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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'ibridazione dell'RNA cromogenica in situ del papillomavirus umano (HPV) è considerata uno degli standard d'oro per il rilevamento dell'infezione da papillomavirus umano attivo all'interno dei tumori. Permette la visualizzazione dell'espressione mRNA HPV E6-E7 con la localizzazione e la valutazione semiquantitativa del suo segnale.

Abstract

L'infezione da papillomavirus umano (HPV) è un importante fattore di rischio per un sottotipo di carcinoma a cellule squamose orofangeali (OPSCC), che tende ad essere associato a un risultato migliore rispetto all'OPSCC relativo all'alcol e al tabacco. L'ibridazione cromogenica in situ (CISH) dell'RNA virale dell'HPV potrebbe consentire la valutazione semiquantitativa delle trascrizioni virali delle proteine oncogeniche E6 ed E7 e una visualizzazione in situ con una buona risoluzione spaziale. Questa tecnica consente la diagnosi di un'infezione attiva con la visualizzazione della trascrizione HPV nelle cellule tumorali infettate da HPV. Un vantaggio di questa tecnica è l'evitare la contaminazione da cellule non neoplastiche infettate da HPV adiacenti al tumore. Nel complesso, le sue buone prestazioni diagnostiche sono considerate il gold standard per l'identificazione attiva dell'infezione da HPV. Poiché l'interazione delle proteine virali E6 ed E7 con le proteine cellulari pRb e p53 è obbligatoria per la trasformazione cellulare, HPV RNA CISH è funzionalmente rilevante e riflette acutamente l'infezione attiva oncogenica hPV. Questa tecnica è clinicamente rilevante anche dal momento che i livelli di trascrizione "bassa" o "alta" di HPV hanno aiutato l'identificazione di due gruppi di prognosi tra i pazienti affetti da cancro alla testa e al collo "bassi" o "alti". Qui presentiamo il protocollo per i vetrini manuali HPV RNA CISH eseguiti su diapositive in paraffina (FFPE) fissate in formalina con un kit ottenuto dal produttore. Invece della rivelazione cromogenica, l'ibridazione dell'RNA in situ può essere eseguita anche con rivelazione fluorescente (RNA FISH). Può anche essere combinato con l'immunostaining convenzionale.

Introduzione

HPV RNA CISH è un potente strumento per il rilevamento dell'infezione da HPV attivo, che può rivelarsi cruciale nelle lesioni benigne o maligne in varie posizioni come l'oropharynx o la cervice uterina. La rilevazione di un'infezione da HPV attiva può supportare la diagnosi di una lesione indotta da HPV e, di seguito, influenzarne il trattamento e la prognosi.

L'HPV è l'infezione trasmessa sessualmente più frequente e oltre 100 genotipi virali sono stati descritti1. Schematicamente, i genotipi a basso rischio come i genotipi 6 e 11 sono noti per indurre verruche genitali, papillomatosi respiratoria ricorrente e altre lesioni benigne, mentre i genotipi ad alto rischio come i genotipi 16 e 18 sono responsabili della maggior parte dei tumori cervicali e tumori anali e svolgono un ruolo nell'oncogenesi HNSCC in proporzioni variabili, come rappresentato dai dati epidemiologici regionali2.

Sono disponibili diversi strumenti per il rilevamento dell'infezione da HPV. Come un'infezione da HPV ad alto rischio porta all'espressione di proteine oncogeniche virali E6 ed E73, la rilevazione delle trascrizioni E6 ed E7 è ampiamente vista come il gold standard per l'identificazione dell'infezione da HPV attiva4. HPV RNA CISH può essere eseguito su campioni di FFPE che sono abbastanza facilmente ottenuti da pazienti affetti da varie malattie correlate all'HPV. Le sue prestazioni sono state valutate nella neoplasia intraelicale squamosa nella cervice, nell'ano e nella vagina, e nel carcinoma a cellule squamose invasive nella cervice, nell'ano e nel tratto aerodigestivo superiore5: raggiunge una sensibilità di oltre il 98% tra i casi positivi alla reazione a catena della polimerasi del DNA HPV (PCR). Questo è leggermente meglio di p16 immunostaining (93%) e l'ibridazione situ del DNA In situ (DNA ISH: 97%), che sono più comunemente utilizzati. In un'altra coorte di 57 pazienti con carcinoma a cellule squamose (SCC) derivante dalla regione della testa e del collo, dalla regione genitale, dalla pelle e dal tratto urinario, rispetto all'HPV DNA ISH, hPV RNA CISH ha ottenuto una migliore sensibilità (100% contro 88%) specificità (87% contro 74%)6.

L'immunostaining P16 è un marcatore indiretto che riflette l'interruzione del ciclo cellulare che può essere causata (ma non esclusivamente) dall'infezione da HPV4,7. Questo test economico possiede una buona sensibilità e un valore predittivo negativo ed è raccomandato come marcatore surrogato di infezione da HPV ad alto rischio nel cancro dell'orofarye (OPC) dal College of American Pathologists (CAP) e dall'Unione per l'Internazionale Controllo del cancro (UICC)8.

Anche se questo documento si concentra esclusivamente sulla rilevazione dell'HPV in HNSCC, HPV RNA CISH è clinicamente rilevante in varie altre condizioni che coinvolgono l'infezione da HPV. Per esempio, questa tecnica può migliorare l'accuratezza della diagnosi di lesioni intrapetali di basso grado della cervice (LSIL, precedentemente nota come neoplasia intraelilicale cervicale, grado 1 [CIN1]) per casi morfologicamente ambigui9. Per quanto riguarda l'Oropharyngeal SCC, HPV RNA CISH consente l'identificazione di SCC correlati all'HPV, etichettato come distinto dalla SCC orofaziale non correlata all'HPV nella recente ottava edizione della classificazione TNM del cancro alla testa e al collo (dell'Unione per il cancro internazionale Controllo [UICC])10. Dal momento che la SCC correlata all'HPV presenta una prognosi migliore con una maggiore sopravvivenza e una maggiore sensibilità alla radioterapia e alla chemioterapia rispetto all'HPV11,12,13, il rilevamento dell'infezione da HPV può avere un impatto gestione del paziente14,15. Inoltre, HPV RNA CISH può essere utilizzato per la diagnosi di carcinoma sinonasal multifenotico correlato all'HPV con un segnale superiore a HPV DNA CISH16. Diverse analisi multivariate suggeriscono che il rilevamento delle trascrizioni E6 ed E7 è correlato con una prognosi migliore in SCC oroferesia complessivamente7,15,17,18 e nel sottogruppo di p16-positivo orofaleale SCC19,20.

Qui presentiamo il protocollo per il manuale HPV RNA CISH eseguito su vetrini FFPE con un kit ottenuto dal produttore.

Protocollo

Il protocollo segue le linee guida etiche ed è stato approvato dal Comitato Etico (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).

1. Preparazione dei materiali

  1. Preparazione del tampone di lavaggio 1x
    1. Preparare 3 L di 1x buffer di lavaggio aggiungendo 2,94 L di acqua distillata e una bottiglia (60 mL) di tampone di lavaggio (50x) (vedi la tabella dei materiali) a un grande carboy. Mescolare bene.
      NOTA: Il buffer di lavaggio 1x può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente per un massimo di 1 mese.
  2. Preparazione di reagenti di controstitura
    1. Preparare il 50% di ematossilina.
      1. In un cofano fumato, aggiungere 100 mL di ematossialina i di Gill (vedi la tabella deimateriali) a 100 mL di acqua distillata in una macchia di colorazione.
        NOTA: la soluzione di colorazione dell'ematossilina al 50% può essere riutilizzata fino a 1 settimana.
    2. Preparare lo 0,02% (w/v) l'acqua di ammoniaca (reagente di muso).
    3. Nel cofano del fume, aggiungere 1,43 mL di 1 N idrossido di ammonio a 250 mL di acqua distillata in un cilindro graduato o in un altro contenitore. Sigillare il cilindro con pellicola di paraffina. Mescolare bene il suo contenuto per 3x-5x.
      NOTA: Per la quantificazione di analisi, è fondamentale utilizzare idrossido di ammonio. I reagenti possono essere preparati in anticipo. Assicurarsi che tutti i contenitori rimangano coperti.
  3. Preparazione del reagente di recupero destinazione 1x
    1. In un grande becher, aggiungere 70 mL di 10x reagente di recupero bersaglio (vedere la Tabella dei materiali) a 630 mL di acqua distillata.
    2. Posizionare il becher su una piastra di riscaldamento con un agitatore magnetico. Coprirlo con un foglio di alluminio.
    3. Far bollire il suo contenuto a 100 gradi centigradi per 10-15 min.
      NOTA: Non far bollire per più di 30 min.
  4. Equilibratore reagente
    1. Assicurarsi che il forno di ibridazione sia acceso e a 40 gradi centigradi. Posizionare la carta umidificante umidante bagnata nella parte inferiore del vassoio.
      NOTA: per i passaggi da 3.4 a 4.2 è necessario un forno di ibridazione (vedere la tabella deimateriali).
    2. Togliere i reagenti di amplificazione (AMP1–AMP6, consultare la Tabella deiMateriali) dal frigorifero e tenerli a temperatura ambiente, almeno 30 min prima della relativa fase di incubazione.
    3. Prima di ogni utilizzo, scaldare il bersaglio e/o le sonde di controllo per almeno 10 min a 40 gradi centigradi in forno o in un bagno d'acqua o incubatrice.

2. Miglioramento dell'adeno e deparaffinazione nella cappa del fumi

NOTA: Avviare il protocollo con campioni istologici spessi 3-5 m montati su vetrini non macchiati.

  1. Al fine di migliorare l'adesione, cuocere i vetrini a 60 gradi per 1 h o a 40 gradi durante la notte in forno.
  2. Caricare il rack di diapositive con diapositive istologiche non macchiate. Immergere il portadiapositive per 5 min in xilene fresco contenuto in un piatto di colorazione, con agitazione occasionale. ripetere con xilene fresco.
  3. Immergere la griglia scorrevole per 3 min in etanolo fresco al 100% contenuto in una teglia di colorazione, con agitazione costante. Ripetere con etanolo fresco al 100%.
  4. Lasciare asciugare i vetrini per 2 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Non riutilizzare i reagenti di deparaffinazione per disidratare i vetrini dopo il test.

3. Pretrattamento dei tessuti

NOTA: Questi passaggi seguono la raccomandazione di pretrattamento "standard" in base alle istruzioni del produttore per i campioni di testa e collo. Potrebbe essere necessario regolare la tempistica delle sezioni 3.1 e 3.2 a seconda del tessuto manipolato.

  1. Blocco dell'attività perossidasi
    1. Aggiungere 4-6 gocce di perossido di idrogeno (si veda la Tabella deiMateriali) ad ogni vetrino e incubarle per 10 min a temperatura ambiente.
    2. Lavare i vetrini 2x per 2 min in acqua distillata a temperatura ambiente.
  2. Rottura dei limiti di RNA/tessuto
    1. Con un artiglio, rimuovere la lamina di alluminio dal reagente di recupero bersaglio 1x (TTR1x) dalla sezione 1.3 e smettere di mescolare. Immergere il portasci lentamente e con molta attenzione per 15 min. Coprire nuovamente il becher con la lamina di alluminio.
      NOTA: il sobbollimento deve persistere durante questo passaggio.
      AVVISO: Utilizzare l'artiglio per manipolare la lamina di alluminio e il rack scorrevole in modo da evitare lesioni da ustione. Assicurati di indossare attrezzature protettive personali adeguate, come guanti e un camice da laboratorio.
    2. Con l'artiglio, trasferire immediatamente il rack hot slide in un bagno d'acqua distillato e lavarlo per 2 min.
      NOTA: Assicurarsi che i campioni non si raffreddino nel TTR1x.
    3. Lavare i vetrini in etanolo fresco al 100% per 2 min.
    4. Lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente per 2 min.
  3. Creazione di barriere
    1. Con una penna barriera idrofobica (vedere la tabella deimateriali), disegnare una barriera intorno al campione. Lasciare asciugare per almeno 5 min.
      NOTA: Lasciare asciugare davvero la barriera. Se si consuma durante la procedura, non esitare a disegnarlo di nuovo. Evitare di toccare il tessuto con la penna. Il protocollo può essere sospeso qui durante la notte.
  4. Digestione proteasi
    1. Posizionate le diapositive sul rack delle diapositive e aggiungete 4 gocce di Protease Plus per campione (consultate la tabella dei materiali).
    2. Coprire il vassoio di controllo dell'umidità con un coperchio e inserirlo nel forno di ibridazione per 30 min a 40 gradi centigradi.
      NOTA: Per evitare l'evaporazione, assicurarsi che la manopola di svolta sia completamente ruotata in posizione di blocco.
    3. Togliere il vassoio dal forno e rimuovere il rack scorrevole.
    4. Una diapositiva alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e mettere il vetrino in una cremagliera sommersa in un piatto di colorazione riempito con acqua distillata.
    5. Lavare i vetrini 2x per 2 min in acqua distillata a temperatura ambiente. Agitare costantemente.

4. Esecuzione del saggio

NOTA: Non lasciare asciugare le sezioni tra le fasi di incubazione.

  1. Ibridazione della sonda HPV
    NOTA: Assicurarsi che le sonde siano preriscaldate per sciogliere eventuali precipitazioni prima dell'uso. Per questo passaggio, invece di sonda HPV, può essere utilizzato anche l'isomeresi B peptidil-prolyl per il controllo positivo o la riduttrice diidipicolata (DAPB) per il controllo negativo (vedere la Tabella dei materiali).
    1. Toccare e/o scorrere i vetrini per rimuovere il liquido in eccesso e inserirli nel rack diapositive. Aggiungere gocce di sonda HPV per coprire interamente ogni sezione.
    2. Coprire il vassoio con un coperchio e inserirlo in forno per 2 h a 40 gradi centigradi.
      NOTA: Per evitare l'evaporazione, assicurarsi che il nob di svolta sia completamente ruotato in posizione di blocco.
    3. Togliere il vassoio dal forno e rimuovere il rack scorrevole.
    4. Una diapositiva alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare il vetrino in un rack di scorrimento immerso in un piatto di colorazione riempito con 1x tampone di lavaggio.
    5. Lavare i vetrini in 1x lavaggio tampone per 2 min a temperatura ambiente con agitazione costante. Ripetere l'operazione con il tamponi di lavaggio 1x fresco.
  2. Ibridazione di AMP1, AMP2, AMP3 e AMP4
    NOTA: questi passaggi includono l'ibridazione nel forno di ibridazione e AMP1–AMP4 dal kit acquistato (vedere la Tabella dei materiali).
    1. Toccare e/o scorrere per rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini e inserirli nel rack diapositive. Aggiungere 4 gocce di AMP1 per coprire interamente ogni sezione.
    2. Coprire il vassoio con un coperchio e inserirlo in forno per 30 min a 40 gradi centigradi.
    3. Togliere il vassoio dal forno e rimuovere il rack scorrevole.
    4. Una diapositiva alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare il vetrino in un rack di scorrimento immerso in un piatto di colorazione riempito con 1x tampone di lavaggio.
    5. Lavare i vetrini in 1x lavaggio tampone per 2 min a temperatura ambiente con agitazione costante. Ripetere l'operazione con il tamponi di lavaggio 1x fresco.
    6. Ripetere i passaggi da 4,2,1 a 4,2,5, ma utilizzare 4 gocce di AMP2 invece di AMP1 e incubare per 15 min a 40 gradi centigradi. Lavare i vetrini 2x per 2 min, entrambe le volte in tampone di lavaggio fresco.
    7. Ripetere i passaggi da 4,2,1 a 4,2,5, ma utilizzare 4 gocce di AMP3 invece di AMP1 e incubare per 30 min a 40 gradi centigradi. Lavare i vetrini 2x per 2 min, entrambe le volte in tampone di lavaggio fresco.
    8. Ripetere i passaggi da 4,2,1 a 4,2,5, ma utilizzare 4 gocce di AMP4 invece di AMP1 e incubare per 15 min a 40 gradi centigradi. Lavare i vetrini 2x per 2 min, entrambe le volte in tampone di lavaggio fresco.
  3. Ibridazione di AMP5 e AMP6
    NOTA: questi passaggi non includono l'ibridazione nel forno, ma l'ibridazione a temperatura ambiente. AMP5 e AMP6 provengono dal kit acquistato (vedere la Tabella deiMateriali).
    1. Toccare e/o scorrere i vetrini per rimuovere il liquido in eccesso e inserirli nel rack diapositive. Aggiungere 4 gocce di AMP5 per coprire interamente ogni sezione.
    2. Coprire il vassoio con un coperchio e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
    3. Una diapositiva alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e metterlo in un rack di scorrimento immerso in un piatto di colorazione riempito con 1x tampone di lavaggio.
    4. Lavare i vetrini in 1x lavaggio tampone per 2 min a temperatura ambiente con agitazione costante. Ripetere l'operazione con il tamponi di lavaggio 1x fresco.
    5. Ripetere i passaggi da 4,3,1 a 4,3,4, ma utilizzare 4 gocce di AMP6 invece di AMP5 e incubare per 15 min a temperatura ambiente. Lavare i vetrini 2x per 2 min, entrambe le volte in tampone di lavaggio fresco.

5. Rilevamento del segnale con 3,3'-diaminobenzidina

AVVISO: La diaminobenzidina (DAB) è tossica. Seguire le precauzioni appropriate e le linee guida di sicurezza durante lo smaltimento e la manipolazione di questa sostanza chimica.

  1. Mescolare volumi uguali di DAB-A e DAB-B (vedere la tabella dei materiali) in un tubo di dimensioni appropriate erogando lo stesso numero di gocce di ogni soluzione. Fare 120 dollari di DAB substrato per sezione (2 gocce di ogni reagente/totale di 4). Mescolare bene per 3x-5x.
  2. Prendere ogni diapositiva, una alla volta, dal rack di scorrimento e toccare e/ o scorrere per rimuovere il liquido in eccesso prima di metterlo nel rack di scorrimento.
  3. Pipetta 120 dollari di DAB su ogni sezione di tessuto. Assicurarsi che le sezioni siano coperte e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
  4. Smaltire il RESTANTe DAB secondo la normativa locale e inserire il vetrino in un rack scorrevole immerso in un piatto di colorazione riempito con acqua del rubinetto.

6. Contrastare

  1. Spostare il portasci su una teglia di colorazione contenente il 50% di soluzione di colorazione dell'ematossilina lasciate riposare per 30 s a temperatura ambiente. Si noti che le diapositive diventeranno viola.
  2. Trasferire immediatamente il rack scorrevole in una teglia di colorazione contenente acqua del rubinetto e lavare i vetrini 3x-5x spostando il rack su e giù.
  3. Continuare a ripetere la fase di lavaggio con acqua fresca del rubinetto fino a quando gli scivoli sono limpidi, mentre le sezioni rimangono viola.
  4. Sostituire l'acqua del rubinetto nella teglia di colorazione con 0,02% di acqua ammoniaca. Spostare il rack su e giù 2x-3x. Si noti che la sezione del tessuto dovrebbe diventare blu.
  5. Sostituire l'acqua di ammoniaca con acqua di rubinetto. Lavare i vetrini 3x–5x.

7. Disidratazione

  1. Spostare il portasci su una teglia di colorazione contenente il 70% di etanolo nella cappa del fumi e lasciarlo riposare per 2 min con agitazione occasionale.
  2. Spostare il portasci su una prima teglia con 100% di etanolo e lasciarlo riposare per 2 min con agitazione occasionale.
  3. Spostare il portasci su una seconda teglia con 100% di etanolo e lasciarlo riposare per 2 min con agitazione occasionale.
  4. Spostare il portadiapositive in un piatto di colorazione contenente lo xilene e lasciarlo riposare per 5 min con agitazione occasionale.

8. Montaggio a scorrimento

  1. Rimuovere i vetrini dal rack diapositive e disporli piatti con le sezioni rivolte verso l'alto nel cofano del fume.
  2. Montare una diapositiva alla volta aggiungendo 1 goccia di un supporto di montaggio basato su xilene ad ogni diapositiva e posizionando con attenzione una vestra da 24 mm x 50 mm sulla sezione. Evitare di intrappolare eventuali bolle d'aria.
  3. Asciugare all'aria i vetrini per 5 min.

9. Valutazione dei campioni

  1. Esaminare le sezioni di tessuto sotto un microscopio standard del campo luminoso con ingrandimento 20x-40x.

Risultati

Come descritto qui, nel cancro delle cellule squamose della testa e del collo, un caso può essere considerato positivo in presenza di colorazione punctiforme marrone nel citoplasma o nei nuclei delle cellule tumorali. Nella maggior parte degli studi, il segnale è considerato come "positivo" o "non rilevato"14. Sono stati riportati metodi di semiquantificazione del segnale, ma mancano di standardizzazione tra le squadre. Ad esempio, in alcuni studi, i segnali sono stati segnati come 1-3 punti per...

Discussione

HPV RNA CISH eseguito con un kit acquistato è un potente strumento per il rilevamento di trascrizioni virali e indica l'infezione da HPV attivo. Eseguito manualmente, i passaggi del protocollo sono nel complesso facili da seguire e il kit acquistato è conveniente. Questa tecnica permette la colorazione di 19 campioni istologici più una diapositiva di controllo in una sola volta, e il saggio dura circa 8 h. È fondamentale non lasciare che i campioni si asciughino tra i passaggi, salvo diversamente specificato. La cond...

Divulgazioni

CB: consigli di amministrazione, seminari: MSD, BMS, Astrazeneca, Roche

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano il dipartimento di Patologia di Hopital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel, e Gisèle Legall); la piattaforma di istologia di PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark per l'editing di lingue; Alexandra Elbakyan per il suo contributo.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Hematoxylin solution, Gill No. 1MerckGHS132
HybEZ Oven (110v)Advanced Cell Diagnostics Inc.321710
HybEZ slide rackAdvanced Cell Diagnostics Inc.300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier PenAdvanced Cell Diagnostics Inc.310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWNAdvanced Cell Diagnostics Inc.322310This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control ProbeAdvanced Cell Diagnostics Inc.320871DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control ProbeAdvanced Cell Diagnostics Inc.320861PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus ReagentAdvanced Cell Diagnostics Inc.322330Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18Advanced Cell Diagnostics Inc.311121
RNAscope Target Retrieval ReagentsAdvanced Cell Diagnostics Inc.322000
RNAscope Wash Buffer ReagentsAdvanced Cell Diagnostics Inc.310091Wash Buffer 50X x4

Riferimenti

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Ristampe e Autorizzazioni

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