폐 동맥 수축에 의한 우심실 장애 유도 및 마우스의 우심실 기능 평가

요약

여기에서, 우리는 우심실 실패의 기계장치를 공부하기 위한 유용한 접근을 제공합니다. 폐 동맥 수축에 대한 보다 편리하고 효율적인 접근법은 사내에서 만든 수술 기구를 사용하여 확립됩니다. 또한, 심초음파 및 카테터화에 의한 이러한 접근법의 품질을 평가하는 방법이 제공된다.

초록

우심실 장애(RVF)의 메커니즘은 RVF의 고유성, 높은 사망률 및 내화성 특성으로 인한 설명이 필요합니다. RVF 진행을 모방하는 이전 래트 모델이 설명되었다. 쥐에 비해, 마우스는 더 접근, 경제적, 그리고 동물 실험에 널리 사용. 우리는 오른쪽 심실 (RV) 비대를 유도하기 위하여 마우스에 있는 폐 트렁크를 밴딩으로 이루어져 있는 폐 동맥 수축 (PAC) 접근을 개발했습니다. 대동맥과 폐 트렁크를 쉽게 분리할 수 있도록 특수 수술용 래치 바늘이 설계되었습니다. 우리의 실험에서, 이 날조된 래치 바늘의 사용은 동맥 경증의 리스크를 감소시키고 90%로 수술 성공률을 향상시켰습니다. 우리는 다른 패딩 바늘 직경을 사용하여 RV 비대의 다른 정도를 유도 할 수있는 양적 수축을 정확하게 생성했습니다. 우리는 비침습적 경피성 심초음파에 의해 측정된 PA의 혈류 속도를 평가하여 수축의 정도를 정량화했습니다. RV 기능은 수술 후 8주에서 오른쪽 심장 카테터로 정밀하게 평가하였다. 사내에서 제작된 수술기구는 마스터하기 쉬운 간단한 공정을 사용하여 일반적인 재료로 구성되었습니다. 따라서 여기에 설명된 PAC 접근 방식은 실험실에서 만든 계측기를 사용하여 모방하기 쉽고 다른 실험실에서 널리 사용할 수 있습니다. 이 연구는 다른 모델보다 더 높은 성공률과 97.8 %의 8 주 수술 후 생존율을 가지고 수정 된 PAC 접근 방식을 제시한다. 이 PAC 접근법은 RVF의 메커니즘을 연구하는 데 유용한 기술을 제공하며 RVF에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

서문

비정상적인 RV 구조 또는 기능의 증거로 서 여기 정의 된 RV 기능 장애 (RVD) 가난한 임상 결과와 관련 된. RVF는 RV 기능의 최종 단계로, 진보적 인 RVD^1에서발생하는 심부전의 징후와 증상을 가진 임상 증후군입니다. 구조와 생리 기능의 차이로 좌심실 (LV) 실패와 RVF는 다른 병리학적 메커니즘을 가지고 있습니다. RVF에 있는 몇몇 독립적인 병리생리학 기계장치는 β2 아드레날린 수용체 신호의 과발현을포함하여 보고되었습니다 2, 염증^3,가로 tubule 개조 및 Ca²⁺ 취급 역기능⁴ .

RVF는 RV의 부피 또는 압력 과부하로 인해 발생할 수 있습니다. 이전 동물 모델은 SU5416 (혈관 내피 성장 인자 수용체의 강력하고 선택적 억제제)를 저산소증 (SuHx)^5,6 또는 모노 크로탈린^7과 결합하여 폐 고혈압을 유도했습니다. RVF 는 폐 혈관 질환에 이차^2. 이 연구 결과를 수행하는 연구원은 RVF의 병리학적인 진행 대신에 혈관 구조에 집중했습니다. 또한, monocrotaline정확 하 게 심장 질환을 나타낼 수 없는 여분의 심장 효과. 다른 모델은 부피 과부하 및 RVF 8을 유도하기위해 동맥 션트를 사용했습니다. 그러나, 이 수술은 RVF의 생산을 위한 긴 유도 기간을 요구하는 마우스를 위해 능력을 발휘하기 어렵고 부적절합니다.

밴딩 클립을 사용하는 쥐PAC 모델도 9,^10이존재합니다. 쥐에 비해, 마우스는 심장 질환의 동물 모델로서 많은 장점을 가지고 있으며, 예를 들어더 쉽게 번식, 더 광범위하게 사용, 비용 절감, 및 유전자 변형에 대한 접근11. 그러나 밴딩 클립의 직경은 일반적으로 0.5 mm에서 1.0 mm범위이며,이는 마우스 9에 대해 너무 큽합니다. 또한 밴딩 클립은 다른 실험실에서 제작, 모방 및 대중화하기가 어렵습니다.

우리는 팔롯과 누난 증후군 또는 다른 폐 동맥 고혈압 질환의 사각을 모방하기 위해 PAC를 사용하는 보고 된 연구에 기초하여 수정 된 생식 RVF 마우스 모델을 개발하는 프로토콜을 제공합니다^12,13 ,^{13, 14,15,16,17,18,19}. 이 PAC 접근법은 수축의 정도를 제어하기 위해 사내에서 만든 래치 및 패딩 바늘을 사용하여 마우스의 폐 트렁크를 결찰함으로써 생성됩니다. 래치 바늘은 90° 곡선 주입 주사기로 만들어졌으며, 편조 실크 봉합사가 주사기를 통과합니다. 바늘은 마스터하기 쉬운 공정을 사용하여 일반적인 재료로 만들어집니다. 패딩 바늘은 게이지 바늘에서 120 ° 구부러져 있습니다. 다른 직경 (0.6-0.8 mm)를 가진 패딩 바늘은 마우스의 무게 (20-35 g)에 따라 사용됩니다. 또한 심초음파 와 우측 심장 카테터에 의한 RVF 모델의 안정성과 품질을 결정하기 위한 평가 기준을 설정합니다. 우리는 다른 실험에서 그들의 광범위 한 사용 때문에 모델 동물으로 마우스를 사용. 실험실에서 만든 바늘은 재생하기 쉽고 다른 실험실에서 널리 사용할 수 있습니다. 이 연구는 연구원이 RVF의 메커니즘을 조사하는 좋은 접근 법을 제공합니다.

프로토콜

모든 절차는 미국 국립 보건원(NIH 간행물 85-23호, 1996년 개정)에 의해 간행된 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 가이드를 준수하는 동물 연구를 위한 기관 지침에 따라 수행되었습니다. C57BL/6 수컷 마우스 (8-10 주, 무게 20-25 g) 사우스 의과 대학의 동물 센터에 의해 제공 되었다. 도착 후, 마우스는 충분한 음식과 물과 함께 12/12 h 의 어두운 / 빛 주기 하에 보관되었습니다.

1. 외과 기구의 준비 및 바늘의 제조

1. 멸균 수술기구(도1A),결찰을 위한 6-0 편조 실크 봉합사(그림 1B[a])를 준비하고, 절개폐쇄를 위한 5-0 나일론 봉합사를 준비한다(도1B[b]).
2. 6-0 편조 실크 봉합사(도 1B[a])를 1 mL 주사기로부터 분해된 25 G 바늘을 통과한다. 그런 다음 지혈구 집게로 바늘을 90°로 구부어 래치 바늘을 만듭니다(도 1C[a]). 패딩 바늘을 만들기 위해 22G 바늘을 120° (도1C (b)))를 구부리십시오.

2. 수술 준비

1. 수술 전에 모든 수술 기구를 오토클레이브하십시오. 가열 패드를 37 °C로 조정합니다. 진통 완화를 위해 자일라진 (5 mg/kg)과 케타민 (100 mg /kg)을 혼합하여 복강 내 주사로 마우스를 마취시다. 마약 발병을 기다릴 개별 상자에 마우스를 놓습니다.
   참고 : 흡입 마취를 위해 1.5 %의 이소플루란을 사용하는 것이 좋습니다.
2. 페달 철수 반사의 실종에 의해 마취의 적절성을 모니터링합니다. 봉합사로 앞니를 고정하고 접착 테이프로 다리를 고정하여 가열 패드의 척추 위치에 마우스를 유지합니다. 마취의 깊이를 확인하기 위해 다시 반사를 확인하십시오.
3. 목에서 xiphoid 과정에 피부에 제모 페이스트를 적용합니다. 요오드로 부위를 소독한 다음 75 % 알코올을 소독하십시오.
4. 내측 성 삽관을 수행합니다.
   1. 동물 미니벤틸레이터의 (그림1D)매개 변수를 조정하고 호흡 속도를 150 / min로 설정하고 조수 부피를 300 μL로 설정합니다.
   2. 뾰족한 펜치를 사용하여 혀를 약간 당기고, 실험실에서 만든 주걱 그림 1C[c])로 하악을 높이고, 실험실을 부드럽게 삽입하여 기관캐뉼라(그림 1C[d])를 glottis를 통해 삽입하고, 차가운 광원이 있는 동안 후두에 지시.
   3. 튜브와 인공호흡기를 연결하여 캐뉼라가 기관에 삽입되었는지 확인합니다. 캐뉼라가 올바르게 삽입된 경우 접착 테이프를 사용하여 기관을 고정합니다.

3. 수술

1. 가슴을 엽니다.
   1. 안과 가위와 함께 두 번째 갈비뼈에 평행하게 피부절개를, 길이 약 10mm. 절개가 흉골 각도에서 시작하여 왼쪽 전방 차축 선에서 끝나는지 확인합니다. 흉골 각도에서 갈비뼈를 계산하여 두 번째 늑간 공간을 식별합니다.
   2. 분리하고 이 공간을 노출하는 두 번째 늑간 공간 위에 가위와 팔꿈치 핀셋으로 가슴 주요 및 가슴 작은 근육을 잘라.
      참고 : 그것은 또한 무딘 분리하는 것이 좋습니다, 동원, 오른쪽과 cranially로 가슴 근육을 이동.
   3. 팔꿈치 핀셋으로 두 번째 늑간 공간을 무뚝뚝하게 관통하고이 공간을 엽니 다. 그런 다음 폐 트렁크가 보일 때까지 자구와 흉선으로 무뚝뚝하게 분리합니다.
2. 폐 동맥을 수축시.
   1. 팔꿈치 핀셋으로 폐 트렁크와 오름차순 대동맥을 무뚝뚝하게 분리합니다. 래치 바늘로 폐 트렁크와 오름차순 대동맥 사이의 결합 조직을 통해 봉합사를 전달합니다.
   2. 패딩 바늘(1.2단계 참조)을 폐 트렁크에 놓고, 6-0 편조 실크 봉합사를 사용하여 패딩 바늘과 함께 폐 트렁크를 분리합니다. 폐 후유증의 충전이 관찰된 직후 패딩 바늘을 제거하고 봉합사의 끝을 잘라냅니다.
   3. 수축이 존재하는지 여부를 평가하기 위해 폐 콘의 충진을 관찰하십시오. 결찰의 성공을 보장하기 위해 동물의 반사를 다시 평가하십시오.
      참고: 수축을 제외한 위의 모든 단계를 수행하여 가짜 수술을 수행하십시오.
3. 5-0 나일론 봉합사로 가슴과 피부를 닫습니다. 75% 알코올로 피부를 다시 소독하십시오.
4. 식염수 0.5 mL을 피하 주사하여 수술 중 손실된 액체를 대체합니다. 마우스를 가열 패드와 별도로 케이지에 놓아 복구를 촉진합니다. 의식이 돌아올 때 12/12 시간 빛 / 암흑 주기 방에서 자신의 케이지에 마우스를 반환합니다. 다음 3 일 동안 그들의 식수를 통해 buprenorphine와 쥐를 치료.
5. 불충분 한 치유의 흔적을 감지 하기 위해 첫 주 동안 하루에 2 배 쥐를 모니터링 하 여 흉부 상처의 치유에 특별 한 주의, 장애인된 이동성, 또는 체중 감소.

4. 수술 후 RV 기능의 심초음파 평가

참고: 심초음파 변화는 수술 후 3일 후에 감지할 수 있습니다.

1. 흡입을 통해 3 % 이소플루란으로 마우스를 마취시키고 1.5 % 이소플루란으로 마취의 깊이를 유지하십시오. 플랫폼에 마우스를 고정하고 발톱을 전극에 테이프로 붙이고 동물을 척추 위치에 유지하십시오. 이소플루란의 농도를 1.5%에서 2.5%로 조정하여 마우스의 심박수를 450-550비트/분 사이로 유지합니다.
2. 제모 크림으로 마우스 가슴에 머리카락을 제거하고 가슴의 피부에 초음파 젤을 적용합니다.
3. 30MHz 프로브로 폐 트렁크 수축을 평가합니다.
   1. 좌측 파라스테날 라인을 기준으로 프로브를 시계 반대 방향으로 30° 유지하면서 노치를 코그랄 방향으로 향하게 합니다. 승모판막, 대동맥 및 LV 챔버가 명확하게 표시될 때까지 B 모드 아래의 y축 및 x-축을 조절합니다.
   2. y축에서 프로브를 30°-40°로 회전시면 가슴쪽으로 회전합니다. 폐 콘이 명확하게 표시 될 때까지 y축 및 x-축을 조절하십시오.
   3. 피크 유속을 측정하기 위해 폐 밸브 리플렛 끝에 커서를 놓습니다. 색상을 누른 다음 PW를누른 다음 커서를 이동하여 PW 파선선을 혈류 방향과 평행하게 배치하여 색상 도플러 모드를 사용합니다.
   4. 폐 동맥 피크 속도를 측정합니다. Cine 스토어 및 프레임저장소로 데이터와 이미지를 저장합니다.
4. 30MHz 프로브로 RV 파라미터를 평가합니다.
   1. 패드의 왼쪽을 조정하여 오른쪽보다 낮게 합니다. 프로브의 방향을 30°로 유지하여 오른쪽 전방 겨드랑이 선을 따라 수평선을 따라 노치가 꼬리 방향을 가리키도록 합니다. RV가 명확하게 표시될 때까지 y축 및 x-축을 조절합니다.
   2. M 모드 2를 눌러 표시선을 표시합니다. RV 챔버 치수, 소수 단축 및 RV 벽 두께를 측정합니다. Cine 스토어 및 프레임저장소로 데이터와 이미지를 저장합니다.
5. 마우스가 의식을 회복한 다음 12 시간 빛 / 어두운 사이클 룸에서 동물을 케이지로 되돌릴 수 있도록 이소플루란 흡입을 중지하십시오.

5. RV 기능을 평가하기위한 오른쪽 심장 카테터

참고: 오른쪽 심장 카테터화는 수술 후 8주 후에 RV 기능을 평가하기 위해 1.0 F 카테터와 모니터링 시스템을 사용하여 수행되었습니다.

1. 모든 수술 기구를 오토클레이브합니다. 자일라진 (5 mg /kg)과 케타민 (100 mg / kg)의 혼합물로 복강 내 주사를 통해 동물을 마취시.
2. 페달 인출 반사가 사라진 후 플랫폼에서 마우스를 고정하고 발톱을 전극에 테이프로 붙이고 마우스를 척추 위치에 유지하십시오. 제모 크림으로 수술 부위의 머리카락을 제거하십시오.
3. 75 % 알코올로 수술 부위의 피부를 소독하십시오. 뾰족한 펜치를 사용하여 혀를 살짝 당기고, 글로티스를 노출시키기 위해 사내에서 만든 주걱으로 하악을 높이고, 차가운 광원이 후두를 향하는 동안 글로티스를 통해 사내에서 만든 기관 캐뉼라를 부드럽게 삽입하십시오. 환기장치(그림1E)를사용하여 환기를 돕습니다.
4. 안과 가위와 집게로 횡격막을 통해 xiphoid 과정 아래 1.5 cm 양측 절개에 의해 가슴 구멍을 엽니 다. 다이어프램과 갈비뼈를 안과 가위로 잘라 심장을 노출시다. 23G 바늘로 RV 자유 벽에 침투하고 바늘을 제거; 면봉으로 천자 점을 부드럽게 눌러 출혈을 막습니다. 상처를 통해 카테터 팁으로 심실을 뚫습니다.
   참고 : 오른쪽 경정맥 6을 통해 오른쪽 심장 카테터를 수행하는 것이 좋습니다. 카테터 팁이 심실에 있으면 모니터에 RV 압력 곡선이 표시됩니다.
5. 곡선이 안정될 때 RV 수축기 혈압, RV 말단 확장기 압력, RV dP/dt, 마우스의 심박수 및 RV 지수 시간 상수(Tau)를 10분 동안 기록합니다. 소프트웨어를 사용하여 선택을 클릭한 다음 을클릭합니다.
6. 카테터의 끝을 RV 유출로 조절합니다. 녹화가 완료된 후 카테터를 당깁니다. 측정이 끝나면 카테터를 식염수에 놓습니다.
7. 펜토바르비탈 나트륨 150 mg/kg의 복강 내 주사로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구를 수행합니다. 그런 다음 조직학 및 분자 생물학적 분석을 위해 심장, 폐 및 경골을 수확합니다.

결과

본 연구에서, 마우스는 PAC 군(n=9) 또는 sham 수술기(n=10)에 무작위로 할당되었다. 심초음파는 수술 후 1, 4 및 8주에서 수행되었습니다. 수술 후 8주 후, 마지막 심초음파 및 카테터화 평가에 따라 마우스는 안락사되었고, 그들의 마음은 형태학적 및 조직학적 평가를 위해 수확되었다.

폐 트렁크 수축은 RV 비대를 일으...

토론

RV 충진 압력의 병리학적 증가는 LV 지오메트리^21을변경할 수있는 중격의 좌측 이동을 초래합니다. 이러한 변화는 순환계(22)의 혈역학적 장애를 유발할 수 있는 감소된 심장 출력및 LV 배출 분율(LVEF)에 기여한다. 따라서 RVF의 메커니즘을 연구하기 위한 효율적이고 안정적이며 경제적인 모델이 중요합니다.

우리는 자체 제작 래치와 패딩 바늘...

자료

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