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요약

인간 유두종 바이러스(HPV) RNA 염색체는 종양 내의 활성 인간 유두종 바이러스 감염 검출에 대한 금 기준 중 하나로 간주된다. 그것은 그것의 신호의 현지화 그리고 반정적인 평가를 가진 HPV E6-E7 mRNA 발현의 가시화를 허용합니다.

초록

인간 유두종 바이러스 (HPV) 감염은 구인두 편평 상피 세포 암종 (OPSCC)의 특수형에 대한 주요 위험 인자이며, 이는 알코올 및 담배 관련 OPSCC보다 더 나은 결과와 연관되는 경향이 있습니다. HPV 바이러스 RNA의 체질 성 하이브리드화(CISH)에서 발색성 은 좋은 공간 분해를 가진 종양 발생 단백질 E6 및 E7의 바이러스 성 전사체의 반정적 평가를 허용할 수 있었다. 이 기술은 종양 HPV 감염 세포에 있는 HPV 전사의 가시화를 가진 액티브한 감염의 진단을 허용합니다. 이 기술의 장점은 종양에 인접한 비신생 HPV 감염 세포로부터의 오염을 피하는 것입니다. 전반적으로, 그것의 좋은 진단 성과는 액티브한 HPV 감염 확인을 위한 금 본위제로 여겨진. E6 및 E7 바이러스 성 단백질 세포 단백질 pRb 및 p53세포 변환에 필수적이기 때문에, HPV RNA CISH는 기능적으로 관련성이 있고 활성 종양 발생 성 HPV 감염을 심각하게 반영합니다. 이 기술은 HPV 관련 p16 양성 두경부 암 환자 중 2개의 예후 그룹의 식별을 도왔기 때문에 "낮음" 또는 "높은" HPV 전사 수준이 임상적으로 관련이 있다. 여기서 우리는 제조사로부터 얻은 키트와 함께 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 슬라이드에서 수행된 수동 HPV RNA CISH에 대한 프로토콜을 제시한다. 염색체 계시 대신에, 체형 혼성화에 있는 RNA는 또한 형광 계시 (RNA FISH)로 수행될 수 있습니다. 또한 통상적인 면역염색과 결합될 수 있다.

서문

HPV RNA CISH는 구로두또는 자궁 경부와 같은 다양한 위치에서 양성 또는 악성 병변에서 결정적인 역할을 할 수 있는 활성 HPV 감염의 검출을 위한 강력한 도구입니다. 활성 HPV 감염의 검출은 HPV 유도병변의 진단을 지원하고, 그로 인하여, 그것의 처리 및 예후에 영향을 미칠 수 있습니다.

HPV는 가장 빈번한 성병 감염이고, 100개 이상의 바이러스성 유전자형은 1. 개략적으로, 유전자형 6 및 11과 같은 저위험 유전자형은 생식기 사마귀, 재발성 호흡 유두종증 및 그밖 양성 병변을 유도하기 위하여 알려집니다, 반면 유전자형 16와 18와 같은 고위험 유전자형은 대부분의 자궁 경관암을 책임 집니다 및 항문암은 지역역학자료에 의해 고려되는 바와 같이 가변적인 비율로 HNSCC 종양발생에서 역할을 한다2.

HPV 감염의 검출을 위해 몇몇 공구는 유효합니다. 고위험성 HPV 감염이 바이러스 성 발현단백질 E6 및 E73의 발현을 유도함에 따라, E6 및 E7 전사체의 검출은 활성 HPV 감염 식별을 위한 금본위제로 널리 인식되고있다4. HPV RNA CISH는 다양한 HPV 관련 질환을 앓고 있는 환자로부터 아주 쉽게 수득되는 FFPE 샘플에서 수행될 수 있다. 그 성능은 자궁 경부, 항문 및 질에서 편평상피내 신생물에서 평가되었으며, 자궁 경부, 항문 및 상부 소화관의 침윤성 편평 상피 세포 암종에서5: 98 % 이상의 감도를 달성합니다. HPV DNA 중합효소 연쇄 반응 (PCR) - 양성 케이스 중. 이것은 p16 면역 염색 (93%)보다 약간 낫습니다. 및 HPV DNA는 보다 일반적으로 사용되는 체형화(DNA ISH: 97%)이다. 두경부 암종(SCC)을 가진 57명의 또 다른 코호트에서, HPV DNA ISH에 비해, 생식기 부위, 피부 및 요로에서 발생하는, HPV RNA CISH는 더 나은 감도를 달성 (100% 대 88%). 및 특이성 (87% 대74%) 6.

P16 면역염색은 HPV 감염4,7에의해 야기될 수 있는 세포 주기 중단을 반영하는 간접 마커이다(그러나 독점적으로는 아님). 이 비용 효과적인 시험은 좋은 감도와 부정적인 예측 값을 가지고 있으며 미국 병리학자 대학 (CAP)과 국제 연합에 의해 oropharynx 암 (OPC)의 고위험 HPV 감염의 대리 마커로 권장됩니다. 암 통제 (UICC)8.

이 논문은 전적으로 HNSCC에 있는 HPV의 검출에 집중하더라도, HPV RNA CISH는 HPV 감염을 관련시키는 각종 그밖 조건에서 임상으로 관련이 있습니다. 예를 들어, 이 기술은 형태학적으로 모호한 경우 9에 대해 자궁경부 내 상피내 신생물,등급 1[CIN1]으로 알려진 자궁경부의 저급 편평상피성 병변의 진단의정확도를 향상시킬 수 있다. 구인두 SCC에 관하여, HPV RNA CISH는 두경부암의 TNM 분류의 최근 제8판에서 HPV 관련 구인두 SCC와 구별되는 HPV 관련 SCC의 확인을 허용합니다 (국제암을 위한 연합의 제어 [UICC])10. HPV 관련 SCC는 HPV 관련 SCC11,12,13보다더 긴 생존과 향상된 방사선 요법 및 화학 요법 감도를 가진 더 나은 예후를 나타내기 때문에, HPV 감염의 검출은 영향을 미칠 수 있습니다 환자 관리14,15. 또한, HPV RNA CISH는 HPV DNA CISH16보다더 높은 신호를 가진 HPV 관련 다수성 부종 암종의 진단에 사용될 수 있다. 몇몇 다변량 분석은 E6와 E7 전사체의 검출이 구인두 SCC 전반에 있는 더 나은 예후와 상관된다는 것을 건의합니다7,15,17,18 및 p16 양성 구인두 SCC19,20의하위 그룹.

여기서 우리는 제조자로부터 얻은 키트와 함께 FFPE 슬라이드에서 수행된 수동 HPV RNA CISH에 대한 프로토콜을 제시한다.

프로토콜

이 프로토콜은 윤리 적 지침을 따르며 윤리위원회 (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04)의 승인을 받았습니다.

1. 재료의 준비

  1. 1x 세척 버퍼의 제조
    1. 2.94L의 증류수와 1병(60mL)의 세척 버퍼(50x)를 대형 카보이에 추가하여 1x 세척 완충액 3L을 준비합니다. 잘 섞으세요.
      참고 : 1x 세척 버퍼는 미리 준비하고 최대 1 개월 동안 실온에서 보관 할 수 있습니다.
  2. 카운터 스테인링 시약의 준비
    1. 50 % 헤마톡슬린을 준비하십시오.
      1. 연기 후드에 Gill's 헤마톡실린 I 100 mL을 염색 접시에 증류수 100 mL에 추가합니다.
        참고 : 50 % 헤마톡슬린 염색 용액은 최대 1 주 동안 재사용할 수 있습니다.
    2. 0.02% (v) 암모니아 물 (홍조 시약)을 준비하십시오.
    3. 연기 후드에 1.43 mL의 1 N 암모늄 수산화물을 250 mL의 증류수를 점원통 또는 다른 용기에 넣습니다. 파라핀 필름으로 실린더를 밀봉합니다. 그 내용을 3x-5x에 잘 섞어 보세요.
      참고: 분석 정량의 경우 수산화 암모늄을 사용하는 것이 중요합니다. 시약은 미리 제조될 수 있다. 모든 컨테이너가 덮여 있는지 확인합니다.
  3. 1x 표적 검색 시약의 준비
    1. 대형 비커에 70mL의 10x 대상 검색 시약(재료 표참조)을 증류수 630mL에 추가합니다.
    2. 비커를 마그네틱 교반기로 가열 플레이트에 놓습니다. 알루미늄 호일로 덮습니다.
    3. 내용물 100°C에서 10-15분 동안 끓입니다.
      참고: 30분 이상 끓이지 마십시오.
  4. 시약 평형
    1. 하이브리드화 오븐이 40°C에 있는지 확인합니다. 젖은 가습 용지를 트레이 바닥에 놓습니다.
      참고: 3.4~4.2단계의 경우 하이브리드화 오븐(재료 표참조)이 필요합니다.
    2. 증폭 시약 (AMP1-AMP6, 재료 표참조)을 냉장고에서 제거하고 관련 인큐베이션 단계 전에 적어도 30 분 전에 실온에서 보관하십시오.
    3. 매 번 사용하기 전에 오븐이나 수조 또는 인큐베이터에서 40°C에서 대상 및/또는 제어 프로브를 10분 이상 데우면 됩니다.

2. 연기 후드의 접착력 강화 및 탈파화

참고: 스테인드되지 않은 슬라이드에 장착된 3-5 μm 두께의 조직학적 샘플로 프로토콜을 시작합니다.

  1. 접착력을 높이기 위해 60°C에서 1시간 동안 또는 오븐에서 밤새 40°C에서 슬라이드를 굽습니다.
  2. 스테인드되지 않은 조직학적 슬라이드로 슬라이드 랙을 충전합니다. 슬라이드 랙을 염색 접시에 담긴 신선한 자일렌에 5분 간 담그고 가끔 씩 씩씩거리게 합니다. 신선한 자일렌과 함께 반복합니다.
  3. 슬라이드 랙을 염색 접시에 담긴 신선한 100% 에탄올에 3분 동안 담그고 일정한 교반을 합니다. 신선한 100% 에탄올로 반복합니다.
  4. 슬라이드를 실온에서 2분 동안 건조시키십시오.
    참고: 분석 분석 후 슬라이드의 탈수를 위해 탈파피화 시약을 재사용하지 마십시오.

3. 조직 전처리

참고: 이 단계는 머리와 목 샘플에 대한 제조업체의 지침에 따라 "표준" 전처리 권장 사항을 따릅니다. 섹션 3.1 및 3.2의 타이밍은 조작된 조직에 따라 조정될 필요가 있습니다.

  1. 과산화아제 활성 의 봉쇄
    1. 각 슬라이드에 과산화수소 4-6 방울을 넣고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
    2. 슬라이드를 실온에서 증류수로 2분 동안 2x 세척합니다.
  2. RNA/조직 경계의 파손
    1. 클로를 사용하면 1.3절에서 끓는 1x 표적 회수 시약(TTR1x)에서 알루미늄 호일을 제거하고 교반을 중지합니다. 슬라이드 랙을 15분 동안 천천히 조심스럽게 담그십시오.
      참고: 이 단계에서는 끓이면 계속 지속됩니다.
      주의: 발톱을 사용하여 알루미늄 호일과 슬라이드 랙을 조작하여 화상 부상을 방지하십시오. 장갑과 실험실 코트와 같은 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
    2. 발톱으로 뜨거운 슬라이드 랙을 증류수 욕조로 즉시 옮기고 2 분 동안 씻으십시오.
      참고: 샘플이 TTR1x에서 냉각되지 않는지 확인합니다.
    3. 슬라이드를 신선한 100% 에탄올로 2분 동안 씻습니다.
    4. 슬라이드를 실온에서 2분 동안 건조시고 말립니다.
  3. 배리어 생성
    1. 소수성 배리어 펜(재료 표참조)을 사용하여 샘플 주위에 장벽을 그립니다. 적어도 5 분 동안 건조시키십시오.
      참고: 장벽이 정말 마르도록 하십시오. 시술 중에 마모되면 주저하지 말고 다시 그리십시오. 펜으로 티슈를 만지지 마십시오. 여기서 는 밤새 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
  4. 프로테아제 소화
    1. 슬라이드 랙에 슬라이드를 놓고 샘플당 ~4 방울의 프로테아즈 플러스를 추가합니다(재료 표참조).
    2. 습도 조절 트레이를 뚜껑으로 덮고 40°C에서 30분 동안 혼성화 오븐에 넣습니다.
      참고: 증발을 방지하려면 회전 노브가 잠금 위치로 완전히 바뀌지 않았는지 확인합니다.
    3. 오븐에서 트레이를 분리하고 슬라이드 랙을 분리합니다.
    4. 한 번에 하나의 슬라이드, 신속하게 여분의 액체를 제거하고 증류수로 채워진 염색 접시에 잠긴 슬라이드 랙에 슬라이드를 배치합니다.
    5. 슬라이드를 실온에서 증류수로 2분 동안 2x 세척합니다. 끊임없이 교반합니다.

4. 분석기 실행

참고: 인큐베이션 단계 사이에 섹션이 마르지 않도록 하십시오.

  1. HPV 프로브의 혼성화
    참고: 사용하기 전에 침전을 용해시키기 위해 프로브가 미리 따뜻해지도록 하십시오. 이 단계의 경우, HPV 프로브대신에, 펩티딜-프로릴 이소머라아제 B(PPIB) 양성 대조군 또는 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제(DAPB)를 음의 제어를 위한(물질표 참조)도 사용될 수 있다.
    1. 슬라이드를 탭하거나 쓸어넘기면 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 놓습니다. HPV 프로브 4 방울을 추가하여 각 섹션을 완전히 덮습니다.
    2. 뚜껑으로 트레이를 덮고 40 °C에서 2 시간 동안 오븐에 삽입하십시오.
      참고: 증발을 방지하려면 회전 노브가 잠금 위치로 완전히 바뀌지 않았는지 확인합니다.
    3. 오븐에서 트레이를 분리하고 슬라이드 랙을 분리합니다.
    4. 한 번에 하나의 슬라이드, 신속하게 여분의 액체를 제거하고 1 x 세척 버퍼로 채워진 염색 접시에 잠긴 슬라이드 랙에 슬라이드를 배치합니다.
    5. 슬라이드를 1x 세척 버퍼로 1회 세척하여 실온에서 일정한 교반으로 2분 동안 세척합니다. 신선한 1x 세척 버퍼로 이 것을 반복합니다.
  2. AMP1, AMP2, AMP3 및 AMP4의 하이브리드화
    참고: 이러한 단계에는 하이브리드화 오븐의 혼성화와 구입한 키트의 AMP1-AMP4가 포함됩니다(재료 표참조).
    1. 탭 및/또는 쓸어넘기면 슬라이드에서 여분의 액체가 제거되고 슬라이드 랙에 놓습니다. 각 섹션을 완전히 커버하기 위해 ~ 4 방울의 AMP1을 추가하십시오.
    2. 뚜껑으로 트레이를 덮고 40 °C에서 30 분 동안 오븐에 삽입하십시오.
    3. 오븐에서 트레이를 분리하고 슬라이드 랙을 분리합니다.
    4. 한 번에 하나의 슬라이드, 신속하게 여분의 액체를 제거하고 1 x 세척 버퍼로 채워진 염색 접시에 잠긴 슬라이드 랙에 슬라이드를 배치합니다.
    5. 슬라이드를 1x 세척 버퍼로 1회 세척하여 실온에서 일정한 교반으로 2분 동안 세척합니다. 신선한 1x 세척 버퍼로 이 것을 반복합니다.
    6. 4.2.1-4.2.5 단계를 반복하지만 AMP1 대신 ~ 4 방울의 AMP2를 사용하고 40 °C에서 15 분 동안 배양하십시오. 슬라이드를 2x 2분 동안 세척하고, 두 번 모두 신선한 세척 버퍼로 세척합니다.
    7. 4.2.1-4.2.5 단계를 반복하지만 AMP1 대신 ~ 4 방울의 AMP3를 사용하고 40 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 슬라이드를 2x 2분 동안 세척하고, 두 번 모두 신선한 세척 버퍼로 세척합니다.
    8. 4.2.1-4.2.5 단계를 반복하지만 AMP1 대신 ~ 4 방울의 AMP4를 사용하고 40 °C에서 15 분 동안 배양하십시오. 슬라이드를 2x 2분 동안 세척하고, 두 번 모두 신선한 세척 버퍼로 세척합니다.
  3. AMP5와 AMP6의 혼성화
    참고: 이 단계에는 오븐의 혼성화가 포함되지 않고 실온에서 혼성화됩니다. AMP5 및 AMP6는 구입한 키트에서 제공됩니다(재료 표참조).
    1. 슬라이드를 탭하거나 쓸어넘기면 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 놓습니다. 각 섹션을 완전히 커버하기 위해 ~ 4 방울의 AMP5를 추가하십시오.
    2. 뚜껑으로 트레이를 덮고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
    3. 한 번에 하나의 슬라이드, 신속하게 여분의 액체를 제거하고 1 x 세척 버퍼로 채워진 염색 접시에 잠긴 슬라이드 랙에 배치합니다.
    4. 슬라이드를 1x 세척 버퍼로 1회 세척하여 실온에서 일정한 교반으로 2분 동안 세척합니다. 신선한 1x 세척 버퍼로 이 것을 반복합니다.
    5. 4.3.1-4.3.4 단계를 반복하지만 AMP5 대신 ~ 4 방울의 AMP6를 사용하고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 슬라이드를 2x 2분 동안 세척하고, 두 번 모두 신선한 세척 버퍼로 세척합니다.

5. 3,3'-다미노벤지딘신호 감지

주의: 디아미노벤지딘 (DAB)은 독성이 있습니다. 이 화학물질을 폐기하고 취급할 때는 적절한 예방 조치 및 안전 지침을 따르십시오.

  1. 각 용액의 동일한 수의 방울을 분배하여 적절한 크기의 튜브에 DAB-A 및 DAB-B(재료 표참조)의 동일한 볼륨을 혼합합니다. 섹션당 DAB 기판의 ~120 μL을 만드십시오 (각 시약 / 총 4 방울 ~ 2 방울). 3x-5x를 잘 섞으세요.
  2. 슬라이드 랙에서 한 번에 하나씩 각 슬라이드를 가져 가서 슬라이드 랙에 놓기 전에 여분의 액체를 제거하거나 탭하거나 쓸어 넘깁니다.
  3. 각 조직 섹션에 DAB의 피펫 ~ 120 μL. 섹션이 덮여 있는지 확인하고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
  4. 현지 규정에 따라 나머지 DAB를 폐기하고 슬라이드를 수돗물로 채워진 염색 접시에 잠긴 슬라이드 랙에 삽입합니다.

6. 카운터 스테인링

  1. 슬라이드 랙을 50% 헤마톡실린 염색 용액이 함유된 염색 접시로 옮기면 실온에서 30s 동안 휴식을 취하십시오. 슬라이드는 보라색이 됩니다.
  2. 즉시 슬라이드 랙을 수돗물이 들어있는 염색 접시로 다시 옮기고 랙을 위아래로 움직여 슬라이드를 3x-5x 씻어 내십시오.
  3. 슬라이드가 명확해질 때까지 깨끗한 수돗물로 세척 단계를 반복하고 섹션은 보라색으로 유지합니다.
  4. 염색 접시에 있는 수돗물을 0.02% 암모니아 물로 교체하십시오. 랙을 위아래로 2x-3x 이동합니다. 티슈 섹션이 파란색으로 바뀝니다.
  5. 암모니아 물을 수돗물로 교체하십시오. 슬라이드를 3x-5x 세척합니다.

7. 탈수

  1. 슬라이드 랙을 연기 후드에 70% 에탄올이 들어 있는 염색 접시로 옮기고 가끔 교반하여 2분 간 휴식을 취합니다.
  2. 슬라이드 랙을 100% 에탄올이 들어 있는 첫 번째 염색 접시로 옮기고 가끔 교반하여 2분 간 휴식을 취합니다.
  3. 슬라이드 랙을 100% 에탄올이 들어 있는 두 번째 염색 접시로 옮기고 가끔 교반하여 2분 간 휴식을 취합니다.
  4. 슬라이드 랙을 자일렌이 들어있는 염색 접시로 옮기고 가끔 교반하여 5분 간 휴식을 취합니다.

8. 슬라이드 장착

  1. 슬라이드 랙에서 슬라이드를 제거하고 연기 후드를 위로 향하여 섹션을 평평하게 놓습니다.
  2. 각 슬라이드에 자일렌 기반 마운팅 매체 1방울을 떨어뜨리고 24mm x 50mm 커버슬립을 섹션 위에 조심스럽게 배치하여 한 번에 하나의 슬라이드를 장착합니다. 기포를 포획하지 마십시오.
  3. 미끄럼을 ≥5분 동안 공기 건조시.

9. 샘플 평가

  1. 20x-40x 배율로 표준 브라이트필드 현미경으로 조직 섹션을 검사합니다.

결과

여기서 설명된 바와 같이, 두경부 편평세포암에서는, 세포질 또는 종양 세포의 핵에서 갈색 천공얼룩이 있는 경우 양성으로 간주될 수 있다. 대부분의 연구에서 신호는 "양성" 또는 "감지되지 않음"14로간주됩니다. 신호의 반정화 방법이 보고되었지만 팀 간의 표준화가 부족합니다. 예를 들어, 일부 연구에서는 신호가 종양 세포 당 1-3 점으로 1+, 종양 세포 당 4-9 점으로 2+ 또는 종?...

토론

구입한 키트로 수행된 HPV RNA CISH는 바이러스 성 전사체의 검출을 위한 강력한 도구이며 활성 HPV 감염을 나타냅니다. 수동으로 수행하면 프로토콜의 단계가 전반적으로 따라하기 쉽고 구입한 키트가 편리합니다. 이 기술은 19개의 조직학 견본 플러스 1개의 통제 미끄럼을 한 번에 염색하는 것을 허용하고, 분석결과는 약 8 시간 지속됩니다. 달리 언급되지 않는 한 샘플이 단계 간에 건조되지 않도록 ...

공개

CB: 보드, 세미나: MSD, BMS, 아스트라제네카, 로슈

감사의 말

저자는 호피탈 유로페엔 조르주 퐁피두와 네커 (로리안 샹볼레, 엘로디 미셸, 그리고 기젤 레갈)의 병리학 과에 감사드립니다; PARCC의 조직학 플랫폼, 호피탈 유로페엔 조르주 퐁피두 (코린 레사프레); 언어 편집을위한 버지니아 클라크; 알렉산드라 엘바키안의 공헌.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Hematoxylin solution, Gill No. 1MerckGHS132
HybEZ Oven (110v)Advanced Cell Diagnostics Inc.321710
HybEZ slide rackAdvanced Cell Diagnostics Inc.300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier PenAdvanced Cell Diagnostics Inc.310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWNAdvanced Cell Diagnostics Inc.322310This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control ProbeAdvanced Cell Diagnostics Inc.320871DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control ProbeAdvanced Cell Diagnostics Inc.320861PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus ReagentAdvanced Cell Diagnostics Inc.322330Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18Advanced Cell Diagnostics Inc.311121
RNAscope Target Retrieval ReagentsAdvanced Cell Diagnostics Inc.322000
RNAscope Wash Buffer ReagentsAdvanced Cell Diagnostics Inc.310091Wash Buffer 50X x4

참고문헌

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