공포 대조 신경 활동의 만성 조작을 위한 비침범성 전략

요약

여기에서 우리는 마우스에 있는 화학유전학을 사용하여 만성적으로 신경 활동을 통제하는 2개의 비침범성 방법을 기술합니다. 점안액은 클로자핀-N-산화물(CNO)을 매일 전달하는 데 사용되었습니다. 우리는 또한 식수에서 CNO의 장기간 투여를위한 두 가지 방법을 설명합니다. 만성 신경 조절을 위한 이러한 전략은 동물의 스트레스를 줄이는 최소한의 개입이 필요합니다.

초록

화학 유전학 전략은 신경 활동의 원격 제어를위한 신뢰할 수있는 도구로 등장했다. 이 중, 디자이너 약물에 의해 독점적으로 활성화 디자이너 수용체 (DREADDs) 현대 신경 과학에 사용되는 가장 인기있는 화학 유전 적 접근 방식이되고있다. 대부분의 연구는 단일 복강 내 주사를 사용하여 리간드 클로자핀-N-옥사이드(CNO)를 전달하며, 이는 표적 뉴런 집단의 급성 활성화/억제에 적합합니다. 그러나, DREADD 통제된 신경의 만성 변조를 위한 전략의 단지 몇몇 보기가 있습니다, 대다수는 외과 적 개입을 요구하는 납품 시스템의 사용에 의존합니다. 여기에서, 우리는 마우스에 있는 신경 인구를 만성조작하기 위하여 리간드 CNO를 전달하기 위한 2개의 비침범성 전략에 확장합니다. CNO는 반복적인 (매일) 점안액을 사용하거나 동물의 식수를 통해 만성적으로 투여되었습니다. 이러한 비침습적 패러다임은 CNO 치료 전반에 걸쳐 지속되는 디자이너 수용체의 강력한 활성화를 초래한다. 여기서 설명된 방법은 신경 활동의 만성 DREADD 매개 제어에 대한 대안을 제공하며 덜 침습적인 CNO 전달 방법에 초점을 맞추어 자유롭게 움직이는 동물의 행동을 평가하도록 설계된 실험에 유용할 수 있습니다.

서문

신경 과학 분야의 기술적 진보로 인해 과학자들은 특정 신경 인구의 활동을 정확하게식별하고 제어 할 수 있었습니다 1. 이것은 신경 회로의 기초와 동물 행동에 미치는 영향을 더 잘 이해하는 데 기여했으며, 확립된 교리 2,^3을개정했습니다. 이러한 새로운 도구 중, 광유전학 및 화학 유전학 전략은 발견의 품질뿐만 아니라 실험이 생각되고 설계되는 방법에뿐만 아니라 깊은 영향을 미쳤다⁴. 본 원고에서, 우리는 엔지니어링 수용체 -ligand 전략을 통해 뉴런의 활성화를 제어하기위한 화학 유전 적 전략에 초점을 맞추고 있습니다. 디자이너 약물에 의해 독점적으로 활성화 디자이너 수용체 (DREADDs) 신경 활동의 원격 제어를위한 가장 인기있는 화학 유전 도구 중 하나를 나타냅니다, Roth에 의해 검토 2016⁵. 공포는 불활성 리간드, 클로자핀-N-산화물 (CNO) 6에 의해 특별히 활성화되는 변형 된무스카린 아세틸 콜린 수용체를 이용한다.

대부분의 연구는 효과적으로 급성 방식으로 엔지니어링 된 수용체 활성화의 복용량과 타이밍을 제어 복강 내 (i.p.) 주사에 의해 투여 CNO를 사용합니다. 그러나, 반복적 또는 만성 DREADD 활성화가 필요한 경우, 다중 i.p. 주사의 사용은 불가능하게된다. 이 문제를 해결하기 위해, 만성 CNO 전달을위한 다른 전략이보고되었다, 이식 미니 펌프를 포함⁷ 두개내 캐뉼러 8,^9. 상이한 범위에서, 이들 모든 전략은 동물에게스트레스와 통증을 유발하고, 11을 시험하기 위해 행동 반응에직접적인 영향을 미칠 수 있는 외과적 개입을 요구한다. 여기에서는, 우리는 만성 CNO 납품을 위한 3개의 비침범성 전략을 기술합니다.

이를 위해, 마우스는 리간드 CNO에 의해 활성화될 때 폭발적인 발사로 이어지는 흥분성 M3 무스카린 수용체(hM3Dq)의 엔지니어링 버전을 코딩하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사용하여 해마에 입체적으로 주입하였다. 뉴런⁶. 이전에는 CNO를 포함하는 단일 안약이 DREADD 발현 뉴런(12)의 강력한활성화를 효과적으로 유도할 수 있음을 보여주었다. 여기서 우리는 점안액의 반복적인 전달을 위한 수정된 방법을 기술한다. 디자이너 수용체의 만성적이고 지속적인 제어를 달성하기 위해, 우리는 다음 식수를 통해 마우스에 CNO를 제공하기 위해 비 침습적 전략을 설명합니다. 마지막으로 제한된 시간 동안 식수에 CNO를 제공하기 위한 대체 패러다임을 설명합니다. 마우스 운동 활동뿐만 아니라 음주 행동 및 달콤한 칼로리 용액의 소비는 주로 빛 / 어두운 주기^(13,14)의어두운 부분으로 제한된다. 따라서, 우리는 자당에 대한 마우스의 선호도에 따라 프로토콜을 채택했다. AAV 감염 된 세포에서 즉각적인 초기 유전자 c-Fos의 유도를 측정 하 여, 신경 활성화에 대 한 판독으로^12,15,우리는 이러한 CNO 전달 전략 강력 하 게 확장 이상 DREADD 제어 뉴런을 활성화 발견 기간.

프로토콜

모든 동물은 국립 정신 건강 연구소 (NIMH)의 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 처리되었습니다. 모든 노력은 통증과 사용되는 동물의 수를 최소화하기 위해 만들어졌다.

1. 해마에서 아데노 관련 바이러스 주사

참고: 혼합 배경(B6/129 F1 하이브리드, 3개월)의 야생형 수컷 마우스는 M3 무스카린 수용체(hM3Dq)를 해내로 인코딩하는 AAV를 입체적으로 주입하였다. 전체 실험 동안, 마우스는 일반 12 시간 빛 아래, 단일 보관했다: 12 h 어두운 (T24) 주기, 음식과 물 광고 리비툼에대한 액세스.

1. 입체 외과 수술을 수행하기 전에 스테레오택 프레임과 필요한 모든 악기를 청소하고 살균하십시오.
   참고: 수술용 커튼은 멸균 장을 유지하고 마우스의 열 손실을 줄이는 데 사용할 수 있습니다.
2. 이소플루란을 사용하여 마우스를 깊이 마취시다. 이렇게하려면 먼저 산소 유량계를 약 1.5 L / min으로 조정한 다음 이소플루란 기화기를 유도의 경우 약 3-5 %, 유지 보수를 위해 약 1-3 %로 조정하십시오.
   1. 동물이 완전히 의식을 잃었을 수 있도록 마우스의 발을 꼬집습니다. 꼬치에 대한 플린칭 반응이 없을 때 동물이 제대로 마취됩니다.
3. 마우스의 체온안정성을 유지하기 위해 가열 패드에 마우스를 놓습니다.
4. 머리 의 상단을 면도하고 스테레오 택시 프레임에 마우스의 머리를 고정합니다. 그런 다음 눈에 안구 보호 윤활제를 바르고, 포비도 요오드와 70 % 에탄올로 문질러 표면을 청소하고 멸균 메스를 사용하여 두개골을 노출시다.
5. 브레그마 포인트로 프레임을 보정한 다음, 해마를 표적으로 하기 위해 2.9 mm의 내측 좌표와 전방 후방 좌표 -2.7 mm로 드릴링합니다.
   참고 : 다른 뇌 표적을 주입해야하는 경우 Paxinos 및 프랭클린 마우스 아틀라스^16을사용하여 주입을위한 원하는 좌표를 결정하십시오.
6. 뇌가 노출되면, 마이크로인젝터를 사용하여 해마에서 -3.0 mm의 등쪽-복부 깊이에서 AAV의 90 nL을 일방적으로 주입하고 미세모세관 피펫을 뽑아냈다(그림 1A).
   참고: 이 실험에 사용된 AAV의 기중기표는 참조하십시오. 다른 뇌 영역의 경우 필요에 따라 AAV 주입 볼륨을 조정합니다.
7. 수술이 끝나면 나일론 봉합사로 절개를 닫고 상처 부위에 국소 항생제를 적용하십시오.
8. 수술 직후 조직적으로 진통제 (buprenorphine, 0.1 mg /kg)를 투여하고 4-6 시간 후에 투여하십시오.
9. 시작 4 주 주입 후, 대상 마우스디자이너 흥분 수용체를 발현하는 만성 제어 뉴런에 다음 섹션에 설명 된 패러다임중 어느.

2. 점안액을 이용한 반복적인 CNO 전달

1. 안약 투여 전 3-4일 동안 매일 3분씩 각 마우스를 스크러핑하여 동물을 취급하도록 적응시킴.
2. 클로자핀-N-옥사이드(CNO, 5 mg)를 멸균 0.9% 식염수 용액 1mL에 용해하십시오(스톡 솔루션: 5 mg CNO/mL). 용액을 4°C로 냉장 보관하십시오.
3. 실험을 시작하기 전에 각 마우스의 무게를 측정하여 전달할 CNO의 양을 결정합니다. 1-3 μL 드롭(눈당)을 사용하여 1.0 mg 의 CNO/kg 체중을 달성하십시오.
   참고: 예를 들어, 20g 마우스는 양측(각 2 μL) 점안액을 받아야 합니다.
4. 마우스의 비활성(light) 단계 동안 점안액을 전달하며, 2시간 전에 조명이 꺼집니다(zT 시간(ZT) 10). CNO가 마우스의 활성(어두운) 단계에서 전달되어야 하는 경우 적절한 동물 취급을 위해 희미한 빨간색 표시등이 있는지 확인하십시오.
   참고: 실험 동물의 circadian (및 빛/어두운) 주기를 방해 하지 않도록 주의 해야 합니다.
   1. P10 마이크로파이펫을 사용하여 1.0 mg CNO/kg을 달성하기 위해 CNO 용액의 필요한 양(1-3 μL)을 적재하십시오.
      참고: 각 점안액에 대해 새롭고 멸균된 파이펫 팁을 사용하십시오. 이 실험 세트에서, CNO의 양측 점안액이 수행되었다; 그러나, 더 낮은 CNO 농도가 요구되는 경우에, 일방적인 점안액은 또한 적용될 수 있었습니다.
   2. 스크러프를 통해 마우스를 고정시.
   3. 파이펫 팁에 안정된 물방울이 형성될 때까지 용액을 천천히 배출합니다.
   4. 용액이 전달될 때까지 조심스럽게 물방울을 마우스 눈의 각막 가까이에 놓습니다. 파이펫 팁은 마우스의 눈에 닿지 않아야 합니다.
   5. 마우스를 놓아 홈 케이지에 다시 넣습니다.
5. 이 절차를 매일 5 일 동안 반복하십시오.
   참고: 이 기간은 실험 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다.
6. 대조군 실험의 경우, AAV/DREADD 주입 마우스를 사용하여 가짜 치료(식염수만을 함유하는 점안액)를 실시하고, 설명된 CNO 점안액 프로토콜에 노출된 빈 벡터(예: AAV/mCherry)로 주입된 마우스를 사용한다.

3. 식수를 통해 전달된 만성 CNO 처리

1. 50 mL (플라스틱) 원두 튜브와 고무 스토퍼 주유를 사용하여 작은 병을 만드십시오. CNO 안정성에 대한 광 매개 효과를 피하기 위해 알루미늄 호일로 덮습니다.
2. CNO 처리를 시작하기 3일 전에, 일반 물병을 10 mL의 일반 물을 함유하는 작은 병으로 교체하여 쥐가 적응할 수 있도록 하십시오. 테이프를 사용하여 병을 케이지에 고정합니다.
3. 각 마우스의 일일 물 소비량측정.
4. 실험을 시작하기 전에 각 마우스의 무게를 측정합니다.
5. 0.9% 멸균 식염수 용액의 1 mL에 클로자핀-N-옥사이드(CNO, 5 mg)를 용해하십시오. 재고 용액을 4°C에서 냉장 보관하십시오.
6. 1.0 mg CNO/ kg (체중)을 달성하기 위해 CNO 용액의 농도를 정의하기 위해 소비 된 물의 체중과 평균 양을 사용합니다.
   참고 : 성인 남성 마우스 (~ 20g 체중)는 하루에~ 5 mL의 물을 섭취합니다 (그림 2A). 따라서 1 mg CNO/kg의 CNO 농도를 달성하려면, 6.4 μL의 CNO 스톡 용액을 8 mL의 최종 부피(최종 농도: 4 μg CNO/mL)에 첨가해야 한다. 따라서, 하루에 5 mL 물을 마시는 20g 동물에 대한 CNO의 용량은 1 mg CNO / kg을 초래합니다.
7. 농도의 범위를 테스트하여 최소한의 CNO 농도로 최대 효과를 표시하는 최적의 CNO 용량을 결정합니다. 식수 방법에 대한 최적의 CNO 용량을 결정하기 위해 용량 응답 분석을 수행합니다.
   참고: 다음 CNO 용량은 이 실험을 위해 시험되었다: 1.0 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.1 mg/mL, 및 식염수. 1.0 mg CNO/kg은 i.p. 및 점안제 프로토콜에 기초하여 처음 시험되었다.
8. 1일째에는 8 mL의 일반 물로 병을 채우고 필요한 양의 CNO를 추가하십시오.
   참고 : 이 양의 물은 성인 남성 마우스에 대한 광고 리비텀 물 액세스 24 시간 충분합니다. 다른 설치류 종을 사용하는 경우, 먼저 필요한 양을 결정하기 위해 매일 소비되는 물의 양을 측정합니다.
9. 프로토콜 전반에 걸쳐 동물의 건강을 모니터링하여 물 + CNO 소비로 인한 부작용이 없는지 확인합니다.
10. 24 시간 후, 담수 + CNO 용액으로 병을 교체하십시오. 전날 소비된 볼륨을 기록합니다.
11. 폐기물 용기에 소모되지 않은 물 + CNO 용액을 폐기하십시오. 플라스틱 병을 버리고 동물 시설 지침에 따라 소독 한 후 매일 고무 마개 교체하십시오.
    참고: 수성 폐기물을 유기 용매와 혼합하지 마십시오. 보관 및 픽업에 대한 지침은 화학 물질 폐기 서비스에 문의하십시오.
12. 병을 매일 같은 시간에 5일 동안 교체하십시오.
    참고: 이 기간은 실험 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다.
13. 단계 2.6에 설명된 대로 대조군을 포함한다.

4. 자당에 대한 마우스의 선호를 사용하여 제한된 CNO 치료

1. CNO 처리를 시작하기 3 일 전에, 바람직하게는 원래 물 병에서 멀리 케이지에 물 10 mL + 1 % 자당을 포함하는 작은 병을 놓습니다.
   참고: 3.1단계에 설명된 것과 동일한 작은 병을 사용하십시오.
2. 활성 단계의 마지막 부분 (ZT 18 – 24)동안 동물을 물에 노출 + 1 % 자당. 이 노출 후 케이지에서 물 + 자당으로 병을 제거하십시오.
   참고: CNO 배달의 다른 시간 창을 사용할 수 있습니다. 추가적으로, 마우스는 CNO 납품을 촉진하기 위하여 빛의 개시가 저녁 시간에 생기는 반전된 빛/어두운 주기의 밑에 놓일 수 있었습니다.
3. 각 마우스에 대한 일일 물 + 1 % 자당 소비를 측정합니다.
4. 실험을 시작하기 전에 각 마우스의 무게를 측정합니다.
5. 1.0 mg CNO/kg(체중)을 달성하기 위해 CNO 용액의 용량을 결정하기 위해 소비된 체당 +1%의 물 중량과 평균 양을 사용하십시오.
   참고: 단계 3.6에서 설명한 대로 최소한의 CNO 농도로 최대 효과를 나타내는 최적의 CNO 용량을 테스트해야 합니다.
6. 1일째에는 5 mL의 물 + 1% 자당 + CNO(1 mg CNO/Kg)로 병을 채우고 정해진 시간 동안 케이지(항상 같은 장소에)에 놓습니다.
7. 제한된 시간 창의 끝에서, 병을 제거하고 소비 물 + 자당 + CNO의 양을 측정합니다.
   참고: 재료 및 용액은 3.11 단계에서 설명한 대로 소독되거나 폐기됩니다.
8. 이 절차를 매일 5 일 동안 반복하십시오.
   참고: 이 기간은 실험 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다.
9. 단계 2.6에 기재된 바와 같이 대조군을 포함한다.

5. 데이터 분석

1. 마지막 반복적 (5 일째) CNO 눈 방울을 받은 후 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 내측으로 마우스를 침전시. CNO가 식수를 통해 전달되면 마우스의 활성 단계 끝에 있는 물로 CNO + 물을 교체한 다음 CNO 후 2시간 또는 6시간 후에 마우스를 침전시십시오.
   참고: 빛 노출이 관심 영역의 c-Fos 유도에 영향을 줄 수 있는 경우, 실험 마지막 날과 관류 전에 마우스를 일정한 어둠 속에 보관하십시오.
2. 조심스럽게 뇌를 해부하고 9-12시간 동안 4% PFA 용액에 담급전시.
3. PFA 고정 후, 30 % 자당 용액을 사용하여 뇌 조직을 냉동 보호 (뇌가 가라 앉을 때까지 기다립니다), 다음 저온 중지를 사용하여 뇌를 섹션.
4. 상동맥 뇌 섹션(35 μm)을 1x PBS, 10% 소 혈청 알부민, 0.3% 트리톤 X-100을 실온에서 1시간 동안 함유하는 용액으로 옮니다.
5. 항 C-Fos (1:2500) 항체 용액으로 뇌 절편을 4 °C에서 밤새 일정한 교반으로 배양합니다.
6. 1x PBS 및 0.3% 트리톤 X-100을 함유하는 용액으로 각각 5분씩 3회 세척한 후, 실온에서 1시간 동안 알렉사 컨쥬게이트 이차 항체(1:500) 용액으로 샘플을 배양하고 일정한 교반을 갖는다.
7. 공초점 현미경을 사용하여 디지털 이미지를 가져옵니다. 사진 편집 및 분석 소프트웨어(예: Adobe Photoshop)를 통해 캡처된 이미지를 조립하고 처리합니다.
8. 데이터 분석을 위해 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 AAV 감염 영역(mCherry(+) 셀을 개략적으로 설명하고 측정하고 이 영역 내의 c-Fos(+) 셀 수를 정량화하여 영역당 활성화된 셀 수를 얻습니다. 동물 당 3 개의 개별 섹션에서 얻은 결과를 결합하십시오.

결과

우리는 점안액을 이용한 반복적인 CNO 전달이 대부분의 감염된 뉴런에서 c-Fos 발현의 강력한 유도를 유도한다는 것을 관찰했습니다(그림1C),반복적인 노출 동안 CNO 전달의 효과가 지속됨을 보여주는. 더욱이, CNO 처리 후 2시간 수집된 시료에서 c-Fos의 유의한 유도가 관찰되었고, CNO 노출 후 6시간 수득된 샘플과 비교하여(도1D-E),CNO에 의해 유도된 변화가 시간에 의?...

토론

공포는 원격으로 신경 활동을 조작하는 대중적이고 효과적인 접근법으로 등장했다^17. CNO 제공을 위한 대체 전략설계는 특정 실험 설정에 사용할 수 있는 옵션의 스펙트럼을 광범위하게 증가시킬 것입니다. 또한, CNO의 전달을 위한 비침습적 전략은 동물의 건강에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 부작용을 감소시킴으로써 결과의 잠재적인 오해를 최소화합니다. 여기에서는 DREADDs(hM...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Sigma life science	#A2153-100G	Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis)
C57BL/6J mice	The Jackson laboratory	#000664	male mice, 3 months old
Capillaries	Drummond Scientific Company	#3-000-203-G/X	Outer diameter: 1.14 in.
Clozapine-N-oxide	Sigma	#C0832	5mg
Forane	Baxter	#NDC 10019-360-60	Isoflurane, USP
Microinjector III	Drummond Scientific Company	#3-000-207	Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector
Mounting media	Invitrogen	#P36930	Prolong Gold antifade reagent
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	#15710	16% aqueous solution (methanol free), 10 ml
Primary c-Fos Antibody	Cell signaling technology	#2250S	c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl)
rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry	UNC Vector Core		Titer: ~3x10e12 vg/mL
rAAV5/hSyn-mCherry	UNC Vector Core		Titer: ~3x10e12 vg/mL
Secondary Antibody	Invitrogen	#A21206	Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml
Triton X-100	americanbio.com	#AB02025-00100