Неинвазивные стратегии хронического манипулирования контролируемой DREADD нейронной активностью

Резюме

Здесь мы описываем два неинвазивных метода хронического контроля нейронной активности с использованием хемогенетики у мышей. Глазные капли были использованы для доставки клозапин-N-оксид (CNO) ежедневно. Мы также описываем два метода длительного введения CNO в питьевой воде. Эти стратегии хронического контроля нейронов требуют минимального вмешательства, снижая стресс животных.

Аннотация

Химиогенетические стратегии стали надежными инструментами дистанционного управления нейронной активностью. Среди них дизайнерские рецепторы, активизируемые исключительно дизайнерскими препаратами (DREADDs), стали самым популярным хемогенетическим подходом, используемым в современной неврологии. Большинство исследований доставить лиганд клозапин-N-оксид (CNO) с помощью одной интраперитонеальной инъекции, которая подходит для острого активации / ингибирования целевой нейронной популяции. Есть, однако, лишь несколько примеров стратегий для хронической модуляции DREADD контролируемых нейронов, большинство из которых полагаются на использование систем доставки, которые требуют хирургического вмешательства. Здесь мы расширяем две неинвазивные стратегии для доставки лиганда CNO для хронического манипулирования нейронной популяции у мышей. CNO вводили либо с помощью повторяющихся (ежедневных) глазных капель, или хронически через питьевую воду животного. Эти неинвазивные парадигмы приводят к надежной активации дизайнерских рецепторов, которые сохранялись на протяжении всего лечения CNO. Методы, описанные здесь предлагают альтернативы для хронического DREADD-опосредованного контроля нейронной активности и могут быть полезны для экспериментов, направленных на оценку поведения в свободно движущихся животных, уделяя особое внимание менее инвазивных методов доставки CNO.

Введение

Технические достижения в области нейробиологии позволили ученым точно выявлять иконтролировать активность определенных нейронных популяций 1. Это способствовало лучшепонять основы нейрональных цепей и их влияние на поведение животных, а также, пересмотр установленных догм^2,3. Среди этих новых инструментов, оптогенетические и химиогенетические стратегии оказали глубокое влияние не только на качество открытий, но и на то, как эксперименты задуманы и разработаны⁴. В настоящей рукописи мы сосредоточиваемся на химиогенетических стратегиях контроля активации нейронов с помощью инженерных стратегий рецептор-лиганд. Дизайнерские рецепторы, активируемые исключительно дизайнерскими препаратами (DREADDs), представляют собой один из самых популярных химиогенетических инструментов для дистанционного управления нейронной активностью, как было рассмотрено Roth 2016⁵. DREADDs использовать модифицированные мускариновых рецепторов ацетилхолина, которые специально активируются инертным лиганд, клозапин-N-оксид (CNO)⁶.

Большинство исследований используют CNO в ведении интраперитонеальных (т.п.) инъекций, который эффективно контролирует дозировку и сроки активации инженерных рецепторов в острой моды. Однако, когда требуется повторяющаяся или хроническая активация DREADD, использование нескольких инъекций i.p. становится неосуществимым. Для решения этой проблемы, различные стратегии для хронической доставки CNO были зарегистрированы, в том числе имплантированных minipumps⁷ и внутричерепных канюлев^8,9. В разной степени, все эти стратегии вызывают у животных стресс и боль¹⁰, и требуют хирургического вмешательства, которые также могут иметь прямое влияние на поведенческие реакции, которые будут проверены¹¹. Здесь мы описываем три неинвазивные стратегии для хронической доставки CNO.

Для этой цели мышам были стереотаксисически введены в гиппокампе с адено-ассоциированным вирусом (AAV), кодирующим сконструированную версию возбуждающего мускарина M3 (hM3Dq), что при активации лиганд CNO приводит к взрыву, как стрельба нейроны⁶. Ранее было показано, что одна капля глаз, содержащая CNO может эффективно вызвать надежную активацию DREADD-выражения нейронов¹². Здесь мы описываем модифицированный метод для повторяющейся доставки глазных капель. Для достижения хронического и устойчивого контроля над рецепторами дизайнера, мы затем описать неинвазивную стратегию для доставки CNO для мышей через питьевую воду. Наконец, мы описываем альтернативную парадигму для доставки CNO в питьевой воде во время ограниченного временного окна. Мышей локомоторной деятельности, а также питьевой поведение и потребление сладких калорий решений, в основном ограничивается темной части света / темного цикла^13,14. Поэтому мы приняли протокол, основанный на предпочтении мыши сахарозе. Путем измерять индукцию немедленно-раннего гена c-Fos в AAV-инфицированных клетках, как считывание для активации нейронов^12,15, мы нашли что эти стратегии поставки CNO надежно активируют DREADD-контролируемые невенциальны над выдвинутыми Длительности.

протокол

Все животные были обработаны в соответствии с руководящими принципами Комитетов по уходу и использованию животных Национального института психического здоровья (NIMH). Были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму боль и количество животных, используемых.

1. Инъекции адено-ассоциированных вирусов в гиппокампе

ПРИМЕЧАНИЕ: Дикий тип мышей смешанного фона (B6/129 F1 гибрид, 3 месяцев) были для стереотаксиically вводили с AAV кодирования M3 мускариновый рецептор (hM3Dq) в гиппокампе. В течение всего эксперимента, мыши были однодомейные, под регулярным 12 ч свет: 12 ч темный (T24) цикл, с доступом к пище и воде ad libitum.

1. Перед выполнением стереотаксических операций очистите и стерилизуем стереотаксической раме и всех необходимых инструментах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические шторы могут быть использованы для поддержания стерильного поля и снижения потери тепла мыши.
2. Глубоко обезвититмышь мышь с помощью изофлюран. Для этого сначала отрегулируйте расходора кислорода примерно до 1,5 л/мин, а затем отрегулируйте изофлуранский испаритель примерно до 3-5% для индукции и примерно 1-3% для обслуживания.
   1. Чтобы убедиться, что животное полностью без сознания, щипать лапу мыши; животное должным образом обезболивается, когда вздрагивая ответ на щепотку отсутствует.
3. Поместите мышь на грелку для поддержания стабильности температуры тела мыши.
4. Побрить верхнюю часть головы и закрепите головку мыши к стереотаксической раме. Затем нанесите на глаза глазную защитную смазку, очистите поверхность, очистив повид-йодом и 70% этанола, и разоблачите череп с помощью стерильного скальпеля.
5. Калибровайте раму до точки брегмы, затем просверлите по медиально-боковой координате 2,9 мм и передне-задним координатам -2,7 мм для целевой направленности на гиппокамп.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если другой цель мозга должна быть введена, определить желаемые координаты для инъекций с помощью Paxinos и Франклин мыши атлас¹⁶.
6. Как только мозг подвергается, в одностороннем порядке вводить 90 нл AAV на дорсально-вентральной глубине -3,0 мм в гиппокампе с помощью микроинжектора и вытащил микрокапиллярных пипетки(рисунок 1A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблица материалов для титра AAV, используемого в этом эксперименте. Для других областей мозга, настроить объем AAV инъекции по мере необходимости.
7. В конце хирургической процедуры, закрыть разрез с нейлоновыми швами и применять актуальные антибиотики в рану сайта.
8. Администрирование анальгетиков (бупренорфин, 0,1 мг/кг) системно сразу после операции, и 4-6 часов после.
9. Начиная с 4 недель после инъекции, подвергимытие мышей любой из парадигм, описанных в следующем разделе для хронического контроля нейронов, выражающих дизайнер возбуждающий рецептор.

2. Повторяющиеся поставки CNO с помощью глазных капель

1. Акклиматизировать животных к обработке, чистя каждую мышь 3 мин ежедневно в течение 3-4 дней до введения глазных капель.
2. Растворите Клозапин-N-оксид (CNO, 5 мг) в 1 мл стерильного раствора 0,9% солевой раствор (стоковый раствор: 5 мг CNO/mL). Храните раствор в холодильнике при 4 градусах Цельсия.
3. Взвесьте каждую мышь перед началом эксперимента, чтобы определить количество CNO, которые будут доставлены. Используйте 1-3 капли (на глаз) для достижения 1,0 мг CNO / кг массы тела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, 20 г мыши должны получать двусторонние (по 2 л. каждый) глазные капли.
4. Доставка глазные капли во время неактивной (легкой) фазы мышей, 2 ч до выключения света (времяzeitgeber (ЗТ) 10). В тех случаях, когда CNO должен быть доставлен во время активной (темной) фазы мышей, обеспечить наличие тусклого красного света для надлежащего обращения с животными.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Меры предосторожности должны быть приняты, чтобы избежать нарушения циркадного (и светлого/темного) цикла экспериментальных животных.
   1. Используя микропайпет P10, загрузите необходимое количество (1-3 л) раствора CNO для достижения 1,0 мг CNO/kg.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте новый и стерильный кончик пипетки для каждого глаз-капли. В этом наборе экспериментов были выполнены двусторонние глазные капли CNO; однако, если требуется более низкая концентрация CNO, односторонние глазные капли могут быть также применены.
   2. Обездвижить мышь через потертости.
   3. Медленно изгоните раствор до тех пор, пока на кончике пипетки не образуется стабильная капля.
   4. Аккуратно принесите капельку близко к роговице глаза мыши, пока раствор не будет доставлен. Наконечник пипетки никогда не должен контактировал с глазом мыши.
   5. Отпустите мышь, поместив ее обратно в свою домашнюю клетку.
5. Повторите эту процедуру каждый день в течение 5 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта продолжительность может быть скорректирована в соответствии с экспериментальными требованиями.
6. Для контрольных экспериментов используйте AAV/DREADD-инъекционные мыши, подвергающиеся фиктивному лечению (глазные капли, содержащие только солены), и мыши, вводимые с пустым вектором (например, AAV/mCherry), подвергаемые описанному протоколу глазных капель CNO.

3. Хроническая обработка CNO поставленная через питьевую воду

1. Сделать небольшие бутылки с использованием 50 мл (пластиковые) конические трубки и резиновые пробки носики; крышка алюминиевой фольгой, чтобы избежать каких-либо световых воздействий на стабильность CNO.
2. За три дня до начала обработки CNO, заменить регулярные бутылки с водой с небольшими бутылками, содержащие 10 мл обычной воды, чтобы мышей акклиматизироваться к ним. Защищайте бутылки к клеткам с помощью ленты.
3. Измерьте ежедневное потребление воды для каждой мыши.
4. Взвесьте каждую мышь перед началом эксперимента.
5. Растворите клозапин-N-оксид (CNO, 5 мг) в 1 мл стерильного солей. Охладите бульонный раствор при 4 градусах Цельсия.
6. Используйте вес тела и среднее количество потребляемой воды, чтобы определить концентрацию раствора CNO для достижения 1,0 мг CNO/kg (вес тела).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые мыши-самцы (вес тела - 20 г) потребляют 5 мл воды в день(рисунок 2А). Поэтому для достижения концентрации CNO в 1 мг CNO/kg, 6,4 л раствора запасов CNO следует добавить к окончательному объему 8 мл воды (окончательная концентрация: 4 мкг CNO/mL). Таким образом, доза CNO для 20 г животного, которое пьет 5 мл воды в день приводит к 1 мг CNO / кг.
7. Определите оптимальную дозу CNO, которая отображает максимальную эффективность с минимальной концентрацией CNO, проверяя диапазон концентраций. Выполните анализ реакции дозы для определения оптимальной дозы CNO для метода питьевой воды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента были протестированы следующие дозы CNO: 1,0 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,1 мг/мл и солин. 1,0 мг CNO/kg был впервые протестирован на основе протоколов i.p. и глазных капель.
8. На 1 день, заполнить бутылку с 8 мл обычной воды и добавить необходимое количество CNO.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это количество воды достаточно для 24 ч доступа к воде ad libitum для взрослой мужской мыши. В случае использования других видов грызунов, сначала измерьте количество воды, потребляемой ежедневно, чтобы определить необходимый объем.
9. Мониторинг здоровья животных на протяжении всего протокола, чтобы убедиться, что нет никаких побочных эффектов, вызванных водой и потреблением CNO.
10. После 24 ч замените бутылки пресной водой и раствором CNO. Запись объема потребляемого в течение предыдущего дня.
11. Утилизировать воду и раствор CNO, который не потреблялся в мусорных контейнерах. Откажитесь от пластиковых бутылок и замените резиновые пробки каждый день, после дезинфекции их в соответствии с руководящими принципами животного объекта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не смешивайте ваковые отходы с органическими растворителями. Для получения инструкций по хранению и вывозу свяжетесь с нами в Службе химической утилизации.
12. Замените бутылки в одно и то же время каждый день в течение 5 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта продолжительность может быть скорректирована в соответствии с экспериментальными требованиями.
13. Включите контрольные группы, как описано в шаге 2.6.

4. Ограниченное лечение CNO с использованием предпочтений мышей для сахарозы

1. За 3 дня до начала лечения CNO поместите небольшую бутылку, содержащую 10 мл воды и 1% сахарозы на клетку, желательно вдали от оригинальной бутылки с водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте те же маленькие бутылки, описанные в шаге 3.1.
2. Выставляйте животных в воду и 1% сахарозы во время последней части их активной фазы (No 18 - 24). После этой экспозиции, удалить бутылку с водой и сахарозы из клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различные временные окна доставки CNO могут быть использованы. Кроме того, мыши могут быть помещены под перевернутый свет / темный цикл, где начало света происходит в вечерние часы для облегчения доставки CNO.
3. Измерьте суточную норму воды и 1% потребления сахарозы для каждой мыши.
4. Взвесьте каждую мышь перед началом эксперимента.
5. Используйте вес тела и среднее количество воды - 1% сахарозы, потребляемой для определения дозы раствора CNO для достижения 1,0 мг CNO/kg (вес тела).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная доза CNO, которая отображает максимальную эффективность с минимальной концентрацией CNO должны быть проверены, как это объясняется в шаге 3.6.
6. На 1-й день, заполнить бутылки с 5 мл воды и 1% сахарозы и CNO (1 мг CNO / кг) и поместить их на клетку (всегда в том же месте) в течение определенного времени окна.
7. В конце ограниченного временного окна, удалить бутылки и измерить количество воды и сахарозы и CNO потребляется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы и решения дезинфицируются или отбрасываются, как описано ранее в шаге 3.11.
8. Повторите эту процедуру каждый день в течение 5 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта продолжительность может быть скорректирована в соответствии с экспериментальными требованиями.
9. Включите контрольную группу, описанную в шаге 2.6.

5. Анализ данных

1. Perfuse мышей внутрикардиально с 4% параформальдегида (PFA) либо 2 или 6 ч после получения последнего повторяющихся (5-й день) CNO глаз капли. Когда CNO доставляется через питьевую воду, замените воду CNO и водой в конце активной фазы мыши, а затем пронизываете мышь после 2 или 6 ч после доступа CNO.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если воздействие света может повлиять на индукцию c-Fos в области интереса, держать мышей в постоянной темноте в последний день экспериментов, и до перфузии.
2. Тщательно вскрыть мозг и погрузиться в 4% PFA решение для 9-12h.
3. После фиксации PFA, криозащиты ткани мозга с помощью 30% сахарозы раствор (подождать, пока мозг тонет), а затем раздел мозга с помощью криостата.
4. Перенесите секции коронального мозга (35 мкм) в раствор, содержащий 1x PBS, 10% бычьего сывороточку альбумина и 0,3% Triton X-100 на 1 ч при комнатной температуре.
5. Инкубировать секции мозга с анти-c-Fos (1:2500) антитела раствор на 4 кв кв ночь с постоянным возбуждением.
6. После 3 стирок по 5 мин каждый с раствором, содержащим 1x PBS и 0,3% Triton X-100, инкубировать образцы с Alexa-конъюгированных вторичных антител (1:500) раствор для 1 ч при комнатной температуре вдали от света и с постоянным возбуждением.
7. Получай цифровые изображения с помощью конфокального микроскопа. Собирайте и обрабатывают захваченные изображения с помощью программного обеспечения для редактирования и анализа фотографий (например, Adobe Photoshop).
8. Для анализа данных, наброски и измерения AAV-инфицированных областей (mCherry (я) ячейки) с помощью программного обеспечения ImageJ, и количественно количество c-Fos (Я) клеток в этой области, чтобы получить количество активированных ячеек на область. Объедините результаты, полученные из 3 отдельных секций на одно животное.

Результаты

Мы заметили, что повторяющиеся поставки CNO с помощью глазных капель вызвали надежную индукцию c-Fos выражение в большинстве инфицированных нейронов (Рисунок 1C), показывая, что эффективность доставки CNO поддерживается во время повторяющихся воздействия. Кроме того, значит?...

Обсуждение

DREADDs стали популярным и эффективным подходом к удаленному манипулированию нейронной активностью¹⁷. Разработка альтернативных стратегий для доставки СНО в целом увеличит спектр вариантов, доступных для конкретных экспериментальных настроек. Кроме того, неинвазивные стра?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Sigma life science	#A2153-100G	Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis)
C57BL/6J mice	The Jackson laboratory	#000664	male mice, 3 months old
Capillaries	Drummond Scientific Company	#3-000-203-G/X	Outer diameter: 1.14 in.
Clozapine-N-oxide	Sigma	#C0832	5mg
Forane	Baxter	#NDC 10019-360-60	Isoflurane, USP
Microinjector III	Drummond Scientific Company	#3-000-207	Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector
Mounting media	Invitrogen	#P36930	Prolong Gold antifade reagent
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	#15710	16% aqueous solution (methanol free), 10 ml
Primary c-Fos Antibody	Cell signaling technology	#2250S	c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl)
rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry	UNC Vector Core		Titer: ~3x10e12 vg/mL
rAAV5/hSyn-mCherry	UNC Vector Core		Titer: ~3x10e12 vg/mL
Secondary Antibody	Invitrogen	#A21206	Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml
Triton X-100	americanbio.com	#AB02025-00100