と負の予測値を有し、米国病理学者のカレッジ(CAP)と国際連合によってオアフォリンクス癌(OPC)における高リスクHPV感染の代理マーカーとして推奨されていますがんコントロール (UICC)⁸.

この論文はHNSCCにおけるHPVの検出のみに焦点を当てていますが、HPV RNA CISHはHPV感染を伴う様々な他の条件において臨床的に関連しています。例えば、この技術は、形態的にあいまいな症例9に対する子宮頸部の低グレード扁平上皮病変(LSIL、以前は子宮頸部内上皮新生物として知られていた、グレード1[CIN1])の診断の精度を向上させる可能性がある。前咽頭SCCに関しては、HPV RNA CISHは、頭頸部癌のTNM分類(国際癌連合の)の最近の第8版でHPV無関係の尾咽頭SCCとは異なるとラベル付けされたHPV関連SCCの同定を可能にする。コントロール [UICC])¹⁰.HPV関連SCCは、HPV無関係のSCC^11、12、13よりも長い生存と強化された放射線療法および化学療法感受性でより良い予後を示すので、HPV感染の検出は影響を与える可能性がある患者管理14、15.また、HPV RNA CISHは、HPV DNA CISH¹⁶よりも高いシグナルを持つHPV関連多発性シノキピックシノナザル癌の診断に使用することができる。いくつかの多変量分析は、E6およびE7転写物の検出が、前咽頭SCC全体の7、15、17、18およびにおけるより良い予後と相関していることを示唆している。p16陽性眼咽頭SCC^19のサブグループ,²⁰.

ここでは、製造元から入手したキットを使用してFFPEスライドで実行される手動HPV RNA CISHのプロトコルを紹介します。

プロトコル

このプロトコルは倫理ガイドラインに従い、倫理委員会(コミテ・ド・プロテクション・デ・ペルネス・イル・ド・フランス-II、#2015-09-04)によって承認されました。

1. 材料の準備

1. 1x洗浄バッファーの調製
   1. 蒸留水の2.94Lと洗濯バッファー(50x)のボトル1本(60mL)を大きなカーボイに加えて、1x洗浄バッファーの3Lを準備します(材料の表を参照)。よく混ぜる。
      注:1x洗浄バッファーは、事前に準備し、最大1ヶ月間室温で保存することができる。
2. カウンター染色試薬の調製
   1. 50%ヘマトキシリンを準備します。
      1. ヒュームフードに、ギルのヘマトキシリンI(材料表参照)の100mLを染色皿に蒸留水の100mLに加えます。
         注:50%ヘマトキシリン染色溶液は、最大1週間再利用することができます。
   2. アンモニア水(ブルージング試薬)を0.02%(w/v)調剤で調剤します。
   3. ヒュームフードに、水酸化アンモニウム1Nの1.43mLを250mLの蒸留水を等級シリンダーまたは別の容器に加える。パラフィンフィルムでシリンダーを密封します。3x-5xのためによく内容を混ぜます。
      注:アッセイ定量のためには、水酸化アンモニウムを使用することが重要です。試薬は、事前に調製してもよい。すべてのコンテナがカバーされたままであることを確認します。
3. 1xターゲット検索試薬の調製
   1. 大型ビーカーでは、蒸留水の630mLに10倍のターゲット検索試薬(材料表を参照)の70 mLを追加します。
   2. ビーカーを磁気攪拌機で加熱プレートに置きます。アルミホイルで覆います。
   3. 内容物を100°Cで10~15分間沸騰させます。
      注:30分以上沸騰させないようにしてください。
4. 試薬平衡
   1. ハイブリダイゼーションオーブンが40°Cでオンであることを確認します。トレイの下部に湿った加湿紙を置きます。
      注:ステップ3.4~4.2にはハイブリダイゼーションオーブン(材料表を参照)が必要です。
   2. 増幅試薬(AMP1-AMP6、材料の表を参照)を冷蔵庫から取り出し、関連するインキュベーションステップの少なくとも30分前に室温に保ちます。
   3. 各使用の前に、オーブンまたは水浴またはインキュベーターで40°Cで少なくとも10分間ターゲットおよび/または制御プローブを温めます。

2. ヒュームフードの接着増強とデパラフィン化

注:3~5μm厚の組織学的サンプルを染色されていないスライドに取り付けてプロトコルを起動します。

1. 密着性を高めるために、1時間またはオーブンで一晩40°Cで60°Cでスライドを焼きます。
2. スライドラックを染色されていない組織学的スライドで充電します。時折攪拌して、染色皿に含まれる新鮮なキシレンに5分間スライドラックを浸します。新鮮なキシレンで繰り返します。
3. スライディングラックを、染色皿に含まれる新鮮な100%エタノールに3分間浸し、一定の撹拌を行います。新鮮な100%エタノールで繰り返します。
4. スライドを室温で2分間乾燥させます。
   注:アッセイ後のスライドの脱水のためにデパラフィン化試薬を再利用しないでください。

3. 組織前処理

注:これらの手順は、頭頸部サンプルの製造元の指示に従って、「標準的な」前処理の推奨事項に従います。セクション3.1および3.2のタイミングは、操作された組織に応じて調整する必要があるかもしれません。

1. ペルオキシダーゼ活性の遮断
   1. 各スライドに過酸化水素(材料表を参照)を4~6滴加え、室温で10分間インキュベートします。
   2. 室温で蒸留水で2分間スライドを2倍洗います。
2. RNA/組織境界の破壊
   1. 爪で、沸騰した1xターゲット検索試薬(TTR1x)からアルミ箔をセクション1.3から取り出し、撹拌を停止します。スライドラックをゆっくりと慎重に15分間浸し、ビーカーをアルミホイルでもう一度覆います。
      注: この手順では、煮込みが保持される必要があります。
      注意:爪を使用してアルミホイルとスライドラックを操作し、火傷を避けてください。手袋やラボコートなど、適切な個人用保護具を着用してください。
   2. 爪で、すぐに熱いスライドラックを蒸留水浴に移し、2分間洗います。
      注: TTR1x でサンプルが冷却されないようにしてください。
   3. スライドを新鮮な100%エタノールで2分間洗います。
   4. スライドを室温で2分間乾燥させます。
3. バリア作成
   1. 疎水性バリアペン(材料表を参照)を使用して、サンプルの周りにバリアを描画します。少なくとも5分間乾燥させてください。
      注:バリアが本当に乾燥するようにします。手順中に摩耗した場合は、再び描画することを躊躇しないでください。ペンでティッシュに触れないようにしてください。プロトコルはここで一晩一時停止することができます。
4. プロテアーゼ消化
   1. スライドをスライドラックに置き、サンプルごとに約4滴のプロテアーゼプラスを追加します(材料の表を参照)。
   2. 湿度制御トレイを蓋で覆い、40°Cで30分間ハイブリダイゼーションオーブンに挿入します。
      メモ:蒸発を防ぐには、ターンノブがロック位置に完全に回っていることを確認してください。
   3. トレイをオーブンから取り外し、スライドラックを取り外します。
   4. 一度に1つのスライドを、すぐに余分な液体を取り除き、蒸留水で満たされた染色皿に沈んだスライドラックにスライドを置きます。
   5. 室温で蒸留水で2分間スライドを2倍洗います。絶えず動揺する。

4. アッセイの実行

注: インキュベーションステップの間にセクションを乾燥させないようにしてください。

1. HPVプローブのハイブリダイゼーション
   注: プローブが事前に温まって、使用前に沈殿物を溶かしていることを確認してください。このステップでは、HPVプローブの代わりに、陽性対照用ペプチジルプロリンイソメラーゼB(PPIB)または陰性対照(DAPB)に対する消化ジピコリン酸還元酵素(DAPB)を使用することもできます(材料の表を参照)。
   1. スライドをタップまたはフリックして余分な液体を取り除き、スライドラックに入れます。HPVプローブを約4滴追加して、各セクションを完全にカバーします。
   2. トレイを蓋で覆い、40°Cで2時間オーブンに挿入します。
      注:蒸発を防ぐには、ターンノブがロック位置に完全に回っていることを確認してください。
   3. トレイをオーブンから取り外し、スライドラックを取り外します。
   4. 一度に1つのスライドを、すぐに余分な液体を取り除き、1x洗浄バッファで満たされた染色皿に沈んだスライドラックにスライドを置きます。
   5. 一定の撹拌で室温で2分間、1x洗浄バッファーでスライドを洗浄します。新鮮な1x洗浄バッファでこれを繰り返します。
2. AMP1、AMP2、AMP3、AMP4のハイブリダイゼーション
   注: これらの手順には、ハイブリダイゼーション オーブンのハイブリダイゼーションと、購入したキットの AMP1-AMP4 が含まれます (材料の表を参照)。
   1. タップまたはフリックして、余分な液体をスライドから取り除き、スライドラックに入れます。AMP1の約4滴を追加して、各セクションを完全にカバーします。
   2. トレイを蓋で覆い、オーブンに30°Cで30分間挿入します。
   3. トレイをオーブンから取り外し、スライドラックを取り外します。
   4. 一度に1つのスライドを、すぐに余分な液体を取り除き、1x洗浄バッファで満たされた染色皿に沈んだスライドラックにスライドを置きます。
   5. 一定の撹拌で室温で2分間、1x洗浄バッファーでスライドを洗浄します。新鮮な1x洗浄バッファでこれを繰り返します。
   6. 手順 4.2.1 ~ 4.2.5 を繰り返しますが、AMP1 の代わりにAMP2を ~4 滴使用し、40°C で15 分間インキュベートします。 スライドを2x2分間洗い、両方とも新鮮な洗浄バッファーで洗います。
   7. 手順 4.2.1 ~ 4.2.5 を繰り返しますが、AMP1 の代わりにAMP3を ~4 滴使用し、40°C で30 分間インキュベートします。 スライドを2x2分間洗い、両方とも新鮮な洗浄バッファーで洗います。
   8. 手順 4.2.1 ~ 4.2.5 を繰り返しますが、AMP1 の代わりにAMP4を ~4 滴使用し、40°C で15 分間インキュベートします。 スライドを2x2分間洗い、両方とも新鮮な洗浄バッファーで洗います。
3. AMP5とAMP6のハイブリダイゼーション
   注:これらのステップは、オーブン内のハイブリダイゼーションが含まれていないが、室温でのハイブリダイゼーション。AMP5 および AMP6 は、購入したキットから取得されます (材料の表を参照)。
   1. スライドをタップまたはフリックして余分な液体を取り除き、スライドラックに入れます。AMP5の約4滴を追加して、各セクションを完全にカバーします。
   2. トレイを蓋で覆い、室温で30分間インキュベートします。
   3. 一度に1つのスライドを、すぐに余分な液体を取り除き、1x洗浄バッファで満たされた染色皿に沈んだスライドラックに置きます。
   4. 一定の撹拌で室温で2分間、1x洗浄バッファーでスライドを洗浄します。新鮮な1x洗浄バッファでこれを繰り返します。
   5. 手順 4.3.1 ~ 4.3.4 を繰り返しますが、AMP5 の代わりにAMP6を ~4 滴使用し、室温で15 分間インキュベートします。スライドを2x2分間洗い、両方とも新鮮な洗浄バッファーで洗います。

5. 3,3'-ジアミノベンジジンを用いて信号検出

注意: ジアミノベンジジン (DAB) は有毒です。.この化学物質を廃棄および取り扱う際には、適切な予防措置および安全ガイドラインに従ってください。

1. 各溶液の同じ数の滴を分配することにより、適切なサイズのチューブにDAB-AとDAB-Bの等しいボリューム(材料の表を参照)を混合します。区間あたりのDAB基板の~120 μLを作ります(各試薬の約2滴/合計4)。3x-5xのためによく混ぜます。
2. スライドラックからスライドラックからスライドを1つずつ取り出し、スライドラックに入れる前に余分な液体を取り除くためにタップまたはフリックします。
3. 各組織セクションにDABのピペット〜120 μL。セクションが覆われていることを確認し、室温で10分間インキュベートします。
4. 現地の規制に従って残りのDABを処分し、水道水で満たされた染色皿に沈んだスライドラックにスライドを挿入します。

6. カウンターステイン

1. スライドラックを50%ヘマトキシリン染色液を含む染色皿に移動し、室温で30sのために休ませてください。スライドが紫色になることに注意してください。
2. スライドラックを水道水を含むステンディング皿に直ちに戻し、ラックを上下に動かしてスライドを3x~5倍洗います。
3. スライドが明確になるまで、新鮮な水道水で洗浄工程を繰り返し、セクションは紫色のままです。
4. ステンディング皿の水道水を0.02%アンモニア水に置き換えます。ラックを上下に 2x ~3 倍に移動します。組織セクションが青色に変わる場合があります。
5. アンモニア水を水道水に置き換えます。スライドを3x-5x洗います。

7. 脱水

1. スライドラックをヒュームフードに70%エタノールを含むステンディング皿に移動し、時折攪拌して2分間休ませてください。
2. スライドラックを100%エタノールを含む最初の染色皿に移動し、時折攪拌して2分間休ませてください。
3. スライドラックを100%エタノールを含む第2の染色皿に移動し、時折攪拌して2分間休ませてください。
4. スライドラックをキシレンを含む染色皿に移動し、時折攪拌して5分間休ませてください。

8. スライド取り付け

1. スライドラックからスライドを取り外し、ヒュームフードの上に面したセクションで平らに置きます。
2. 各スライドにキシレンベースの取り付け媒体を1滴ずつ追加し、24 mm x 50 mmのカバースリップを慎重にセクションの上に配置して、スライドを1滴ずつ取り付けます。気泡を捕捉することは避けてください。
3. 5分間スライドを空気乾燥させます。

9. サンプル評価

1. 20x-40倍の倍率で標準的な明視野顕微鏡の下のティッシュセクションを調べる。

結果

ここで説明するように、頭頸部扁平上皮癌において、細胞質または腫瘍細胞の核における褐色穿刺染色の存在下で陽性と考えられる場合がある。ほとんどの研究では、信号は「正」または「検出されない」14のいずれかと見なされます。信号の半分化の方法は報告されていますが、チーム間の標準化が欠けています。例えば、いくつかの研究では、シグナルは腫瘍細胞あた?...

ディスカッション

購入したキットで行われるHPV RNA CISHは、ウイルス転写物の検出のための強力なツールであり、活性HPV感染を示しています。手動で実行すると、プロトコルの手順は全体的に従いやすく、購入したキットは便利です。この技術は19の組織学的サンプルプラス1つの制御スライドの染色を可能にし、アッセイは8時間の周り続ける。特に明記されていない限り、ステップ間でサンプルを乾燥させない...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1	Merck	GHS132
HybEZ Oven (110v)	Advanced Cell Diagnostics Inc.	321710
HybEZ slide rack	Advanced Cell Diagnostics Inc.	300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Advanced Cell Diagnostics Inc.	310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN	Advanced Cell Diagnostics Inc.	322310	This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe	Advanced Cell Diagnostics Inc.	320871	DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe	Advanced Cell Diagnostics Inc.	320861	PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent	Advanced Cell Diagnostics Inc.	322330	Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18	Advanced Cell Diagnostics Inc.	311121
RNAscope Target Retrieval Reagents	Advanced Cell Diagnostics Inc.	322000
RNAscope Wash Buffer Reagents	Advanced Cell Diagnostics Inc.	310091	Wash Buffer 50X x4