肺動脈収縮による右心室障害の誘導とマウスにおける右心室機能の評価

要約

ここでは、右心室不全のメカニズムを研究するための有用なアプローチを提供する。肺動脈収縮へのより便利で、有効なアプローチは、社内で作られた手術器具を使用して確立されます。さらに、心エコー検査およびカテーテル法によるこのアプローチの品質を評価する方法が提供される。

要約

右心室不全(RVF)のメカニズムは、RVFの一意性、高い罹患率、高い死亡率、および難治性の性質に起因する明確化を必要とする。RVF進行を模倣する以前のラットモデルが記載されている。ラットと比較して、マウスはよりアクセスしやすく、経済的で、動物実験で広く使用されています。我々は、マウスの肺幹をバンド状にして右心室(RV)肥大を誘導する肺動脈収縮(PAC)アプローチを開発した。特別な外科ラッチの針は大動脈および肺幹のより容易な分離を可能にする設計されていた。我々の実験では、この製造されたラッチ針の使用は、動脈下出血のリスクを低減し、90%に外科的成功率を改善しました。我々は正確にRV肥大の異なる程度を誘発することができる定量的な収縮を作成するために、異なるパディング針の直径を使用しました。非侵襲的な胸部心エコー検査で測定したPAの血流速度を評価して収縮の程度を定量した。RV機能は、手術後8週間で右心カテーテル法により精密に評価した。社内で作られた外科器械は習得し易い簡単なプロセスを使用して共通の材料で構成されていた。したがって、ここで説明するPACアプローチは、ラボで作られた機器を使用して模倣することが容易であり、他のラボで広く使用することができます。本研究は、他のモデルよりも成功率が高く、手術後8週間の生存率が97.8%である修正されたPACアプローチを提示する。このPACアプローチは、RVFのメカニズムを研究するための有用な技術を提供し、RVFの理解を深める。

概要

RV機能障害(RVD)は、異常なRV構造または機能の証拠としてここで定義され、不十分な臨床結果と関連している。RVFは、RV機能の最終段階として、進行性RVD1に起因する心不全の徴候および症状を伴う臨床症候群である。構造と生理機能の違いにより、左心室障害(LV)とRVFは異なる病態生理学的メカニズムを有する。RVFにおけるいくつかの独立した病態生理学的メカニズムは、β2-アドレナリン受容体シグナル伝達2、炎症3、横管状リモデリング、およびCa2+取り扱い機能不全4の過剰発現を含む報告されている。.

RVFは、RVの体積または圧力過負荷によって引き起こされる可能性があります。以前の動物モデルは、低酸素症(SuHx)5、6^またはモノクロタリン7と組み合わせてSU5416(血管内皮成長因子受容体の強力かつ選択的阻害剤)を使用して、肺高血圧を誘発し、肺血管疾患2に二次的なRVFをもたらす。これらの研究を行う研究者は、RVFの病理学的進行の代わりに血管系に焦点を当てた。さらに、モノクロタリンは、正確に心原性疾患を表すことができない余分な心臓効果を有する。他のモデルは、体積過負荷とRVF⁸を誘発するために動脈シャントを使用しています。しかし、この手術は、RVFの産生に長い誘導期間を必要とするマウスにとって、実行が困難であり、不適切である。

バンディングクリップを使用したラットPACモデルも9、10が存在します。ラットと比較して、マウスは、より容易な生殖、より広範な使用、コストの削減、および遺伝子改変へのアクセスなど、心臓疾患の動物モデルとして多くの利点を^{有する11。}ただし、バンディング クリップの直径は通常 0.5 mm から 1.0 mm の範囲で、マウス⁹では大きすぎます。さらに、バンディングクリップは、他のラボで生産、模倣、普及が困難です。

我々は、報告された研究に基づいて改変された生殖RVFマウスモデルを開発するためのプロトコルを提供し、PACを使用してファロット症候群およびヌーナン症候群または他の肺動脈高血圧症12,13、 ^{14,15,16,17,18,19}.このPACアプローチは、収縮の程度を制御するために社内で作られたラッチとパディング針を使用してマウスの肺幹をライゲーションすることによって作成されます。ラッチの針は、シリンジを通過する編組シルク縫合糸を持つ90°湾曲注射注射器で作られています。針は習得しやすいプロセスを使用して共通の材料からなされる。パッディングの針はゲージの針から120°曲げられた。マウスの重量(20-35 g)に応じて、異なる直径(0.6〜0.8 mm)のパディング針が使用されます。また、心エコー検査と右心カテーテル法によりRVFモデルの安定性と品質を判定するための評価基準を確立する。他の実験で広く使用されているため、マウスをモデル動物として使用しています。実験室で作られた針は再生し易く、他の実験室で広く使用することができる。本研究は、研究者がRVFのメカニズムを調査するための良いアプローチを提供する。

プロトコル

すべての手順は、米国国立衛生研究所が発行する実験動物のケアと使用に関するガイド(NIH出版第85-23号、1996年改訂)に準拠した動物研究のための制度ガイドラインに従って行われました。C57BL/6オスマウス(生後8~10週、体重20〜25g)は、南医科大学動物センターによって提供された。到着後、マウスは12/12時間の暗い/光サイクルの下に収容され、十分な食物と水を用いた。

1. 手術器具の準備と針の製造

1. 滅菌手術器具(図1A)、ライゲーション用の6-0編組シルク縫合糸(図1B[a])、切開閉鎖用の5-0ナイロン縫合糸(図1B[b])を調製する。
2. 6-0編組シルク縫合糸(図1B[a])を1mL注射注射器から分解した25Gの針を通します。次に、止血鉗子で針を90°カーブしてラッチ針を作ります(図1C[a])。22 G 針 120° (図 1C (b)) をカーブして、パディング針を作成します。

2. 手術の準備

1. 手術前にすべての手術器具をオートクレーブ。加熱パッドを 37 °C に調整します。痛みの軽減のためのキシラジン(5 mg/kg)とケタミン(100 mg/kg)の混合物で精米注射によってマウスを麻酔する。麻薬の発症を待つために個々の箱にマウスを置きます。
   注:吸入麻酔に1.5%のイソフランを使用することもお勧めします。
2. ペダル離脱反射の消失による麻酔の妥当性を監視します。縫合剤で切開器を固定し、粘着テープで脚を固定することにより、加熱パッド上のステープの状態にマウスを保ちます。反射をもう一度チェックして、麻酔の深さを確認してください。
3. 首から皮膚に脱毛ペーストを塗布し、キシフォイドプロセスにします。ヨウ素で地域を消毒し、75%のアルコールが続きます。
4. 気管内挿管を行う。
   1. 動物のミニベンチレーター(図1D)パラメータを調整し、呼吸数を150/分に設定し、潮の体積を300 μLに設定します。
   2. 尖ったペンチを使って舌を少し引き出し、ラボ製のスパチュラ図1C[c])でマンディブルを上げて溝を露出させ、冷たい光源を通して溝を通してラボ製の気管カニューレ(図1C[d])を柔らかく挿入します。 喉頭に向けられた。
   3. チューブと人工呼吸器を接続して、カニューレが気管に挿入されているかどうかを確認します。カニューレが正しく挿入されている場合は、粘着テープを使用して気管を固定します。

3. 手術

1. 胸を開けろ
   1. 第2肋骨に平行な皮膚の切開を行い、長さ約10mm、眼用はさみで切開する。切開が胸骨の角度から始まり、左の前軸線で終わることを確認してください。胸骨の角度から肋骨を数えることによって、2番目の肋間空間を識別します。
   2. このスペースを露出させる2番目の肋間空間の上にハサミと肘ピンセットで胸郭メジャーと胸部のマイナーな筋肉を分離し、カットします。
      注:胸筋を率直に分離し、動員し、胸筋を右と頭蓋に動かすこともお勧めします。
   3. ひじピンセットで第2肋間空間をぶっきらぼうに貫通し、このスペースを開きます。その後、肺幹が見えるまで、パレンキマと胸腺を率直に分離する。
2. 肺動脈を収縮させる。
   1. 肺幹と上流大動脈を肘ピンセットで率直に分離します。肺幹と上昇大動脈の間の結合組織をラッチ針で縫合糸を通過させる。
   2. パディング針(ステップ1.2を参照)を肺幹に置き、6-0編組シルク縫合糸を使用して、パディング針と一緒に肺幹をリゲートします。肺コーンの充填が観察された直後にパディング針を取り外し、縫合糸の端を切断する。
   3. 肺線の充填を観察し、収縮が存在するかどうかを評価する。ライゲーションの成功を確実にするために、動物の反射を再度評価します。
      注:収縮を除く上記のすべての手順に従って、偽の手術を行います。
3. 5-0ナイロン縫合で胸と皮膚を閉じます。75%のアルコールで再び皮膚を消毒する。
4. 手術中に失われた液体を交換するために皮下に生理生理生理大生理物を0.5 mL注入する。回復を促進するために、加熱パッドで別々にケージにマウスを置きます。意識が戻ったら、12/12 hの明暗サイクルルームでマウスをケージに戻します。次の3日間、飲料水を介してブプレノルフィンでマウスを治療します。
5. 最初の週の間にマウスを1日2倍モニタリングして、治癒不足、運動障害、または体重減少の兆候を検出することにより、胸部切開創傷の治癒に特別な注意を払う。

4. 手術後のRV機能の心エコー評価

注:心エコーの変化は、手術の3日後に検出することができます。

1. 吸入を通じて3%のイソファランでマウスを麻酔し、1.5%のイソファルランで麻酔の深さを維持する。プラットフォーム上でマウスを固定し、爪を電極にテープで留め、動物をサフィンの位置に維持します。イソファランの濃度を1.5%から2.5%の間で調整することにより、マウスの心拍数を450~550拍/分の間に維持します。
2. 脱毛クリームでマウスの胸の毛を取り除き、胸の皮膚に超音波ゲルを適用します。
3. 30 MHzプローブで肺幹の収縮を評価します。
   1. プローブを左のパラスターラインに対して反時計回りに30°に保ち、ノッチをカウド方向に向けます。僧帽弁、大口、LVチャンバがはっきりと見えるまで、Bモードの下でY軸とx軸を調整します。
   2. プローブをY軸上のプローブを胸に向かって回転させます。肺の中心がはっきりと見えるまでY軸とx軸を調節する。
   3. 肺弁リーフレットの先端にカーソルを置き、ピークフロー速度を測定します。カラードップラーモードを使用して、[色]を押し、続いてPWを押し、カーソルを動かしてPW破線を血流方向に平行に配置します。
   4. 肺動脈のピーク速度を測定します。Cine ストアとフレームストアでデータとイメージを保存します。
4. 30 MHz プローブを使用して RV パラメータを評価します。
   1. パッドの左側を右側より低く調整します。プローブは、右の前軸線に沿って水平線に向かって 30° に向けて、ノッチがカウド方向に向かって保ちます。RVが明確に表示されるまで、Y 軸とx軸を調整します。
   2. Mモード2xを押してインジケーターラインを表示します。RVチャンバ寸法、小数短さ、および RV 壁の厚さを測定します。Cine ストアとフレームストアでデータとイメージを保存します。
5. イソファラン吸入を停止して、マウスが意識を回復し、12時間の明暗サイクルルームで動物をケージに戻します。

5. RV機能を評価するための右心カテーテル法

注:右心カテーテル法は、1.0 Fカテーテルおよびモニタリングシステムを用いてRV機能を評価するために手術後8週間行った。

1. オートクレーブすべての手術器具。キシラジン(5mg/kg)とケタミン(100mg/kg)の混合物で精米注射を介して動物を麻酔する。
2. ペダルの引き出し反射が消えた後、プラットフォーム上のマウスを固定し、電極に爪をテープで留め、マウスをスフィン位置に維持します。脱毛クリームで外科領域の毛を取り除きます。
3. 75%のアルコールで外科区域の皮を消毒する。尖ったペンチを使用して、舌を少し引き出し、口腔内で作られたへらでマンディブルを上げ、口腔内に冷たい光源が放射物に向けられている間、口腔内で作られた気管カニューレを静かに挿入します。換気を支援するために人工呼吸器(図1E)を使用してください。
4. 眼科のはさみと鉗子で横隔膜を通してxiphoidプロセスの下の1.5 cmの両側切開によって胸腔を開く。横隔膜と肋骨を眼科はさみで切り取り、心臓を露出させる。23 G針でRV自由壁を貫通し、針を取り外します。綿棒で穿刺ポイントを軽く押して出血を止めます。傷口を通してカテーテル先端で心室を穿刺する。
   注:右頚静脈6を介して右の心臓カテーテル法を行うこともお勧めします。カテーテルの先端が心室にある場合、モニターはRV圧力カーブを表示する。
5. RV収縮期血圧、RV末拡張期圧、RV dP/dt、マウスの心拍数、およびカーブが安定している場合に10分間のリラクゼーション(タウ)のRV指数定数を記録します。ソフトウェアを使用して、[選択] をクリックし、[分析] をクリックします。
6. RV流出管に向かってカテーテルの先端を調節する。録音が完了したら、カテーテルを引き出します。測定が完了したら、カテーテルを生理食生に置きます。
7. ペントバルビタールナトリウム150mg/kgの食後注射によりマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。次に、血液形態学および分子生物学的分析のために心臓、肺、脛痛を収穫する。

結果

本研究では、マウスをPAC群(n=9)またはシャム操作群(n=10)にランダムに割り当てた。心エコー検査は手術後1、4、8週で行った。手術の8週間後、最後の心エコー検査とカテーテル法の評価に続いて、マウスを安楽死させ、その心臓を形態学的および組織学的評価のために採取した。

肺幹の収縮がRV肥大を引き起こ...

ディスカッション

RV充填圧力の病理学的増加は中隔の左シフトをもたらし、LV幾何^学21を変更することができる。これらの変化は、心拍出量の減少およびLV排出率(LVEF)に寄与し、循環^系22の全行力学的障害を引き起こす可能性がある。したがって、RVFのメカニズムを研究するための効率的で安定した、経済的なモデルは貴重である。

当社は、社内で作られ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ALC-V8S ventilator	SHANGHAI  ALCOTT  BIOTECH  CO	ALC-V8S	Assist ventilation
Animal Mini Ventilator	Haverd	Type 845	Assist ventilation
Animal ultrasound system VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	Echocardiography
Cold light illuminator	Olympus	ILD-2	Light
Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI  ALCOTT  BIOTECH  CO	ALC-HTP-S1	Heating
Isoflurane	RWD life science	R510-22	Inhalant anaesthesia
Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthetization
Medical braided silk suture (6-0)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.	6-0	Ligation
Medical nylon suture (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	Suture
Millar Catheter (1.0 F)	AD instruments	1.0F	For right heart catheterization
Pentobarbital sodium salt	Merck	25MG	Anesthetization
PowerLab multi-Directional physiological Recording System	AD instruments	4/35	Record the result of right heart catheterization
Precision electronic balance	Denver Instrument	TB-114	Weighing sensor
Self-made latch needle			Separate the aorta and pulmonary trunk
Self-made padding needle			Constriction
Self-made tracheal intubation			Tracheal intubation
Small animal microsurgery equipment	Napox	MA-65	Surgical instruments
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	Echocardiography
Veet hair removal cream	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Remove hair of mice
Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer	Hefei Huatai Medical Equipment Co.	LX-B50L	Auto clean the surgical instruments
Vertical small animal surgery microscope	Yihua Optical Instrument	Y-HX-4A	For right heart catheterization