JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Human papilloma virüsü (HPV) RNA kromojenik in situ hibridizasyon tümörlerde aktif insan papilloma virüsü Enfeksiyon algılama için altın standartlarından biri olarak kabul edilir. HPV E6-E7 mRNA ifadesinin lokalizasyonu ve sinyalinin seminiceliksel değerlendirilmesi ile görselleştirilmesini sağlar.

Özet

Human papilloma virüsü (HPV) enfeksiyonu, alkol ve tütün ile ilgili opscc 'den daha iyi bir sonuç ile ilişkili olma eğilimindedir Orofaringeal skuayöz Hücre Karsinomu (opscc) bir alt türü için önemli bir risk faktörüdür. HPV viral RNA 'nın kromojenik in situ hibridizasyon (cish), Onkojenik proteinlerin E6 ve E7 viral transkriptlerinin yarı niceliksel değerlendirilmesi ve iyi bir uzamsal çözünürlüğe sahip bir in situ görselleştirme sağlar. Bu teknik, tümör HPV enfekte hücrelerde HPV transkripsiyon görselleştirme ile aktif bir enfeksiyon tanısı sağlar. Bu tekniğin bir avantajı, tümörle bitişik olmayan neoplastik HPV enfekte hücrelerden kontaminasyondan kaçınmak. Genel olarak, iyi tanı performansları aktif HPV enfeksiyon tanımlaması için altın standardı olarak kabul etmiştir. Hücre proteinleri ile E6 ve E7 viral protein etkileşiminin sorun ve p53 için zorunlu olduğu için, HPV RNA cısh işlevsel olarak ilgilidir ve aktif Onkojenik HPV enfeksiyonunu akut yansıtır. Bu teknik, "düşük" veya "yüksek" HPV transkripsiyon düzeylerinin HPV ile ilgili P16 pozitif baş ve boyun kanseri hastalarında iki prognoz grubunun tanımlanmasına yardımcı olduğu için klinik olarak da ilgilidir. Burada, üreticiden elde edilen bir kit ile formalin-fixed parafin-Embedded (FFPE) slaytlarında gerçekleştirilen manuel HPV RNA CıSS protokolünü sunuyoruz. Kromojenik vahiy yerine, RNA içinde situ hibridizasyon da floresan Vahiy (RNA balık) ile yapılabilir. Ayrıca konvansiyonel immünostasyon ile birlikte olabilir.

Giriş

HPV RNA CıSH, orofarenks veya uterus serviks gibi çeşitli konumlarda benign veya malign lezyonlarda önemli olabilecek aktif HPV enfeksiyonunun tespiti için güçlü bir araçtır. Aktif bir HPV enfeksiyonunun tespiti, HPV kaynaklı bir lezyonun tanısını destekleyebilir ve böylece tedavi ve prognozunu etkileyebilir.

HPV en sık cinsel yolla bulaşan enfeksiyondur ve 100 ' den fazla viral genotip1tanımlanmıştır. Şematik olarak, genotiplerde 6 ve 11 gibi düşük riskli genotipler, genital siğiller, tekrarlayan solunum papillomatozu ve diğer benign lezyonlara neden olduğu bilinmektedir, ancak en servikal kanserlerden 16 ve 18 genotip gibi yüksek riskli genotipler de sorumludur ve anal kanserler ve bölgesel epidemiyolojik veri2tarafından muhasebeleştirilir olarak değişken oranlarda hnscc onkogeninde rol oynar.

HPV enfeksiyonunun algılanması için çeşitli araçlar mevcuttur. Yüksek riskli HPV enfeksiyonu, E6 ve E73' ün viral Onkojenik proteinlerinin ifadesine yol açtıkları Için, E6 ve E7 transkriptlerinin tespiti, aktıf HPV enfeksiyon tanımlaması için altın standart olarak yaygın olarak görülebilir4. HPV RNA CıSH, çeşitli HıPV ile ilgili hastalıklardan muzdarip hastalarından oldukça kolay elde edilen FFPE örneklerinde gerçekleştirilebilir. Performansı, serviks, anüs ve vajinanın içinde Skuam intraepitelyal neoplazisinde ve serviks, anüs ve üst Aerodigestive yolu5' te invazif skuanöz hücre karsinomunda değerlendirildi:% 98 ' den fazla duyarlılık elde etti HPV DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) arasında-pozitif durumlarda. Bu biraz daha iyi P16 immünostat (93%) ve HPV DNA In situ hibridizasyon (DNA ISH: 97%), daha yaygın olarak kullanılır. 57, baş ve boyun bölgesinden kaynaklanan Skuam Hücre Karsinomu (SCC), HPV DNA ıSH ile karşılaştırıldığında genital bölge, cilt ve idrar yollarının başka bir kohort, HPV RNA CıSH daha iyi duyarlılık elde (100% karşı 88%) ve özgüllük (% 87 karşı 74%)6.

P16 immünostasyon HPV enfeksiyonu tarafından (ancak sadece) neden olabilir hücre döngüsü bozulması yansıtan dolaylı bir işaretidir4,7. Bu uygun maliyetli test iyi duyarlılık ve negatif tahmin değeri vardır ve orofarenks kanserinde yüksek riskli HPV enfeksiyonu bir vekil Marker olarak tavsiye edilir (OPC) tarafından Amerikan patologlar Koleji (CAP) ve Birliği tarafından Uluslararası Kanser kontrolü (UıCC)8.

Bu yazıda yalnızca HNSCC 'de HPV 'nin saptanmasına odaklanmasına karşın, HPV RNA CıSH, HPV enfeksiyonu içeren diğer çeşitli koşullarda klinik olarak ilgilidir. Örneğin, bu teknik, morfolojik olarak belirsiz vakalar için serviks (LSIL, önceden servikal intraepitelyal neoplazi, Grade 1 [CıN1] olarak bilinen) düşük dereceli skuayöz intraepitelyal lezyonların tanısı doğruluğunu artırabilir9. Orofaringeal SCC ile ilgili olarak, HPV RNA cısh HPV ilişkili SCC tanımlaması sağlar, HPV ilgisiz orofarengeal SCC TNM sınıflandırması baş ve boyun kanseri son sekizinci baskısında farklı olarak etiketli (Uluslararası Kanser Birliği Kontrol [UıCC])10. HPV ile ilgili SCC daha uzun hayatta kalma ve gelişmiş radyoterapi ve HPV ilgisiz SCC11,12,13daha kemoterapi hassasiyeti ile daha iyi bir prognoz sergilediği için, HPV enfeksiyonu tespiti hasta yönetimi14,15. Ayrıca HPV RNA CıSH, HPV ile ilgili multiphenotipfik sinonazal karsinoma tanısı için HPV DNA CıSH16' dan daha yüksek sinyalle kullanılabilir. Birden çok değişkenli analizler, E6 ve E7 transkriptlerinin algılanması, Orofaringeal SCC genel olarak7,15,17,18 ve en iyi prognoz ile ilişkilidir. P16-pozitif orofarengeal SCC19,20alt grubu.

Burada, üreticiden elde edilen bir kit ile FFPE slaytlarında gerçekleştirilen manuel HPV RNA CıSH protokolünü sunuyoruz.

Protokol

Protokol etik kuralları takip eder ve Etik Komite (Comité-de-Protection-des-personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04) tarafından onaylanmıştır.

1. malzemelerin hazırlanması

  1. 1x yıkama tamponunun hazırlanması
    1. Hazırlamak 3 L 1x yıkama tampon ekleyerek 2,94 L distile su ve bir şişe (60 mL) yıkama tampon (50x) ( malzeme tablosunabakın) büyük bir carboy. İyi karıştırın.
      Not: 1x yıkama tamponu önceden hazırlanabilir ve 1 aya kadar oda sıcaklığında saklanır.
  2. Karşı boyama Reaktiflerin hazırlanması
    1. % 50 hematoxylin hazırlayın.
      1. Bir duman kaputu, eklemek 100 ml Gill 'in hematoksilen ı ( malzeme tablosunabakın) için 100 ml damıtılmış su bir boyama çanak.
        Not: 50% hematoksinlin boyama çözeltisi 1 haftaya kadar yeniden kullanılabilir.
    2. % 0,02 (w/v) amonyak suyu (bluing reaktif) hazırlayın.
    3. Duman kaputu, bir dereceli silindir veya başka bir kap içinde 250 mL distile su için 1 N amonyum hidroksit 1,43 mL ekleyin. Silindiri parafin filmi ile mühürleyin. İçeriğini 3x-5x için iyi karıştırın.
      Not: tahlil quantitation Için, amonyum hidroksit kullanmak için önemlidir. Reaktifler zamanın öncesinde hazırlanabilir. Tüm konteynerlerin kapalı kalmasını sağlayın.
  3. 1x hedef alma reaktörün hazırlanması
    1. Büyük bir Beaker, ekleyin 70 mL 10X hedef alma reakajının ( malzeme tablosunabakın) Için 630 ml distile su.
    2. Bir manyetik karıştırıcı ile bir ısıtma plakası üzerinde kabı yerleştirin. Alüminyum folyo ile kapak.
    3. 100 °C ' de 10 – 15 dakika boyunca içeriği kaynatın.
      Not: 30 dakikadan fazla kaynatmaya izin vermeyin.
  4. Reaktif Dengeleme
    1. Hibridizasyon fırın üzerinde ve 40 °c ' de olduğundan emin olun. Islak nemlendirme kağıdını tepsinin altına yerleştirin.
      Not: 4,2 için 3,4 adımlar için gerekli olan bir hibridizasyon fırın ( malzeme tablosunabakın).
    2. Amplifikasyon reaktiflerini çıkarın (AMP1 – AMP6, malzeme tablosunabakın) buzdolabından ve oda sıcaklığında tutmak, en az 30 dakika önce ilgili kuluçdak adım.
    3. Her kullanmadan önce, hedef ve/veya kontrol probları en az 10 dakika boyunca 40 °C ' de fırında veya su banyosundan veya kuluçkasında ısıtın.

2. duman kaputu içinde yapışma artırma ve deparafinizasyonda

Not: 3 – 5 μm kalınlığında histolojik örneklerle protokole başlayın ve lekelenmiş slaytlara monte edın.

  1. Yapışma geliştirmek için, 60 °C ' de 1 saat veya 40 °C ' de bir fırın içinde gece boyunca slaytlar pişirin.
  2. Slayt rafı lekelenmiş histolojik slaytlar ile şarj edin. Zaman zaman ajitasyon ile, bir boyama çanak bulunan taze Ksilin içinde 5 dk için slayt raf batırın. taze Ksilin ile tekrarlayın.
  3. Sürekli ajitasyon ile, bir boyama çanak içinde bulunan taze 100% etanol 3 dk için slayt raf batırın. Tekrar taze 100% etanol ile.
  4. Slaytlar oda sıcaklığında 2 dakika kuru edelim.
    Not: tahlil işleminden sonra slaytların deparafinizasyonda reaktifini yeniden kullanmayın.

3. doku ön tedavisi

Not: Bu adımlar, baş ve boyun örnekleri için üreticinin talimatlarına göre "standart" ön tedavi önerisi izleyin. 3,1 ve 3,2 bölümlerin zamanlaması, işlenmiş dokuya bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.

  1. Peroksidaz aktivitesinin blokajı
    1. Her slayda 4 – 6 damla hidrojen peroksit ekleyin ( malzeme tablosunabakın) ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca onları inküyeyin.
    2. 2 dk için 2x slaytları oda sıcaklığında damıtılmış suda yıkayın.
  2. RNA/doku sınırlarını kırma
    1. Bir pençe ile, 1,3 bölümünden alüminyum folyo kaynar 1x hedef alma reaktörden (TTR1x) çıkarın ve karıştırma durdurun. 15 dakika boyunca yavaşça ve çok dikkatli bir şekilde slayt rafa batırın. alüminyum folyo ile tekrar kap kapağı.
      Not: Bu adımda devam etmek Simmering vardır.
      DIKKAT: yanma yaralanmaları önlemek için böylece alüminyum folyo ve slayt raf işlemek için pençe kullanın. Eldiven ve laboratuvar ceket gibi uygun kişisel koruyucu ekipman giydiğinizden emin olun.
    2. Pençe ile, hemen bir damıtılmış su banyosu için sıcak slayt raf transferi ve 2 dakika yıkayın.
      Not: örnekleri TTR1x soğutmak değil emin olun.
    3. 2 dakika boyunca taze 100% etanol içinde slaytlar yıkayın.
    4. 2 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytlar kuru bırakın.
  3. Bariyer oluşturma
    1. Hidrofobik bariyer kalemiyle ( malzeme tablosunabakın), numunenin etrafında bir bariyer çizin. En az 5 dakika kurumasına izin verin.
      Not: bariyerin gerçekten kurumasını bekleyin. Eğer prosedür sırasında dışarı giyerse, tekrar çizmek için çekinmeyin. Kalemle dokuya dokunmaktan kaçının. Protokol gece burada duraklatılmış olabilir.
  4. Proteaz sindirim
    1. Slaytları Slayt rafına yerleştirin ve numune başına ~ 4 damla protease Plus ekleyin ( malzeme tablosunabakın).
    2. Nem kontrol tepsisini kapak ile Kapla ve 40 °C ' de 30 dakika boyunca hybridizasyon fırınına takın.
      Not: buharlaşma önlemek Için, Turn düğmesi tamamen kilit konumuna döndü emin olun.
    3. Tepsiyi Fırından çıkarın ve slayt rafı çıkarın.
    4. Bir defada bir slayt, hızlı bir şekilde herhangi bir aşırı sıvı kaldırmak ve damıtılmış su ile dolu bir boyama çanak içinde daldırma bir slayt raf içine slayt yerleştirin.
    5. 2 dk için 2x slaytları oda sıcaklığında damıtılmış suda yıkayın. Sürekli agitate.

4. tahlil koşma

Not: kuluçta adımları arasında bölümlerin kurumasına izin vermeyin.

  1. HPV prob hybridization
    Not: kullanım öncesinde herhangi bir yağış çözülür problar prewarmed emin olun. Bu adım için, HPV probyerine, peptidyl-prolyl izomeraz B (ppıb) pozitif kontrol için veya dihiddrodipicolinate redüktaz (dapb) negatif kontrol için ( malzeme tablosunabakın) da kullanılabilir.
    1. Fazla sıvıyı kaldırmak ve onları slayt rafa yerleştirmek için slaytlara dokunun ve/veya hafifçe vurun. Tamamen her bölümü kapsayacak şekilde HPV prob ~ 4 damla ekleyin.
    2. Tepsiyi kapak ile Kapla ve 40 °c' de 2 saat fırında takın.
      Not: buharlaşma önlemek Için, Turn Nob tamamen kilit konumuna döndü emin olun.
    3. Tepsiyi Fırından çıkarın ve slayt rafı çıkarın.
    4. Bir defada bir slayt, hızlı bir şekilde herhangi bir aşırı sıvı çıkarın ve 1 adet yıkama tampon ile dolu bir boyama çanak içinde daldırma bir slayt raf içine slayt yerleştirin.
    5. Sabit ajitasyon ile Oda sıcaklığında 2 dakika için 1x yıkama tampon içinde slaytlar yıkayın. Bu yeni 1x yıkama tampon ile tekrarlayın.
  2. AMP1, AMP2, AMP3 ve AMP4 hybridization
    Not: Bu adımlar hibridizasyon fırın ve AMP1 – AMP4 satın Kit ( malzeme tablosunabakın) hibridizasyon içerir.
    1. Slaytlardan gelen aşırı sıvıyı kaldırmak ve slayt rafına yerleştirmek için dokunun ve/veya hafifçe vurun. Tamamen her bölümü kapsayacak şekilde AMP1 ~ 4 damla ekleyin.
    2. Tepsiyi kapak ile Kapla ve 40 °c' de 30 dakika boyunca fırında takın.
    3. Tepsiyi Fırından çıkarın ve slayt rafı çıkarın.
    4. Bir defada bir slayt, hızlı bir şekilde herhangi bir aşırı sıvı çıkarın ve 1 adet yıkama tampon ile dolu bir boyama çanak içinde daldırma bir slayt raf içine slayt yerleştirin.
    5. Sabit ajitasyon ile Oda sıcaklığında 2 dakika için 1x yıkama tampon içinde slaytlar yıkayın. Bu yeni 1x yıkama tampon ile tekrarlayın.
    6. 4.2.1-4.2.5 arasındaki adımları yineleyin, ancak AMP1 yerine AMP2 ~ 4 damla kullanın ve 40 °c ' de 15 dakika boyunca inküye yapın. 2 dk, her iki kez taze yıkama tamponu için 2x slaytlar yıkayın.
    7. 4.2.1-4.2.5 adımları yineleyin, ancak AMP1 yerine AMP3 ~ 4 damla kullanın ve 40 °c ' de 30 dakika boyunca inkübe edin. 2 dk, her iki kez taze yıkama tamponu için 2x slaytlar yıkayın.
    8. 4.2.1-4.2.5 arasındaki adımları yineleyin, ancak AMP1 yerine AMP4 ~ 4 damla kullanın ve 40 °c ' de 15 dakika boyunca inküye yapın. 2 dk, her iki kez taze yıkama tamponu için 2x slaytlar yıkayın.
  3. AMP5 ve AMP6 hybridization
    Not: Bu adımlar fırın içinde hibridizasyon içermez ama oda sıcaklığında hibridizasyon. AMP5 ve AMP6 satın alınan Kit ( malzeme tablosunabakın) gelir.
    1. Fazla sıvıyı kaldırmak ve onları slayt rafa yerleştirmek için slaytlara dokunun ve/veya hafifçe vurun. Tamamen her bölümü kapsayacak şekilde AMP5 ~ 4 damla ekleyin.
    2. Tepsiyi kapak ile Kapla ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın.
    3. Bir defada bir slayt, hızlı bir şekilde herhangi bir aşırı sıvı kaldırmak ve 1 adet yıkama tampon dolu bir boyama çanak içinde daldırma bir slayt raf yerleştirin.
    4. Sabit ajitasyon ile Oda sıcaklığında 2 dakika için 1x yıkama tampon içinde slaytlar yıkayın. Bu yeni 1x yıkama tampon ile tekrarlayın.
    5. Adımları tekrarlayın 4.3.1 – 4.3.4, ancak kullanın ~ 4 damla AMP6 yerine AMP5 ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inküye. 2 dk, her iki kez taze yıkama tamponu için 2x slaytlar yıkayın.

5.3, 3 '-diaminobenzidin ile sinyal algılama

DIKKAT: diaminobenzidin (DAB) zehirlidir. Bu kimyasalı elden çıkarmak ve ele aldığınızda uygun önlemler ve güvenlik kurallarını takip edin.

  1. DAB-A ve DAB-B ' y e eşit hacimleri karıştırın ( malzeme tablosunabakın), her bir çözümün aynı sayıda damlalarını dağıtarak uygun boyutta bir tüpte. Bölüm başına DAB substrat ~ 120 μL (her reakajın ~ 2 damla/toplam 4) olun. 3x-5x için iyi karıştırın.
  2. Her slayt, bir kerede, slayt raf ve dokunun ve/veya slayt rafa yerleştirmeden önce aşırı sıvı kaldırmak için Flick alın.
  3. Pipet ~ 120 her doku bölümü üzerine DAB μL. Bölümlerin kapalı olduğundan emin olun ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inküye yapın.
  4. Kalan DAB ' i yerel yönetmeliğe göre atın ve slaytı musluk suyuyla dolu bir boyama çanağı içinde yer alan bir slayt rafa yerleştirin.

6. karşı boyama

  1. Slayt rafı,% 50 hematoksinlin boyama çözeltisi içeren bir boyama çanağına taşıyın, oda sıcaklığında 30 s için dinlensin. Slaytların mor olacağını unutmayın.
  2. Hemen slayt rafı musluk suyu içeren bir boyama çanak geri aktarın ve raf yukarı ve aşağı hareket ettirerek 3-5x slaytlar yıkayın.
  3. Bölümler mor kaldığı sırada, slaytlar açık olana kadar taze musluk suyu ile yıkama adımını tekrar tutun.
  4. % 0,02 Amonyak su ile boyama çanak musluk suyu değiştirin. Raf yukarı ve aşağı 2x – 3x taşıyın. Doku bölümünün maviye dönmeli olduğunu unutmayın.
  5. Amonyak suyunu musluk suyuyla değiştirin. Slaytlar 3x – 5x yıkayın.

7. dehidrasyon

  1. Slayt raf duman kaputu% 70 etanol içeren bir boyama çanak taşıyın ve zaman zaman ajitasyon ile 2 dakika dinlensin.
  2. Slayt raf% 100 etanol içeren bir ilk boyama çanak taşıyın ve ara sıra ajitasyon ile 2 dakika dinlensin.
  3. 100% etanol içeren ikinci bir boyama çanak için slayt raf hareket ve ara sıra ajitasyon ile 2 dakika dinlensin.
  4. Slayt raf ksile içeren bir boyama çanak taşıyın ve ara sıra ajitasyon ile 5 dakika dinlensin.

8. slayt montajı

  1. Slaytları Slayt rafından çıkarın ve onları, duman kaputunda yukarı bakan bölümlerle düz bir şekilde bırakın.
  2. Her slayda 1 damla ksile bazlı montaj ortamı ekleyerek bir defada bir slayt monte edin ve bölüm üzerinde 24 mm x 50 mm 'lik lamel magazini dikkatle yerleştiriniz. Herhangi bir hava kabarcıkları bindirme kaçının.
  3. Hava-kuru slaytlar ≥ 5 dk.

9. örnek değerlendirme

  1. 20X-40X büyütme standart aydınlık alan mikroskop altında doku bölümlerini inceleyin.

Sonuçlar

Burada açıklandığı gibi, baş ve boyun skuayöz hücre kanserinde, bir olgu sitoplazmada veya tümör hücrelerinin çekirdeklerinde kahverengi daktiform lekemesinde olumlu düşünülebilir. Çoğu çalışmada, sinyal "pozitif" veya "algılanmadı"14olarak kabul edilir. Sinyal semiquantification yöntemleri rapor edilmiştir ama takımlar arasındaki standardizasyon eksikliği. Örneğin, bazı çalışmalarda, sinyaller 1 + olarak 1 +-3 tümör hücresi başına nokta, 2 + ile 4 – 9 tüm...

Tartışmalar

Satın alınan bir kit ile gerçekleştirilen HPV RNA CıSH, viral transkriptlerin tespiti için güçlü bir araçtır ve aktif HPV enfeksiyonu gösterir. El ile gerçekleştirilen, protokolün adımları genel olarak kolaylıkla takip edilir ve satın alınan Kit uygundur. Bu teknik, bir kerede 19 histolojik numune artı bir kontrol slayt boyama sağlar ve tahlil etrafında sürer 8 h. Aksi belirtilmediği sürece örnekleri adımları arasında kuru izin vermek için önemli değildir. Ön tedavi koşulu işlenmiş do...

Açıklamalar

CB: panoları, seminerler: MSD, BMS, AstraZeneca, Roche

Teşekkürler

Yazarlar Hopital Européen Georges Pompidou ve Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel ve Gisèle Legall) patolojisi bölümüne teşekkür; PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre) Histoloji platformu; Virginia Clark dil düzenleme için; Onun katkısı için Alexandra Elbakyan.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Hematoxylin solution, Gill No. 1MerckGHS132
HybEZ Oven (110v)Advanced Cell Diagnostics Inc.321710
HybEZ slide rackAdvanced Cell Diagnostics Inc.300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier PenAdvanced Cell Diagnostics Inc.310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWNAdvanced Cell Diagnostics Inc.322310This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control ProbeAdvanced Cell Diagnostics Inc.320871DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control ProbeAdvanced Cell Diagnostics Inc.320861PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus ReagentAdvanced Cell Diagnostics Inc.322330Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18Advanced Cell Diagnostics Inc.311121
RNAscope Target Retrieval ReagentsAdvanced Cell Diagnostics Inc.322000
RNAscope Wash Buffer ReagentsAdvanced Cell Diagnostics Inc.310091Wash Buffer 50X x4

Referanslar

  1. Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
  2. Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?. Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
  3. Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
  4. Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
  5. Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
  6. Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
  7. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
  8. Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
  9. Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
  10. El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. . WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).
  11. Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
  12. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  13. Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
  14. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
  15. Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
  16. Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
  17. Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
  18. Kuo, K. -. T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
  19. Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
  20. Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
  21. Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
  22. Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
  23. Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
  24. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 148kromojenik in situ hybridizationHPVtranskripsiyonyar niceliksel analizba ve boyun kanseriE6E7RNAskuan z H cre Karsinomu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır