DREADD制御神経活動の慢性操作に対する非侵襲的戦略

要約

ここでは、マウスの化学遺伝学を用いて神経活動を慢性的に制御する2つの非侵襲的方法について説明する。点眼剤は、クロザピン-N-酸化物(CNO)を毎日提供するために使用されました。また、飲料水中のCNOの長期投与のための2つの方法についても述べた。慢性神経制御のためのこれらの戦略は、動物のストレスを軽減する最小限の介入を必要とします。

要約

化学遺伝学的戦略は、神経活動の遠隔制御のための信頼性の高いツールとして登場しています。これらの中で、デザイナー薬(DREADDs)によって排他的に活性化されるデザイナー受容体は、現代の神経科学で使用される最も人気のある化学遺伝学的アプローチとなっています。ほとんどの研究は、単一の食後性注射を使用してリガンドクロザピン-N-オキシド(CNO)を提供します, これは、標的ニューロン集団の急性活性化/阻害に適しています.しかし、DREADD制御ニューロンの慢性変調のための戦略のほんの一例は、その大半は外科的介入を必要とする送達システムの使用に依存している。ここでは、ライガンドCNOを送り出してマウスの神経集団を慢性的に操作するための2つの非侵襲的な戦略について展開する。CNOは、反復的な(毎日)点眼薬を使用するか、または動物の飲料水を通して慢性的に投与した。これらの非侵襲的なパラダイムは、CNO治療全体を通じて持続するデザイナー受容体の堅牢な活性化をもたらす。ここで説明する方法は、神経活動の慢性DREADD媒介制御の代替手段を提供し、侵襲性の低いCNO送達方法に焦点を当てて、自由に動く動物の行動を評価するように設計された実験に役立つ可能性がある。

概要

神経科学の分野における技術的進歩により、科学者は特定の神経集団の活動を正確に特定し、制御することができました 1.これは、ニューロン回路の基礎と動物の行動への影響をよりよく理解するのに貢献しているだけでなく、確立されたドグマ2、3を改訂する。これらの新しいツールの中で、光遺伝学的および化学遺伝学的戦略は、発見の質だけでなく、実験が考案され、設計される方法にも大きな影響を与えました 4.本原稿では、工学的受容体リガンド戦略を用いてニューロンの活性化を制御するための化学遺伝学的戦略に焦点を当てる。デザイナー薬(DREADDs)によって排他的に活性化されるデザイナー受容体は、Roth 2016⁵によってレビューされたニューロン活動の遠隔制御のための最も人気のある化学遺伝学的ツールの1つを表します。DREADDsは、不活性リガンド、クロザピン-N-オキシド(CNO)6によって特異的に活性化される修飾されたムスカリン性アセチルコリン受容体を利用する。

ほとんどの研究は、急性の方法でエンジニアリングされた受容体の活性化の投与量とタイミングを効果的に制御する経皮内注射(i.p.)注射によって投与されるCNOを使用します。しかし、反復的または慢性的なDREADD活性化が必要な場合、複数のi.p.注射の使用は不可能になる。この問題に対処するために、移植されたミニポンプ7および頭蓋内カニューラス8、9を含む慢性CNO送達のための異なった戦略が報告されている。異なる範囲に、これらすべての戦略は、動物のストレス^{および痛みを}引き起こし、また、テストされる行動応答に直接影響を与えることができる外科的介入を必要とする11。ここでは、慢性CNO送達に対する3つの非侵襲的戦略について述述する。

この目的のために、マウスは、リガンドCNOによって活性化されると、破裂状の発射につながる興奮性M3ムスカリン受容体(hM3Dq)の工学バージョンをコードするアデノ関連ウイルス(AAV)を海馬に立体的に注入した。ニューロン⁶.CNOを含む単一の点眼剤が効果的にDREADD発現^{ニューロン12}の堅牢な活性化を引き出すことができることが以前に示された。ここでは、点眼薬の反復的な送達のための改変方法について説明する。デザイナー受容体の慢性的かつ持続的な制御を達成するために、次に飲料水を介してマウスにCNOを提供する非侵襲的な戦略について説明する。最後に、制限された時間枠の間に飲料水でCNOを提供するための代替パラダイムについて説明します。マウスの運動活性は、飲酒行動および甘いカロリー溶液の消費と同様に、主に光/暗いサイクル13、14の暗い部分に制限される。そこで、スクロースに対するマウスの好みに基づくプロトコルを採用した。AAV感染細胞における即時早期遺伝子c-Fosの誘導を測定することにより、ニューロン活性化12、15の読み出しとして、これらのCNO送達戦略がDREADD制御ニューロンを長期間にわたって強く活性化することがわかった。期間。

プロトコル

全ての動物は、国立精神衛生研究所(NIMH)の動物ケア・使用委員会のガイドラインに従って取り扱われました。痛みと使用される動物の数を最小限に抑えるためにすべての努力がなされました。

1. 海馬におけるアデノ関連ウイルス注射

注:混合背景の野生型雄マウス(B6/129 F1ハイブリッド、生後3ヶ月)は、海馬にM3ムスカリン受容体(hM3Dq)をコードするAAVを定体的に注入した。全体の実験の間、マウスは、通常の12時間の光の下で、単一の収容された:12時間暗い(T24)サイクル、食物および水のアドリビタムへのアクセスと。

1. 立体手術を行う前に、ステレオタキシックフレームとすべての必要な器具をきれいにし、殺菌します。
   注:外科ドレープは、無菌フィールドを維持し、マウスの熱損失を減らすために使用することができます。
2. イソファランを用いてマウスを深く麻酔する。これを行うには、まず酸素流量計を約1.5L/分に調整し、次にイソファリン気化器を誘導で約3~5%、メンテナンス用に約1~3%に調整します。
   1. 動物が完全に意識不明であることを確認するには、マウスの足をつまみます。ピンチに対するフリンチング応答が存在しない場合、動物は適切に麻酔される。
3. マウスの体温の安定性を維持するために、加熱パッドにマウスを置きます。
4. 頭の上を剃り、マウスの頭部をステレオタキスティックフレームに固定します。次いで、眼保護潤滑剤を目に塗布し、ポビドンヨウ素と70%エタノールで洗って表面をきれいにし、無菌メスを使って頭蓋骨を露出させる。
5. フレームをブレグマポイントに調整し、2.9 mm の中間横座標と前部座標 -2.7 mm でドリルして海馬をターゲットにします。
   注:他の脳標的を注入する必要がある場合は、Paxinosとフランクリンマウス^{アトラス16}を使用して注射のための所望の座標を決定します。
6. 脳が露出したら、マイクロインジェクターを用いて海馬に-3.0mmの背部腹部深さでAAVの90nLを一方的に注入し、マイクロキャピラリーピペットを引っ張る(図1A)。
   注:この実験で使用したAAVのツタについては、材料の表を参照してください。他の脳領域については、必要に応じて注射の AAV ボリュームを調整します。
7. 外科的処置の終わりに、ナイロン縫合糸で切開を閉じ、創傷部位に局所抗生物質を適用する。
8. 手術直後に全身的に鎮痛薬(ブプレノルフィン、0.1mg/kg)を投与し、4~6時間後に投与する。
9. 注射後4週間を開始し、以下のセクションに記載の任意のパラダイムにマウスを対象化し、デザイナー興奮性受容体を発現するニューロンを慢性的に制御する。

2. 点眼薬を用いて反復的なCNO送達

1. 点眼剤の投与前に3〜4日間、各マウスを毎日3分間スクラッフィンで取り扱いに順応させる。
2. 無菌0.9%生理液の1mLにクロザピン-N-酸化物(CNO,5mg)を溶解する(ストック溶液:5mg CNO/mL)。溶液を4°Cで冷蔵しておきます。
3. 実験を開始する前に各マウスの重量を量り、配信する CNO の量を決定します。1-3 μL ドロップ(眼あたり)を使用して、1.0 mg CNO/kg の体重を達成します。
   注:例として、20gのマウスは、両側(各2μL)点眼薬を受け取る必要があります。
4. マウスの不活性(光)相の間に点眼剤を送送り、2時間前にライトが消灯する前に(ツァイトゲーバー時間(ZT)10)を送る)マウスのアクティブな(暗い)段階でCNOを送達する必要がある場合は、適切な動物の取り扱いのために薄暗い赤色光の存在を確認してください。
   注:実験動物の概日(および明るい/暗い)サイクルを混乱させないように注意する必要があります。
   1. P10マイクロピペットを使用して、CNO溶液の必要量(1-3 μL)をロードし、1.0 mg CNO/kgを達成します。
      注:各点眼に新しい無菌ピペットチップを使用してください。この一連の実験では、CNOの両側点眼剤が行われた。しかし、より低いCNO濃度が必要な場合は、一方的な点眼薬も適用することができます。
   2. スクラフトを介してマウスを固定します。
   3. ピペット先端に安定した液滴が形成されるまで、溶液をゆっくりと排出します。
   4. 溶液が提供されるまで、マウスの目の角膜に注意深く液滴を持参してください。ピペットの先端は、マウスの目に接触してはなりません。
   5. マウスを放し、ホームケージに戻します。
5. この手順を毎日 5 日間繰り返します。
   注: この期間は、実験要件に応わせて調整できます。
6. 対照実験では、シャム処理を施したAAV/DREADD注入マウス(生理食塩水のみを含む点眼剤)を使用し、記載されたCNO点眼球プロトコルに曝露した空のベクター(例えば、AAV/mCherry)を注入したマウスを用いる。

3. 飲料水による慢性CNO治療

1. 50 mL(プラスチック)円錐管とゴム製ストッパースパウトを使用して小さなボトルを作ります。CNOの安定性に光媒介効果を避けるためにアルミニウム箔でカバーします。
2. CNO治療を開始する3日前に、通常の水ボトルを10mLの通常の水を含む小さなボトルに置き換え、マウスがそれらに順応できるようにします。テープを使用してボトルをケージに固定します。
3. 各マウスの毎日の水消費量を測定します。
4. 実験を開始する前に、各マウスの重量を量ります。
5. クロザピン-N-酸化物(CNO,5mg)を0.9%無菌生理生理液の1mLで溶解する。ストック溶液を4°Cで冷蔵します。
6. 体重と消費水の平均量を使用して、1.0 mg CNO/kg (体重) を達成するために CNO 溶液の濃度を定義します。
   注:成人雄マウス(体重約20g)は1日当たり約5mLの水を消費する(図2A)。したがって、1 mg CNO/kgのCNO濃度を達成するために、CNOストック溶液の6.4 μLを水の最終体積に加える必要があります(最終濃度:4 μg CNO/mL)。したがって、1日あたり5mLの水を飲む20gの動物に対するCNOの用量は、1mg CNO/kgをもたらす。
7. 濃度の範囲をテストすることにより、最小限のCNO濃度で最大の有効性を表示する最適なCNO用量を決定します。用量応答分析を実行して、飲料水法に最適なCNO用量を決定します。
   注:次のCNO用量は、この実験のためにテストされました: 1.0 mg/ mL, 0.5 mg/ mL, 0.25 mg/ mL, 0.1 mg/ mL, 生理生殖, .1.0 mg CNO/kg は、i.p. および点眼プロトコルに基づいて最初にテストされました。
8. 1日目に、通常の水の8 mLでボトルを充填し、CNOの必要量を追加します。
   注:この量の水は、成人男性マウスのためのアドリビタム水アクセスの24時間のために十分です。他のげっ歯類種を使用する場合は、まず毎日消費される水の量を測定して、必要な量を決定します。
9. プロトコル全体の動物の健康を監視し、水+CNO消費によって引き起こされる副作用がないことを確認します。
10. 24時間後、ボトルを淡水+CNO溶液に交換します。前日に消費されたボリュームを記録します。
11. 廃棄物容器に入れられなかった水+CNO溶液を廃棄する。ペットボトルを捨て、動物施設のガイドラインに従って消毒した後、毎日ゴムストッパーを交換してください。
    注:有機溶剤と水性廃棄物を混ぜないでください。保管およびピックアップの手順については、化学処理サービスにお問い合わせください。
12. ボトルを毎日5日間同じ時間に交換してください。
    注: この期間は、実験要件に応わせて調整できます。
13. 手順 2.6 で説明するように、制御グループを含めます。

4. スクロースに対するマウスの好みを用いての制限されたCNO治療

1. CNO処理を開始する3日前に、10mLの水+1%ショ糖を含む小さなボトルをケージに置き、好ましくは元の水ボトルから離します。
   注: 手順 3.1 で説明されているのと同じ小さなボトルを使用します。
2. 活動期の最後の部分(ZT 18-24)の間に動物を水+1%ショ糖にさらす。この露出の後、ケージから水+ショ糖でボトルを取り出します。
   注: CNO 配信の異なる時間枠を使用できます。さらに、マウスは、CNO送達を容易にするために夕方の時間に光の発症が起こる反転光/暗いサイクルの下に置くことができる。
3. 各マウスの毎日の水+1%ショ糖消費量を測定します。
4. 実験を開始する前に、各マウスの重量を量ります。
5. 体重と水の平均量 + 1% ショクロースを使用して、1.0 mg CNO/kg (体重) を達成するために CNO 溶液の用量を決定します。
   注:ステップ3.6で説明されているように、最小限のCNO濃度で最大有効性を表示する最適なCNO用量をテストする必要があります。
6. 1日目に、ボトルに5 mLの水+1%ショ糖+CNO(1mg CNO/Kg)を充填し、決定された時間枠の間にケージ(常に同じ場所)に置きます。
7. 制限された時間枠の終わりに、ボトルを取り外し、消費される水+ショ糖+CNOの量を測定します。
   注: マテリアルとソリューションは、手順 3.11 で前述したように、サニタイズまたは廃棄されます。
8. この手順を毎日 5 日間繰り返します。
   注: この期間は、実験要件に応わせて調整できます。
9. 手順 2.6 で説明するように、制御グループを含めます。

5. データ分析

1. 最後の反復(5日目)CNO点眼を受けた後、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を2または6時間で心内に透過するマウスを透過する。CNOが飲料水を通して送達されるとき、マウスの活動期の終わりにCNO +水を水に置き換え、CNO後2または6時間のアクセスの後にマウスを通して注入する。
   注:光暴露が対象領域のc-Fos誘導に影響を与える可能性がある場合は、実験の最終日と灌流の前に、マウスを一定の暗闇の中に保ちます。
2. 慎重に脳を解剖し、9-12hのための4%のPFA溶液に浸す。
3. PFA固定後、30%のショ糖溶液を使用して脳組織を凍結保護し(脳が沈むまで待つ)、次いでクライオスタットを使用して脳を切り離す。
4. 冠状脳切片(35μm)を室温で1x PBS、10%ウシ血清アルブミン、0.3%トリトンX-100を含む溶液に移します。
5. 一晩4°Cの抗C-Fos(1:2500)抗体溶液で脳切片を一定の撹拌でインキュベートします。
6. 1x PBSと0.3%のトリトンX-100を含む溶液でそれぞれ5分間3回洗った後、Alexa結合二次抗体(1:500)溶液でサンプルを、光から離れ、一定の撹拌で室温で1時間インキュベートします。
7. 共焦点顕微鏡を用いてデジタル画像を取得する。写真編集および分析ソフトウェア(例えば、Adobe Photoshop)を使用して、キャプチャした画像を組み立てて処理します。
8. データ解析では、ImageJソフトウェアを用いてAAV感染領域(mCherry(+)細胞)の輪郭と測定を行い、この領域内のc-Fos(+)細胞の数を定量化して、領域あたりの活性化細胞数を得る。動物ごとに3つの別々のセクションから得られた結果を組み合わせます。

結果

点眼薬を用いた反復的なCNO送達は、ほとんどの感染ニューロンにおけるc-Fos発現の強い誘導を引き起こし(図1C)、CNO送達の有効性が反復的暴露中に持続することを示した。さらに、CNO処理後2時間に採取した試料においてc-Fosの有意な誘導が観察され、CNO曝露後6時間で得られた試料(図1D-E)と比較して、CNOによって誘導される変化が時間依存であることを実証し?...

ディスカッション

DREADDsは、ニューロン活動を遠隔操作する一般的で効果的なアプローチとして登場^{しました 17.}CNO 配信の代替戦略の設計は、特定の実験設定で使用できるオプションのスペクトルを大幅に増加します。さらに、CNOの配信のための非侵襲的な戦略は、動物の健康に直接影響を与えることができる有害な副作用を減らすことによって、結果の潜在的な誤解を最小限に抑えます。こ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Sigma life science	#A2153-100G	Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis)
C57BL/6J mice	The Jackson laboratory	#000664	male mice, 3 months old
Capillaries	Drummond Scientific Company	#3-000-203-G/X	Outer diameter: 1.14 in.
Clozapine-N-oxide	Sigma	#C0832	5mg
Forane	Baxter	#NDC 10019-360-60	Isoflurane, USP
Microinjector III	Drummond Scientific Company	#3-000-207	Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector
Mounting media	Invitrogen	#P36930	Prolong Gold antifade reagent
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	#15710	16% aqueous solution (methanol free), 10 ml
Primary c-Fos Antibody	Cell signaling technology	#2250S	c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl)
rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry	UNC Vector Core		Titer: ~3x10e12 vg/mL
rAAV5/hSyn-mCherry	UNC Vector Core		Titer: ~3x10e12 vg/mL
Secondary Antibody	Invitrogen	#A21206	Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml
Triton X-100	americanbio.com	#AB02025-00100