Hibridização in situ cromogênica SS uma ferramenta para diagnóstico de câncer de cabeça e pescoço relacionados ao HPV

Resumo

A hibridação in situ cromogênico do RNA do papilomavírus humano (HPV) é considerada ser um dos padrões do ouro para a deteção humana ativa da infecção do papilomavírus dentro dos tumores. Permite a visualização da expressão de mRNA de HPV E6-E7 com localização e avaliação semiquantitativa de seu sinal.

Resumo

A infecção pelo papilomavírus humano (HPV) é um fator de risco importante para um subtipo de carcinoma epidermóide orofaríngeo (OPSCC), que tende a estar associado a um melhor desfecho do que o OPSCC relacionado ao álcool e ao tabaco. A hibridação in situ chromogenic (cish) do RNA viral de HPV poderia permitir a avaliação semiquantitativa de transcritos virais das proteínas oncogênico E6 e E7 e de um visualização in situ com uma boa definição espacial. Essa técnica permite o diagnóstico de uma infecção ativa com a visualização da transcrição do HPV nas células tumorais infectadas pelo HPV. Uma vantagem desta técnica é a vacância da contaminação das pilhas HPV-infectadas nonneoplastic adjacentes ao tumor. Globalmente, seus desempenhos bons do diagnóstico têm-no considerado ser o padrão do ouro para a identificação ativa da infecção de HPV. Desde que a interação viral da proteína E6 e E7 com proteínas da pilha PRB e p53 é obrigatória para a transformação da pilha, o RNA cish de HPV é funcional relevante e reflete agudamente a infecção oncogênico ativa de HPV. Esta técnica é clinicamente relevante, bem como os níveis de transcrição do HPV "baixo" ou "alto" ajudaram na identificação de dois grupos de prognóstico entre os pacientes com câncer de cabeça e pescoço P16-positivos relacionados ao HPV. Aqui nós apresentamos o protocolo para o RNA manual CISH do HPV executado em corrediças parafina-encaixadas formalin-fixadas (FFPE) com um jogo obtido do fabricante. Em vez de revelação cromogênica, a hibridação in situ de RNA também pode ser realizada com revelação fluorescente (RNA FISH). Também pode ser combinada com imunocoloração convencional.

Introdução

O RNA cish de HPV é uma ferramenta poderosa para a deteção da infecção ativa de HPV, que pode provar crucial em lesões benignas ou malignos em vários locais tais como o orofaringe ou o colo uterino. A detecção de uma infecção ativa por HPV pode apoiar o diagnóstico de uma lesão induzida pelo HPV e, assim, influenciar seu tratamento e prognóstico.

O HPV é a infecção sexualmente transmissível mais frequente, e mais de 100 genótipos virais foram descritos¹. De forma esquemática, genótipos de baixo risco, como os genótipos 6 e 11, são conhecidos por induzir verrugas genitais, papilomatose respiratória recorrente e outras lesões benignas, enquanto genótipos de alto risco, como genótipos 16 e também 18, são responsáveis pela maioria dos cânceres cervicais e cânceres Anais e desempenham um papel na oncogênese da HNSCC em proporções variáveis como contabilizadas por dados epidemiológicos regionais².

Várias ferramentas estão disponíveis para a detecção de infecção por HPV. Como uma infecção por HPV de alto risco leva à expressão de proteínas oncogênicas virais E6 e E7³, a detecção de transcritos E6 e E7 é amplamente vista como o padrão-ouro para a identificação ativa da infecção pelo HPV⁴. O RNA CISH de HPV pode ser executado em amostras de FFPE que são obtidas completamente facilmente dos pacientes que sofrem de várias doenças HPV-relacionadas. Seu desempenho tem sido avaliado em neoplasia intraepitelial escamosa no colo do útero, no ânus e na vagina, e no carcinoma epidermóide invasivo no colo do útero, no ânus e no trato aerodigestivo superior⁵: atinge uma sensibilidade de mais de 98% entre os casos positivos da reacção em cadeia do polymerase do ADN de HPV (PCR). Isto é ligeiramente melhor do que a imunomarcação P16 (93%) e a hibridação in situ do ADN de HPV (ADN ISH: 97%), que são mais de uso geral. Em outra coorte de 57 pacientes com carcinoma epidermóide (CEC) decorrente da região da cabeça e pescoço, da região genital, da pele e do trato urinário, comparado ao DNA do HPV, o ARN do HPV CISH obteve melhor sensibilidade (100% versus 88%) e especificidade (87% versus 74%)⁶.

A imunocoloração P16 é um marcador indireto refletindo o rompimento do ciclo celular que pode ser causado (mas não exclusivamente) pela infecção pelo HPV^4,7. Este teste rentável possui boa sensibilidade e um valor preditivo negativo e é recomendado como um marcador substituto de infecção por HPV de alto risco no câncer de orofaringe (OPC) pelo Colégio de patologistas americanos (PAC) e pela União para o internacional Controle do câncer (UICC)⁸.

Embora este papel focalize unicamente na deteção do HPV em HNSCC, o RNA CISH de HPV é clinicamente relevante em várias outras circunstâncias que envolvem a infecção de HPV. Por exemplo, essa técnica pode melhorar a acurácia do diagnóstico de lesões intraepiteliais escamosas de baixo grau do colo do útero (LSIL, anteriormente conhecida como neoplasia intraepitelial cervical, grau 1 [NIC1]) para casos morfologicamente ambíguos⁹. Em relação ao CEC orofaríngeo, o ARN do HPV CISH permite a identificação do CEC relacionado ao HPV, rotulado como distinto do SCC orofaríngeo não relacionado ao HPV na recente oitava edição da classificação TNM do câncer de cabeça e pescoço (da União para câncer internacional Controle [UICC])¹⁰. Desde que o SCC HPV-relacionado apresenta um prognóstico melhor com sobrevivência mais longa e sensibilidade aumentada da radioterapia e da quimioterapia do que o SCC-não relacionado HPV^11,12,13, a deteção da infecção de HPV pode impactar gerência paciente^14,15. Adicionalmente, o RNA CISH de HPV pode ser usado para o diagnóstico da carcinoma sinonasal multiphenotypic HPV-relacionada com um sinal mais elevado do que o ADN CISH¹⁶de HPV. Várias análises multivariadas sugerem que a detecção de transcritos E6 e E7 está correlacionada com um melhor prognóstico em CEC orofaríngea global^7,15,17,18 e no subgrupo de SCC orofaríngea P16-positivo^19,20.

Aqui nós apresentamos o protocolo para o RNA manual CISH do HPV executado em corrediças de FFPE com um jogo obtido do fabricante.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes éticas e foi aprovado pelo Comitê de ética (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).

1. preparação dos materiais

1. Preparação do tampão de lavagem 1X
   1. Prepare 3 L de tampão de lavagem 1X adicionando 2,94 L de água destilada e um frasco (60 mL) de tampão de lavagem (50x) (veja a tabela de materiais) a um grande carboy. Misture bem.
      Nota: o tampão de lavagem 1X pode ser preparado antes do tempo e armazenado à temperatura ambiente por até 1 mês.
2. Preparação de reagentes de contrcoloração
   1. Prepare 50% de hematoxilina.
      1. Em uma capa de fumaça, adicione 100 mL de hematoxilina de Gill I (ver a tabela de materiais) para 100 ml de água destilada em um prato de coloração.
         Nota: a solução de coloração de hematoxilina a 50% pode ser reutilizada por até 1 semana.
   2. Prepare 0, 2% (p/v) de água de amônia (reagente bluing).
   3. Na capa de fumos, adicione 1,43 mL de 1 N de hidróxido de amônio a 250 mL de água destilada em um cilindro graduado ou outro recipiente. Selar o cilindro com filme de parafina. Misture bem o seu conteúdo para 3X – 5X.
      Nota: para a quantificação do ensaio, é fundamental o uso de hidróxido de amónio. Os reagentes podem ser preparados antes do tempo. Assegure-se de que todos os contêineres permaneçam cobertos.
3. Preparação do reagente de recuperação do alvo 1x
   1. Em uma taça grande, adicione 70 mL de reagente de recuperação alvo de 10x (ver a tabela de materiais) a 630 ml de água destilada.
   2. Coloque a taça sobre uma placa de aquecimento com um agitador magnético. Cubra-o com folha de alumínio.
   3. Ferver o seu conteúdo a 100 ° c por 10 – 15 min.
      Nota: não deixe ferver por mais de 30 min.
4. Equilibração do reagente
   1. Assegure-se de que o forno de hibridação está ligado e a 40 ° c. Coloque o papel umidificação molhado na parte inferior da bandeja.
      Nota: um forno de hibridação (ver a tabela de materiais) é necessário para os passos 3,4 a 4,2.
   2. Retire os reagentes de amplificação (AMP1 – AMP6, consulte a tabela de materiais) do frigorífico e mantenha-os à temperatura ambiente, pelo menos 30 minutos antes da etapa de incubação pertinente.
   3. Antes de cada utilização, aqueça as sondas alvo e/ou de controlo durante, pelo menos, 10 min a 40 ° c no forno ou num banho de água ou numa incubadora.

2. reforço da aderência e desparaffinization na capa das emanações

Nota: iniciar o protocolo com amostras histológicas de 3 – 5 μm de espessura montadas em lâminas não manchadas.

1. A fim de aumentar a aderência, assar as lâminas a 60 ° c por 1 h ou a 40 ° c durante a noite em um forno.
2. Carregue o rack de slides com lâminas histológicas não manchadas. Mergulhe o rack de slides por 5 min em xileno fresco contido em um prato de coloração, com agitação ocasional. Repita com xileno fresco.
3. Mergulhe o rack de slides por 3 min em fresco 100% etanol contido em um prato de coloração, com agitação constante. Repita com o etanol fresco de 100%.
4. Deixe as lâminas secar por 2 min à temperatura ambiente.
   Nota: não reutilizar reagentes de desparaffinização para desidratação das lâminas após o ensaio.

3. pré-tratamento de tecidos

Nota: estas etapas seguem a recomendação de pré-tratamento "padrão" de acordo com as instruções do fabricante para amostras de cabeça e pescoço. O sincronismo das seções 3,1 e 3,2 pode precisar de ser ajustado dependendo do tecido manipulado.

1. Bloqueio da atividade da peroxidase
   1. Adicionar 4 – 6 gotas de peróxido de hidrogênio (ver a tabela de materiais) para cada slide e incubar-los por 10 min à temperatura ambiente.
   2. Lave as lâminas 2x durante 2 min em água destilada à temperatura ambiente.
2. Ruptura dos limites do RNA/tecido
   1. Com uma garra, retire a folha de alumínio do reagente de recuperação do alvo de ebulição 1x (TTR1x) da seção 1,3 e pare de mexer. Mergulhe o rack de slides lentamente e com muito cuidado por 15 min. Cubra a taça novamente com a folha de alumínio.
      Nota: simmering tem de persistir durante esta etapa.
      Cuidado: Use a garra para manipular a folha de alumínio e a cremalheira de corrediça para evitar ferimentos da queimadura. Certifique-se de usar equipamento de proteção pessoal adequado, como luvas e um jaleco.
   2. Com a garra, transfira imediatamente a cremalheira quente da corrediça a um banho de água destilada e lave-a por 2 minutos.
      Nota: Certifique-se de que as amostras não esfriam no TTR1x.
   3. Lave as lâminas em etanol fresco 100% por 2 min.
   4. Deixe as lâminas secar à temperatura ambiente durante 2 min.
3. Criação de barreira
   1. Com uma caneta de barreira hidrofóbica (veja a tabela de materiais), desenhe uma barreira em torno da amostra. Deixe secar por pelo menos 5 min.
      Nota: permitir que a barreira para realmente secar. Se ele se desgasta durante o procedimento, não hesite em desenhá-lo novamente. Evite tocar o tecido com a caneta. O protocolo pode ser pausado durante a noite aqui.
4. Digestão da protease
   1. Coloque os slides no rack de slides e adicione ~ 4 gotas de protease Plus por amostra (consulte a tabela de materiais).
   2. Cubra a bandeja de controle de umidade com uma tampa e insira-a no forno de hibridação por 30 min a 40 ° c.
      Nota: para evitar a evaporação, certifique-se de que o manípulo de volta está completamente virado para a posição de bloqueio.
   3. Retire a bandeja do forno e retire o rack de slides.
   4. Um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque o slide em um rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com água destilada.
   5. Lave as lâminas 2x durante 2 min em água destilada à temperatura ambiente. Agitam constantemente.

4. executar o ensaio

Nota: não deixe secar as secções entre as etapas de incubação.

1. Hibridação da sonda de HPV
   Nota: Assegure-se de que as pontas de prova estejam pré-aqueceu para dissolver toda a precipitação antes do uso. Para este passo, em vez de sonda de HPV, peptidil-prolyl isomerase B (PPIB) para controle positivo ou diidrodipicolinate redutase (dapb) para controle negativo (ver a tabela de materiais) também pode ser usado.
   1. Toque e/ou deslize os slides para remover qualquer excesso de líquido e coloque-os no rack de slides. Adicionar ~ 4 gotas de sonda de HPV para cobrir inteiramente cada seção.
   2. Cubra a bandeja com uma tampa e insira-a no forno por 2 h a 40 ° c.
      Nota: para evitar a evaporação, certifique-se de que o Nob de turno está completamente virado para a posição de bloqueio.
   3. Retire a bandeja do forno e retire o rack de slides.
   4. Um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque o slide em um rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com 1x tampão de lavagem.
   5. Lave as lâminas no tampão de lavagem 1X durante 2 min à temperatura ambiente com agitação constante. Repita isto com o tampão de lavagem 1X fresco.
2. Hibridação de AMP1, AMP2, AMP3 e AMP4
   Nota: estas etapas incluem a hibridação no forno da hibridação e o AMP1-AMP4 do jogo comprado (veja a tabela dos materiais).
   1. Toque e/ou deslize o dedo para remover qualquer excesso de líquido dos slides e coloque-os no rack de slides. Adicionar ~ 4 gotas de AMP1 para cobrir inteiramente cada seção.
   2. Cubra a bandeja com uma tampa e insira-a no forno por 30 min a 40 ° c.
   3. Retire a bandeja do forno e retire o rack de slides.
   4. Um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque o slide em um rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com 1x tampão de lavagem.
   5. Lave as lâminas no tampão de lavagem 1X durante 2 min à temperatura ambiente com agitação constante. Repita isto com o tampão de lavagem 1X fresco.
   6. Repita os passos 4.2.1 – 4.2.5, mas use ~ 4 gotas de AMP2 em vez de AMP1 e incubar por 15 min a 40 ° c. Lave os slides 2x por 2 min, ambas as vezes em tampão de lavagem fresca.
   7. Repita os passos 4.2.1 – 4.2.5, mas use ~ 4 gotas de AMP3 em vez de AMP1 e incubar por 30 min a 40 ° c. Lave os slides 2x por 2 min, ambas as vezes em tampão de lavagem fresca.
   8. Repita os passos 4.2.1 – 4.2.5, mas use ~ 4 gotas de AMP4 em vez de AMP1 e incubar por 15 min a 40 ° c. Lave os slides 2x por 2 min, ambas as vezes em tampão de lavagem fresca.
3. Hibridação de AMP5 e AMP6
   Nota: estas etapas não incluem a hibridação no forno mas a hibridação na temperatura ambiente. AMP5 e AMP6 vêm do kit comprado (veja a tabela de materiais).
   1. Toque e/ou deslize os slides para remover qualquer excesso de líquido e coloque-os no rack de slides. Adicionar ~ 4 gotas de AMP5 para cobrir inteiramente cada seção.
   2. Cubra a bandeja com uma tampa e incubar por 30 min à temperaturaambiente.
   3. Um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e colocá-lo em um rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com 1x tampão de lavagem.
   4. Lave as lâminas no tampão de lavagem 1X durante 2 min à temperatura ambiente com agitação constante. Repita isto com o tampão de lavagem 1X fresco.
   5. Repita os passos 4.3.1 – 4.3.4, mas use ~ 4 gotas de AMP6 em vez de AMP5 e incubar por 15 min à temperatura ambiente. Lave os slides 2x por 2 min, ambas as vezes em tampão de lavagem fresca.

5. detecção de sinal com 3, 3 '-diaminobenzidina

PRECAUÇÃO: a diaminobenzidina (DAB) é tóxica. Siga as precauções apropriadas e as diretrizes de segurança ao descartar e manusear este produto químico.

1. Misture volumes iguais de DAB-A e DAB-B (ver a tabela de materiais) em um tubo de tamanho adequado, dispensando o mesmo número de gotas de cada solução. Fazer ~ 120 μL de substrato DAB por secção (~ 2 gotas de cada reagente/total de 4). Misture bem para 3X – 5X.
2. Pegue cada slide, um de cada vez, do rack de slides e toque e/ou mexa a tela para remover o excesso de líquido antes de colocá-lo no rack de slides.
3. Pipeta ~ 120 μL de DAB para cada secção de tecido. Assegure-se de que as secções estão cobertas e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
4. Descarte o DAB restante de acordo com a regulação local e insira o slide em um rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com água da torneira.

6. contrcoloração

1. Mova o rack de slides para um prato de coloração contendo 50% de solução de coloração de hematoxilina deixe descansar por 30 s à temperatura ambiente. Observe que os slides se tornarão roxos.
2. Transfira imediatamente o rack de slides de volta para um prato de coloração contendo água da torneira, e lave os slides 3X – 5X movendo o rack para cima e para baixo.
3. Continue repetindo a etapa de lavagem com água da torneira fresca até que as corrediças estejam desobstruídas, quando as seções permanecerem roxas.
4. Substitua a água da torneira no prato de coloração com água de amônia de 0, 2%. Mova o rack para cima e para baixo 2x – 3x. Observe que a seção de tecido deve se tornar azul.
5. Substitua a água da amônia com água da torneira. Lave as lâminas 3X – 5X.

7. desidratação

1. Mova o rack de slides para um prato de coloração contendo 70% de etanol na capa de fumaça e deixe descansar por 2 min com agitação ocasional.
2. Mova o rack de slides para um primeiro prato de coloração contendo 100% de etanol e deixe descansar por 2 min com agitação ocasional.
3. Mova o rack de slides para um segundo prato de coloração contendo 100% de etanol e deixe descansar por 2 min com agitação ocasional.
4. Mova o rack de slides para um prato de coloração contendo xileno e deixe descansar por 5 min com agitação ocasional.

8. montagem da corrediça

1. Remova os slides do rack de slides e coloque-os horizontalmente com as seções voltadas para cima na capa de fumaça.
2. Monte um slide de cada vez, adicionando 1 gota de um meio de montagem à base de xileno a cada slide e colocando cuidadosamente um lamela de 24 mm x 50 mm sobre a seção. Evite prender quaisquer bolhas de ar.
3. Seque as lâminas durante ≥ 5 min.

9. avaliação da amostra

1. Examine as seções do tecido um microscópio padrão do brightfield na ampliação 20x-40x.

Resultados

Como descrito aqui, no cancro de pilha Squamous da cabeça e da garganta, um caso pode ser considerado positivo na presença de mancha punctiforme marrom no citoplasma ou nos núcleos de pilhas do tumor. Na maioria dos estudos, o sinal é considerado como "positivo" ou "não detectado"¹⁴. Métodos de semiquantificação do sinal foram relatados, mas falta de padronização entre as equipes. Por exemplo, em alguns estudos, os sinais foram marcados como 1 + com 1 – 3 pontos por célula tumoral, 2 ...

Discussão

O RNA CISH de HPV executado com um jogo comprado é uma ferramenta poderosa para a deteção de transcritos virais e indica a infecção ativa de HPV. Executado manualmente, as etapas do protocolo são gerais fáceis de seguir, e o kit comprado é conveniente. Esta técnica permite a coloração de 19 amostras histológicas mais uma corrediça do controle de uma vez, e o ensaio dura ao redor 8 h. É crítico não deixar as amostras secar entre as etapas a menos que mencionado de outra maneira. A condição do pré-tratam...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1	Merck	GHS132
HybEZ Oven (110v)	Advanced Cell Diagnostics Inc.	321710
HybEZ slide rack	Advanced Cell Diagnostics Inc.	300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Advanced Cell Diagnostics Inc.	310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN	Advanced Cell Diagnostics Inc.	322310	This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe	Advanced Cell Diagnostics Inc.	320871	DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe	Advanced Cell Diagnostics Inc.	320861	PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent	Advanced Cell Diagnostics Inc.	322330	Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18	Advanced Cell Diagnostics Inc.	311121
RNAscope Target Retrieval Reagents	Advanced Cell Diagnostics Inc.	322000
RNAscope Wash Buffer Reagents	Advanced Cell Diagnostics Inc.	310091	Wash Buffer 50X x4