Inducción de la insuficiencia ventricular derecha por constricción pulmonar de la arteria y evaluación de la función ventricular derecha en ratones

Resumen

Aquí, proporcionamos un enfoque útil para estudiar el mecanismo de la insuficiencia ventricular derecha. Se establece un enfoque más conveniente y eficiente de la constricción de la arteria pulmonar utilizando instrumentos quirúrgicos hechos internamente. Además, se proporcionan métodos para evaluar la calidad de este enfoque mediante ecocardiografía y cateterismo.

Resumen

El mecanismo de insuficiencia ventricular derecha (RVF) requiere aclaración debido a la singularidad, alta morbilidad, alta mortalidad y naturaleza refractaria de la FVR. Se han descrito modelos de ratas anteriores que imitan la progresión de RVF. En comparación con las ratas, los ratones son más accesibles, económicos y ampliamente utilizados en experimentos con animales. Desarrollamos un enfoque de constricción de la arteria pulmonar (PAC) que se compone de bandas del tronco pulmonar en ratones para inducir hipertrofia ventricular derecha (RV). Se diseñó una aguja de pestillo quirúrgico especial que permite una separación más fácil de la aorta y el tronco pulmonar. En nuestros experimentos, el uso de esta aguja de pestillo fabricada redujo el riesgo de arteriorrhexis y mejoró la tasa de éxito quirúrgico al 90%. Utilizamos diferentes diámetros de aguja de relleno para crear con precisión constricción cuantitativa, que puede inducir diferentes grados de hipertrofia RV. Cuantificamos el grado de constricción evaluando la velocidad del flujo sanguíneo de la AP, que se midió mediante ecocardiografía transtorácica no invasiva. La función de RV se evaluó con precisión mediante cateterismo cardíaco derecho a las 8 semanas después de la cirugía. Los instrumentos quirúrgicos hechos internamente estaban compuestos de materiales comunes utilizando un proceso simple que es fácil de dominar. Por lo tanto, el enfoque PAC descrito aquí es fácil de imitar utilizando instrumentos hechos en el laboratorio y puede ser ampliamente utilizado en otros laboratorios. Este estudio presenta un enfoque de PAC modificado que tiene una tasa de éxito más alta que otros modelos y una tasa de supervivencia postcirugía de 8 semanas del 97,8%. Este enfoque PAC proporciona una técnica útil para estudiar el mecanismo de RVF y permitirá una mayor comprensión de RVF.

Introducción

La disfunción RV (RVD), definida aquí como evidencia de una estructura o función anormal de RV, se asocia con resultados clínicos deficientes. RVF, como la etapa final de la función RV, es un síndrome clínico con signos y síntomas de insuficiencia cardíaca que resultan de la RVD progresiva¹. Con diferencias en la estructura y la función fisiológica, la falla ventricular izquierda (LV) y la RVF tienen diferentes mecanismos fisiopatológicos. Se han notificado algunos mecanismos fisiopatológicos independientes en RVF, incluida la sobreexpresión de la señalización del receptor adrenérgico², la inflamación^3,la remodelación del túbulo transversal y la disfunción de manejo de Ca^{2+ 4} .

El RVF puede ser causado por la sobrecarga de volumen o presión de la RV. Modelos animales anteriores han utilizado SU5416 (un inhibidor potente y selectivo del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular) combinado con hipoxia (SuHx)^5,6 o monocrotalina⁷ para inducir hipertensión pulmonar, que resultados en RVF secundaria a la enfermedad vascular pulmonar². Los investigadores que realizaron estos estudios se centraron en la vasculatura en lugar de la progresión patológica de la RVF. Además, la monocrotalina tiene efectos extracardiacos que no pueden representar con precisión la enfermedad cardiogénica. Otros modelos han utilizado derivaciones arteriovenosaspara inducir sobrecarga de volumen y RVF 8. Sin embargo, esta cirugía es difícil de realizar e inapropiada para ratones, que requieren largos períodos de inducción para la producción de RVF.

Los modelos PAC de rata que utilizan clips de banda también existen^9,10. En comparación con las ratas, los ratones tienen muchas ventajas como modelos animales de enfermedades cardíacas, como una reproducción más fácil, un uso más generalizado, costos reducidos y acceso a la modificación genética^11. Sin embargo, los diámetros de los clips de banda suelen oscilar entre0,5 mm y 1,0 mm, que son demasiado grandes para ratones 9. Además, el clip de banda es difícil de producir, imitar y popularizar en otros laboratorios.

Proporcionamos un protocolo para desarrollar un modelo de ratón RVF reproductivo modificado basado en estudios reportados, que utiliza PAC para imitar la tetralogía del síndrome de Fallot y Noonan u otras enfermedades hipertensivas arteriales pulmonares^{12,13, 14,15,16,17,18,19}. Este enfoque pac se crea ligando el tronco pulmonar de los ratones usando un pestillo y una aguja de acolchado hecha internamente para controlar el grado de constricción. La aguja del pestillo está hecha de una jeringa de inyección curva de 90o con una sutura de seda trenzada que pasa a través de la jeringa. La aguja está hecha de materiales comunes utilizando un proceso que es fácil de dominar. La aguja de acolchado está curvada a 120o de la aguja del medidor. Se utilizan agujas de relleno con diferentes diámetros (0,6-0,8 mm), dependiendo del peso de los ratones (20-35 g). Además, establecemos un criterio de evaluación para determinar la estabilidad y calidad del modelo RVF mediante ecocardiografía y cateterismo cardíaco derecho. Utilizamos ratones como animal modelo debido a su uso generalizado en otros experimentos. Las agujas fabricadas en el laboratorio son fáciles de reproducir y pueden ser ampliamente utilizadas en otros laboratorios. Este estudio proporciona un buen enfoque para que los investigadores investiguen el mecanismo de RVF.

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Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales para la investigación animal, que se ajustan a la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (Publicación No 85-23 de la NIH, revisada en 1996). C57BL/6 ratones macho (8-10 semanas de edad, con un peso de 20-25 g) fueron proporcionados por el Centro De Animales de la Universidad Médica del Sur. Después de la llegada, los ratones fueron alojados bajo un ciclo oscuro/claro de 12/12 h, con suficiente comida y agua.

1. Preparación de los instrumentos quirúrgicos y fabricación de las agujas

1. Preparar los instrumentos quirúrgicos estériles (Figura1A),una sutura de seda trenzada 6-0 (Figura1B[a]) para la ligadura, y una sutura de nylon 5-0 para el cierre de incisión (Figura1B[b]).
2. Pasar la sutura de seda trenzada 6-0 (Figura1B[a]) a través de una aguja de 25 G desmontada de una jeringa de inyección de 1 ml. A continuación, curva rinde la aguja 90o con fórceps hemostáticos para hacer una aguja de pestillo (Figura1C[a]). Curva rinde la aguja de 22 G 120o (Figura1C (b)) para hacer una aguja de acolchado.

2. Preparación para la cirugía

1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía. Ajustar la almohadilla de calentamiento a 37 oC. Anestetizar a los ratones mediante inyección intraperitoneal con una mezcla de xilazina (5 mg/kg) y ketamina (100 mg/kg) para aliviar el dolor. Coloque los ratones en cajas individuales para esperar la aparición de narcóticos.
   NOTA: También se recomienda utilizar 1,5% de isoflurano para la anestesia inhalante.
2. Controlar la adecuación de la anestesia por la desaparición del reflejo de retirada del pedal. Mantenga los ratones en la posición supina en la almohadilla de calentamiento fijando los incisivos con una sutura y fijando las patas con cinta adhesiva. Revise el reflejo de nuevo para asegurar la profundidad de la anestesia.
3. Aplicar la pasta depilatoria en la piel desde el cuello hasta el proceso de xifoide. Desinfectar el área con yodo seguido de 75% de alcohol.
4. Realizar intubación endotraqueal.
   1. Ajuste los parámetros del miniventilador animal (Figura1D)y ajuste la frecuencia respiratoria a 150/min y el volumen de marea a 300 oL.
   2. Tire de la lengua ligeramente usando alicates puntiagudos, eleve la mandíbula con una espátula hecha en laboratorio Figura 1C[c]) para exponer la glotis, e inserte suavemente una cánula de tráquea hecha de laboratorio (Figura1C[d]) a través de la glotis mientras que una fuente de luz fría es dirigido a la laringe.
   3. Conecte el tubo y el respirador para verificar si la cánula se ha insertado en la tráquea. Fije la tráquea con cinta adhesiva si la cánula se ha insertado correctamente.

3. Cirugía

1. Abre el pecho.
   1. Hacer una incisión en la piel paralela a la segunda costilla, de unos 10 mm de longitud, con tijeras oftálmicas. Asegúrese de que la incisión comienza desde el ángulo esternal y termina en la línea axilar anterior izquierda. Identifique el segundo espacio intercostal contando las costillas desde el ángulo esternal.
   2. Separar y cortar los músculos pectorales mayores y pectorales menores con tijeras y pinzas de codo por encima del segundo espacio intercostal para exponer este espacio.
      NOTA: También se recomienda separar, movilizar y mover los músculos pectorales a la derecha y cranealmente.
   3. Penetra con sorna el segundo espacio intercostal con pinzas de codo y abre este espacio. Luego, separa sin rodeos el parénquima y el timo hasta que el tronco pulmonar sea visible.
2. Restringir la arteria pulmonar.
   1. Separe con rodeos el tronco pulmonar y la aorta ascendente con pinzas de codo. Pasar la sutura a través del tejido conectivo entre el tronco pulmonar y la aorta ascendente con una aguja de pestillo.
   2. Coloque la aguja de acolchado (ver paso 1.2) en el tronco pulmonar y, a continuación, ligar el tronco pulmonar junto con la aguja de relleno, utilizando la sutura de seda trenzada 6-0. Retire la aguja de acolchado inmediatamente después de observar el llenado del cono pulmonar y corte los extremos de la sutura.
   3. Observe el llenado del cono pulmonar para evaluar si hay una constricción presente. Evalúe el reflejo del animal de nuevo para asegurar el éxito de la ligadura.
      NOTA: Realice una cirugía falsa siguiendo todos los pasos anteriores, excepto la constricción.
3. Cierre el pecho y la piel con la sutura de nylon 5-0. Desinfectar la piel de nuevo con 75% de alcohol.
4. Inyecte 0,5 ml de salina por vía subcutánea para reemplazar cualquier líquido perdido durante la cirugía. Coloque el ratón en la jaula por separado con la almohadilla de calentamiento para promover la recuperación. Devuelva a los ratones a sus jaulas en una sala de ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h cuando regrese la conciencia. Tratar a los ratones con buprenorfina a través de su agua potable durante los siguientes 3 días.
5. Preste especial atención a la curación de la herida de toracotomía mediante el monitoreo de los ratones 2 veces al día durante la primera semana para detectar cualquier signo de curación insuficiente, movilidad deteriorada, o pérdida de peso.

4. Evaluación ecocardiográfica de la función RV después de la cirugía

NOTA: Los cambios ecocardiográficos se pueden detectar 3 días después de la cirugía.

1. Anestetizar a los ratones con 3% de isoflurano a través de la inhalación y mantener la profundidad de la anestesia con 1,5% de isoflurano. Fije un ratón en la plataforma, pegue sus garras al electrodo y mantenga al animal en una posición supina. Mantener la frecuencia cardíaca del ratón entre 450-550 latidos/min ajustando la concentración de isoflurano entre 1,5% y 2,5%.
2. Retire el pelo en el pecho del ratón con crema depilatoria y aplique gel de ultrasonido en la piel del pecho.
3. Evalúe la constricción pulmonar del tronco con una sonda de 30 MHz.
   1. Mantenga la sonda en 30o en sentido antihorario en relación con la línea parasternal izquierda, mientras orienta la muesca en la dirección caudal. Regular el eje yy el eje xbajo el modo B hasta que la válvula mitral, la aorta y la cámara LV sean claramente visibles.
   2. Gire la sonda 30o-40o sobre su eje yhacia el pecho. Regular el eje yy el eje xhasta que el cono pulmonar sea claramente visible.
   3. Coloque el cursor en la punta de los foliolos de la válvula pulmonar para medir la velocidad de flujo máxima. Utilice el modo Color Doppler pulsando Color, seguido de PWy, a continuación, moviendo el cursor para colocar la línea con guionES PW paralela a la dirección del flujo sanguíneo.
   4. Mida la velocidad máxima de la arteria pulmonar. Guarda los datos y la imagen con Cine Store y Frame Store.
4. Evalúe los parámetros RV con una sonda de 30 MHz.
   1. Ajuste el lado izquierdo de la almohadilla para que sea más bajo que el lado derecho. Mantenga la sonda orientada a 30o hacia el horizonte a lo largo de la línea axilar anterior derecha con la muesca puntiaguda en la dirección caudal. Regular el eje yy el eje xhasta que se muestre claramente el RV.
   2. Pulse M-Mode 2x para mostrar la línea del indicador. Mida la dimensión de la cámara RV, el acortamiento fraccionario y el espesor de la pared de RV. Guarda los datos y la imagen con Cine Store y Frame Store.
5. Detenga la inhalación de isoflurano para permitir que los ratones recuperen la conciencia y luego devuelvan a los animales a sus jaulas en una sala de ciclo de luz/oscuridad de 12 h.

5. Cateterismo cardíaco derecho para evaluar la función RV

NOTA: El cateterismo cardíaco derecho se realizó 8 semanas después de la cirugía para evaluar la función de rv, utilizando un catéter 1.0 F y un sistema de monitoreo.

1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos. Anestetizar al animal mediante inyección intraperitoneal con una mezcla de xilazina (5 mg/kg) y ketamina (100 mg/kg).
2. Después de que el reflejo de retirada del pedal desaparezca, fije el ratón en la plataforma, pegue sus garras en el electrodo y mantenga el ratón en posición supina. Retire el cabello en el área quirúrgica con crema depilatoria.
3. Desinfectar la piel del área quirúrgica con 75% de alcohol. Usando alicates puntiagudos, tire de la lengua ligeramente, eleve la mandíbula con una espátula hecha en casa para exponer la glotis, e inserte suavemente la cánula de tráquea hecha internamente a través de la glotis mientras una fuente de luz fría se dirige en la laringe. Utilice un respirador (Figura1E)para ayudar con la ventilación.
4. Abra la cavidad torácica por medio de una incisión bilateral de 1,5 cm por debajo del proceso de xiphoid a través del diafragma con tijeras oftálmicas y fórceps. Cortar a través del diafragma y las costillas con tijeras oftálmicas para exponer el corazón. Penetrar la pared libre RV con una aguja de 23 G y quitar la aguja; presione suavemente el punto de punción con un hisopo de algodón para detener cualquier sangrado. Perfore el ventrículo con la punta del catéter a través de la herida.
   NOTA: También se recomienda realizar el cateterismo cardíaco derecho a través de la vena yugular derecha⁶. Cuando la punta del catéter está en el ventrículo, el monitor mostrará la curva de presión RV.
5. Registre la presión arterial sistólica RV, la presión diastólica final RV, el RV dP/dt, la frecuencia cardíaca del ratón y la constante de tiempo exponencial RV de relajación (Tau) durante 10 minutos cuando la curva es estable. Con el software, haga clic en Seleccionar y, a continuación, haga clic en Analizar.
6. Regular la punta del catéter hacia el tracto de salida RV. Extraiga el catéter una vez completada la grabación. Coloque el catéter en salina cuando las mediciones hayan terminado.
7. Eutanasia a los ratones mediante inyecciones intraperitoneales de pentobarbital sódico 150 mg/kg, seguida de luxación cervical. Luego, cosecha el corazón, los pulmones y la tibia para análisis biológicos histomorfológicos y moleculares.

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Resultados

En este estudio, los ratones fueron asignados aleatoriamente al grupo pac (n a 9) o al grupo de operaciones falsas (n x 10). La ecocardiografía se realizó a las 1, 4 y 8 semanas después de la cirugía. Ocho semanas después de la cirugía, después de las últimas evaluaciones de ecocardiografía y cateterismo, los ratones fueron eutanasiados, y sus corazones fueron cosechados para una evaluación morfológica e histológica.

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Discusión

Los aumentos patológicos en las presiones de llenado de RV dan como resultado un desplazamiento hacia la izquierda del tabique, que puede alterar la geometría del VL^21. Estos cambios contribuyen a la reducción de la producción cardíaca y la fracción de eyección del VL (LVEF), que puede causar un trastorno hemodinámico del sistema circulatorio^22. Por lo tanto, un modelo eficiente, estable y económico para estudiar el mecanismo de RVF es valioso.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ALC-V8S ventilator	SHANGHAI  ALCOTT  BIOTECH  CO	ALC-V8S	Assist ventilation
Animal Mini Ventilator	Haverd	Type 845	Assist ventilation
Animal ultrasound system VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	Echocardiography
Cold light illuminator	Olympus	ILD-2	Light
Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI  ALCOTT  BIOTECH  CO	ALC-HTP-S1	Heating
Isoflurane	RWD life science	R510-22	Inhalant anaesthesia
Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthetization
Medical braided silk suture (6-0)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.	6-0	Ligation
Medical nylon suture (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	Suture
Millar Catheter (1.0 F)	AD instruments	1.0F	For right heart catheterization
Pentobarbital sodium salt	Merck	25MG	Anesthetization
PowerLab multi-Directional physiological Recording System	AD instruments	4/35	Record the result of right heart catheterization
Precision electronic balance	Denver Instrument	TB-114	Weighing sensor
Self-made latch needle			Separate the aorta and pulmonary trunk
Self-made padding needle			Constriction
Self-made tracheal intubation			Tracheal intubation
Small animal microsurgery equipment	Napox	MA-65	Surgical instruments
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	Echocardiography
Veet hair removal cream	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Remove hair of mice
Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer	Hefei Huatai Medical Equipment Co.	LX-B50L	Auto clean the surgical instruments
Vertical small animal surgery microscope	Yihua Optical Instrument	Y-HX-4A	For right heart catheterization