Estrategias no invasivas para la manipulación crónica de la actividad neuronal controlada por DREADD

Resumen

Aquí describimos dos métodos no invasivos para controlar crónicamente la actividad neuronal utilizando quimiogenética en ratones. Se utilizaron gotas para los ojos para administrar clozapina-N-óxido (CNO) diariamente. También describimos dos métodos para la administración prolongada de CNO en agua potable. Estas estrategias para el control neuronal crónico requieren una intervención mínima reduciendo el estrés de los animales.

Resumen

Las estrategias quimiogenéticas han surgido como herramientas fiables para el control remoto de la actividad neuronal. Entre ellos, los receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) se han convertido en el enfoque quimiogenético más popular utilizado en la neurociencia moderna. La mayoría de los estudios suministran el ligando clozapina-N-óxido (CNO) utilizando una única inyección intraperitoneal, que es adecuada para la activación/inhibición aguda de la población neuronal objetivo. Sin embargo, sólo hay algunos ejemplos de estrategias para la modulación crónica de las neuronas controladas por DREADD, la mayoría de las cuales se basan en el uso de sistemas de administración que requieren intervención quirúrgica. Aquí, ampliamos dos estrategias no invasivas para entregar el ligando CNO para manipular crónicamente la población neuronal en ratones. CNO se administró mediante el uso de gotas para los ojos repetitivas (diarias) o crónicamente a través del agua potable del animal. Estos paradigmas no invasivos dan como resultado una activación robusta de los receptores de diseño que persistieron a lo largo de los tratamientos de CNO. Los métodos descritos aquí ofrecen alternativas para el control crónico mediado por DREADD de la actividad neuronal y pueden ser útiles para experimentos diseñados para evaluar el comportamiento en animales en movimiento libre, centrándose en métodos de entrega de CNO menos invasivos.

Introducción

Los avances técnicos en el campo de la neurociencia han permitido a los científicos identificar y controlar con precisión la actividad de determinadas poblaciones neuronales¹. Esto ha contribuido a entender mejor la base de los circuitos neuronales ysu impacto en el comportamiento animal, así como, la revisión de dogmas establecidos 2,^3. Entre estas nuevas herramientas, las estrategias optogenéticas y quimiogenéticas han tenido un profundo impacto no sólo en la calidad de los descubrimientos, sino también en la forma en que se conciben y diseñan^losexperimentos 4. En el presente manuscrito, nos centramos en estrategias quimiogenéticas para controlar la activación de las neuronas a través de estrategias de receptor-ligand diseñadas. Los receptores de diseño activados exclusivamente por los medicamentos de diseño (DREADD) representan una de las herramientas quimiogenéticas más populares para el control remoto de la actividad neuronal, según lo revisado por Roth 2016^5. Los DREADD utilizan receptores de acetilcolina muscarínicos modificados que son activados específicamente por un ligando inerte, clozapina-N-óxido (CNO)⁶.

La mayoría de los estudios utilizan CNO administrado por inyecciones intraperitoneales (i.p.), que controla eficazmente la dosis y el momento de la activación de receptores diseñados de una manera aguda. Sin embargo, cuando se requiere activación repetitiva o crónica DREADD, el uso de múltiples inyecciones de i.p. se vuelve inviable. Para abordar este problema, se han reportado diferentes estrategias para la entrega crónica de CNO, incluyendo minibombas implantadas⁷ y cánulas intracraneales^8,9. En diferentes grados, todas estas estrategias causan el estrés y el dolor de los animales^10,y requieren una intervención quirúrgica que también podría tener un impacto directo en las respuestas conductuales que se probarán¹¹. Aquí, describimos tres estrategias no invasivas para el parto crónico de CNO.

Para ello, los ratones fueron inyectados estereotaxicamente en el hipocampo con un virus asociado a adeno (AAV) que codifica una versión de ingeniería del receptor muscarínico M3 excitatorio (hM3Dq) que cuando se activa por el ligando CNO conduce a la cocción en forma de ráfaga de neuronas⁶. Anteriormente se demostró que una sola gota ocular que contiene CNO puede efectivamente obtener una activación robusta de las neuronas que expresan DREADD¹². Aquí describimos un método modificado para la entrega repetitiva de gotas para los ojos. Para lograr un control crónico y sostenido de los receptores de diseño, a continuación describimos una estrategia no invasiva para entregar CNO a ratones a través del agua potable. Por último, describimos un paradigma alternativo para la entrega de CNO en agua potable durante una ventana de tiempo restringida. La actividad locomotora de los ratones, así como el comportamiento de beber y el consumo de soluciones calóricas dulces, se limitan principalmente a la porción oscura del ciclo de luz/oscuridad^13,14. Por lo tanto, adoptamos un protocolo basado en la preferencia del ratón por la sacarosa. Mediante la medición de la inducción del gen inmediato-temprano c-Fos en células infectadas por AAV, como una lectura para la activación neuronal^12,15, encontramos que estas estrategias de administración de CNO activan de forma robusta las neuronas controladas por DREADD en Duraciones.

Protocolo

Todos los animales fueron manejados de acuerdo con las directrices de los Comités de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el dolor y el número de animales utilizados.

1. Inyecciones de virus asociados a los adenos en el hipocampo

NOTA: Los ratones machos de tipo salvaje de fondo mixto (híbrido B6/129 F1, de 3 meses de edad) fueron inyectados estereotaxically con un AAV que codifica el receptor muscarínico M3 (hM3Dq) en el hipocampo. Durante todo el experimento, los ratones fueron de una sola casa, bajo una luz regular de 12 h: 12 h ciclo oscuro (T24), con acceso a alimentos y agua ad libitum.

1. Antes de realizar cirugías estereotaxicas, limpie y esterilice el marco estereotaxico y todos los instrumentos necesarios.
   NOTA: Las cortinas quirúrgicas se pueden utilizar para mantener un campo estéril y reducir la pérdida de calor del ratón.
2. Anestetizar profundamente el ratón usando isoflurano. Para ello, primero ajuste el medidor de flujo de oxígeno a aproximadamente 1,5 L/ min, y luego ajuste el vaporizador de isoflurano a aproximadamente 3-5% para la inducción y aproximadamente 1-3% para el mantenimiento.
   1. Para asegurarse de que el animal está completamente inconsciente, pellizque la pata del ratón; el animal se anestesia adecuadamente cuando la respuesta estremezante al pellizcar está ausente.
3. Coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento para mantener la estabilidad de la temperatura corporal del ratón.
4. Afeitar la parte superior de la cabeza y fijar la cabeza del ratón al marco estereotaxico. Luego, aplicar lubricante protector ocular en los ojos, limpiar la superficie frotando con povidona-yodo y 70% de etanol, y exponer el cráneo usando un bisturí estéril.
5. Calibrar el marco al punto bregma, luego perforar en una coordenada medial-lateral de 2,9 mm y una coordenada anterior-posterior -2,7 mm para apuntar al hipocampo.
   NOTA: Si es necesario inyectar otro objetivo cerebral, determine las coordenadas deseadas para la inyección utilizando el atlas de ratón Paxinos y Franklin¹⁶.
6. Una vez que el cerebro está expuesto, inyectar unilateralmente 90 nL del AAV a la profundidad dorsal-ventral de -3,0 mm en el hipocampo utilizando un microinyector y pipetas microcapilares extraídas (Figura1A).
   NOTA: Consulte la Tabla de Materiales para el valorador de AAV utilizado en este experimento. Para otras áreas del cerebro, ajuste el volumen AAV de la inyección según sea necesario.
7. Al final del procedimiento quirúrgico, cierre la incisión con suturas de nylon y aplique antibióticos tópicos en el sitio de la herida.
8. Administrar analgésicos (buprenorfina, 0,1 mg/kg) sistémicamente inmediatamente después de la cirugía, y 4-6 horas después.
9. A partir de 4 semanas después de la inyección, someten a los ratones a cualquiera de los paradigmas descritos en la siguiente sección para controlar crónicamente las neuronas que expresan el receptor excitatorio de diseño.

2. Entrega repetitiva de CNO con gotas para los ojos

1. Aclimatar a los animales a manipular desalizando cada ratón 3 minutos al día durante 3-4 días antes de la administración de gotas para los ojos.
2. Disolver clozapina-N-óxido (CNO, 5 mg) en 1 ml de solución salina estéril al 0,9% (solución en stock: 5 mg de CNO/ml). Mantener la solución refrigerada a 4oC.
3. Pesar cada ratón antes de iniciar el experimento para determinar la cantidad de CNO que se entregará. Utilice 1-3 l de gota (por ojo) para alcanzar 1,0 mg de CNO/kg de peso corporal.
   NOTA: Por ejemplo, un ratón de 20 g debe recibir gotas oculares bilaterales (2 l cada una).
4. Entregar las gotas oculares durante la fase inactiva (ligera) de los ratones, 2 h antes de que las luces se apaguen (hora dezeitgeber (ZT) 10). En los casos en que el CNO deba administrarse durante la fase activa (oscura) de los ratones, asegúrese de la presencia de luz roja tenue para un manejo adecuado de los animales.
   NOTA: Se deben tomar precauciones para evitar interrumpir el ciclo circadiano (y claro/oscuro) de los animales experimentales.
   1. Con una micropipeta P10, cargue la cantidad requerida (1-3 l) de solución de CNO para alcanzar 1,0 mg de CNO/kg.
      NOTA: Utilice una punta de pipeta nueva y estéril para cada gota para los ojos. En este conjunto de experimentos, se realizaron gotas oculares bilaterales de CNO; sin embargo, si se requiere una concentración más baja de CNO, también se podrían aplicar gotas oculares unilaterales.
   2. Inmovilizar el ratón a través de scruff.
   3. Expulse lentamente la solución hasta que se forme una gota estable en la punta de la pipeta.
   4. Lleve cuidadosamente la gota cerca de la córnea del ojo del ratón hasta que se entregue la solución. La punta de la pipeta nunca debe ponerse en contacto con el ojo del ratón.
   5. Suelte el ratón, colocándolo de nuevo en su jaula de casa.
5. Repita este procedimiento todos los días durante 5 días.
   NOTA: Esta duración se puede ajustar según los requisitos experimentales.
6. Para experimentos de control, utilice ratones inyectados con AAV/DREADD sometidos a tratamiento falso (gotas para los ojos que contengan solo solución salina) y ratones inyectados con un vector vacío (por ejemplo, AAV/mCherry) expuestos al protocolo cNO-drops descrito.

3. Tratamiento crónico de CNO entregado a través del agua potable

1. Hacer botellas pequeñas usando tubos cónicos de 50 ml (plástico) y boquillas de tapón de goma; cubierta con papel de aluminio para evitar efectos mediados por la luz sobre la estabilidad de La CNO.
2. Tres días antes de comenzar con el tratamiento de CNO, sustituya las botellas de agua regulares por botellas pequeñas, que contengan 10 ml de agua regular, para permitir que los ratones se aclimaten a ellas. Fije las botellas a las jaulas con cinta adhesiva.
3. Mida el consumo diario de agua para cada ratón.
4. Pesar cada ratón antes de iniciar el experimento.
5. Disolver clozapina-N-óxido (CNO, 5 mg) en 1 ml de solución salina estéril al 0,9%. Refrigerar la solución de stock a 4oC.
6. Utilice el peso corporal y la cantidad media de agua consumida para definir la concentración de solución CNO para alcanzar 1,0 mg de CNO/kg (peso corporal).
   NOTA: Los ratones machoadultos adultos (20 g de peso corporal) consumen 5 ml de agua al día (Figura2A). Por lo tanto, para lograr una concentración de CNO de 1 mg de CNO/kg, se debe añadir 6,4 l de solución de cno a un volumen final de 8 ml de agua (concentración final: 4 g de CNO/ml). Por lo tanto, la dosis de CNO para un animal de 20 g que bebe 5 ml de agua al día da como resultado 1 mg de CNO/kg.
7. Determinar la dosis óptima de CNO que muestra la máxima eficacia con una concentración mínima de CNO mediante el ensayo de un rango de concentraciones. Realice un análisis de respuesta a la dosis para determinar la dosis óptima de CNO para el método de agua potable.
   NOTA: Se probaron las siguientes dosis de CNO para este experimento: 1,0 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,1 mg/ml y salina. Se probó por primera vez 1,0 mg de CNO/kg, basándose en protocolos i.p. y de gotas para los ojos.
8. En el día 1, llenar la botella con 8 ml de agua regular y añadir la cantidad requerida de CNO.
   NOTA: Esta cantidad de agua es suficiente para 24 horas de acceso al agua ad libitum para un ratón macho adulto. En caso de que se utilicen otras especies de roedores, primero mida la cantidad de agua consumida diariamente para determinar el volumen necesario.
9. Controlar la salud de los animales a lo largo del protocolo para asegurarse de que no hay efectos secundarios adversos causados por el consumo de agua + CNO.
10. Después de 24 h, sustituya las botellas por agua dulce + solución de CNO. Registre el volumen consumido durante el día anterior.
11. Deseche el agua + la solución CNO que no se consumió en los contenedores de residuos. Deseche las botellas de plástico y sustituya los tapones de goma todos los días, después de desinfectarlos de acuerdo con las directrices de las instalaciones para animales.
    NOTA: No mezcle residuos acuosos con disolventes orgánicos. Póngase en contacto con el Servicio de Eliminación De Productos Químicos para obtener instrucciones sobre el almacenamiento y la recogida.
12. Sustituya las botellas a la misma hora todos los días durante 5 días.
    NOTA: Esta duración se puede ajustar según los requisitos experimentales.
13. Incluya grupos de control, como se describe en el paso 2.6.

4. Tratamiento restringido de CNO con preferencia de ratones por sacarosa

1. 3 días antes de comenzar con el tratamiento con CNO, coloque una botella pequeña que contenga 10 ml de agua + 1% de sacarosa en la jaula, preferiblemente lejos de la botella de agua original.
   NOTA: Utilice las mismas botellas pequeñas descritas en el paso 3.1.
2. Exponer a los animales al agua + 1% sacarosa durante la última porción de su fase activa (ZT 18 – 24). Después de esta exposición, retire la botella con agua + sacarosa de la jaula.
   NOTA: Se podrían utilizar diferentes ventanas de tiempo de entrega de CNO. Además, los ratones podrían colocarse bajo un ciclo invertido de luz/oscuridad, donde el inicio de la luz se produce en las horas de la noche para facilitar la entrega de CNO.
3. Mida el consumo diario de agua + 1% de sacarosa para cada ratón.
4. Pesar cada ratón antes de iniciar el experimento.
5. Utilice el peso corporal y la cantidad media de agua + 1% de sacarosa consumida para determinar la dosis de solución de CNO para alcanzar 1,0 mg de CNO/kg (peso corporal).
   NOTA: Se debe probar la dosis óptima de CNO que muestre la máxima eficacia con una concentración mínima de CNO, como se explica en el paso 3.6.
6. En el día 1, llenar botellas con 5 ml de agua + 1% sacarosa + CNO (1 mg de CNO / Kg) y colocarlas en la jaula (siempre en el mismo lugar) durante la ventana de tiempo determinada.
7. Al final de la ventana de tiempo restringido, retire las botellas y mida la cantidad de agua + sacarosa + CNO consumida.
   NOTA: Los materiales y soluciones se desinfectan o descartan como se describió anteriormente en el paso 3.11.
8. Repita este procedimiento todos los días durante 5 días.
   NOTA: Esta duración se puede ajustar según los requisitos experimentales.
9. Incluya un grupo de control, como se describe en el paso 2.6.

5. Análisis de datos

1. Ratones perfundidos por vía intracardial con 4% de paraformaldehído (PFA) 2 o 6 h después de recibir la última gota ocular CNO repetitiva (5o día). Cuando CNO se entregue a través de agua potable, sustituya CNO + agua por agua al final de la fase activa del ratón y, a continuación, percoe el ratón después de 2 o 6 h de acceso post-CNO.
   NOTA: Si la exposición a la luz podría afectar a la inducción de c-Fos en el área de interés, mantenga a los ratones en constante oscuridad durante el último día de los experimentos y antes de la perfusión.
2. Disecciona cuidadosamente el cerebro y sumérgete en una solución de PFA al 4% durante 9-12h.
3. Después de la fijación de la PFA, crioproteger el tejido cerebral usando una solución de sacarosa 30% (esperar hasta que el cerebro se hunde), luego seccionar el cerebro usando un criostato.
4. Transfiera las secciones del cerebro coronal (35 m) en una solución que contenga 1x PBS, albúmina sérica 10% bovina y 0,3% De Tritón X-100 durante 1 h a temperatura ambiente.
5. Incubar las secciones cerebrales con una solución de anticuerpos anti-c-Fos (1:2500) a 4 oC durante la noche con agitación constante.
6. Después de 3 lavados de 5 min cada uno con una solución que contiene 1x PBS y 0.3% Triton X-100, incubar las muestras con un anticuerpo secundario conjugado Alexa (1:500) solución para 1 h a temperatura ambiente lejos de la luz y con agitación constante.
7. Obtenga imágenes digitales utilizando un microscopio confocal. Ensamble y procese imágenes capturadas con un software de edición y análisis de fotos (por ejemplo, Adobe Photoshop).
8. Para el análisis de datos, esboce y mida el área infectada por AAV (células mCherry(+)) utilizando el software ImageJ, y cuantifique el número de células c-Fos(+) dentro de esta región para obtener el número de celdas activadas por área. Combinar los resultados obtenidos a partir de 3 secciones separadas por animal.

Resultados

Observamos que la administración repetitiva de CNO utilizando gotas para los ojos provocó una inducción robusta de la expresión c-Fos en la mayoría de las neuronas infectadas (Figura1C),lo que muestra que la eficacia de la administración de CNO se mantiene durante la exposición repetitiva. Además, se observó una inducción significativa de c-Fos en muestras recogidas 2 h después del tratamiento con CNO, en comparación con las muestras obtenidas 6 h después de la exposición a CNO...

Discusión

Los DREADD han surgido como un enfoque popular y eficaz para manipular remotamente la actividad neuronal^17. El diseño de estrategias alternativas para la entrega de CNO aumentará ampliamente el espectro de opciones disponibles para configuraciones experimentales específicas. Además, las estrategias no invasivas para la entrega de CNO minimizan cualquier posible interpretación errónea de los resultados mediante la reducción de los efectos secundarios adversos que pueden afectar directamente ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Sigma life science	#A2153-100G	Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis)
C57BL/6J mice	The Jackson laboratory	#000664	male mice, 3 months old
Capillaries	Drummond Scientific Company	#3-000-203-G/X	Outer diameter: 1.14 inch
Clozapine-N-oxide	Sigma	#C0832	5 mg
Forane	Baxter	#NDC 10019-360-60	Isoflurane, USP
Microinjector III	Drummond Scientific Company	#3-000-207	Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector
Mounting media	Invitrogen	#P36930	Prolong Gold antifade reagent
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	#15710	16% aqueous solution (methanol free), 10 mL
Primary c-Fos Antibody	Cell signaling technology	#2250S	c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL)
rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry	UNC Vector Core		Titer: ~3 x 1012 vg/mL
rAAV5/hSyn-mCherry	UNC Vector Core		Titer: ~3x10e12 vg/mL
Secondary Antibody	Invitrogen	#A21206	Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml
Triton X-100	americanbio.com	#AB02025-00100