Nicht-invasive Strategien zur chronischen Manipulation der DREADD-kontrollierten neuronalen Aktivität

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir zwei nicht-invasive Methoden zur chronischen Kontrolle der neuronalen Aktivität mit Chemogenetik bei Mäusen. Augentropfen wurden verwendet, um Clozapin-N-Oxid (CNO) täglich zu liefern. Wir beschreiben auch zwei Methoden für die längere Verabreichung von CNO im Trinkwasser. Diese Strategien zur chronischen neuronalen Kontrolle erfordern minimale Eingriffe, um den Stress der Tiere zu reduzieren.

Zusammenfassung

Chemogenetische Strategien haben sich als zuverlässige Werkzeuge für die Fernsteuerung der neuronalen Aktivität herauskristallisiert. Unter diesen, Designer-Rezeptoren ausschließlich durch Designer-Medikamente aktiviert (DREADDs) haben sich die beliebtesten chemogenetischen Ansatz in der modernen Neurowissenschaft verwendet. Die meisten Studien liefern das Ligand Clozapin-N-Oxid (CNO) mit einer einzigen intraperitonealen Injektion, die für die akute Aktivierung/Hemmung der gezielten neuronalen Population geeignet ist. Es gibt jedoch nur wenige Beispiele für Strategien zur chronischen Modulation von DREADD-kontrollierten Neuronen, von denen die meisten auf den Einsatz von Trägersystemen angewiesen sind, die einen chirurgischen Eingriff erfordern. Hier erweitern wir zwei nicht-invasive Strategien zur Bereitstellung des Liganden-CNO zur chronischen Manipulation der neuronalen Population bei Mäusen. CNO wurde entweder mit repetitiven (täglichen) Augentropfen oder chronisch durch das Trinkwasser des Tieres verabreicht. Diese nicht-invasiven Paradigmen führen zu einer robusten Aktivierung der Designerrezeptoren, die während der gesamten CNO-Behandlungen fortbestehen. Die hier beschriebenen Methoden bieten Alternativen zur chronischen DREADD-vermittelten Kontrolle der neuronalen Aktivität und können für Experimente nützlich sein, die entwickelt wurden, um das Verhalten bei frei beweglichen Tieren zu bewerten, wobei der Schwerpunkt auf weniger invasiven CNO-Bereitstellungsmethoden liegt.

Einleitung

Technische Fortschritte auf dem Gebiet der Neurowissenschaften haben es Wissenschaftlern ermöglicht, die Aktivität bestimmter neuronaler Populationen genau zu identifizieren und zu kontrollieren¹. Dies hat dazu beigetragen, die Grundlagen der neuronalen Schaltkreise und ihre Auswirkungen auf das Verhalten von Tieren besser zu verstehen, sowie die Überarbeitung etablierter Dogmen^2,3. Unter diesen neuartigen Werkzeugen haben optogenetische und chemogenetische Strategien nicht nur die Qualität der Entdeckungen, sondern auch die Art und Weise, wie Experimente konzipiert und gestaltet werden, tiefgreifend beeinflusst⁴. Im vorliegenden Manuskript konzentrieren wir uns auf chemogenetische Strategien zur Steuerung der Aktivierung von Neuronen über entwickelte Rezeptor-Ligand-Strategien. Designerrezeptoren, die ausschließlich durch Designer-Medikamente (DREADDs) aktiviert werden, stellen eines der beliebtesten chemogenetischen Werkzeuge für die Fernsteuerung der neuronalen Aktivität dar, wie von Roth 2016⁵überprüft. DREADDs verwenden modifizierte muscarinische Acetylcholin-Rezeptoren, die speziell durch eine inerte Liganligande aktiviert werden, Clozapin-N-Oxid (CNO)⁶.

Die meisten Studien verwenden CNO durch intraperitoneale (i.p.) Injektionen verabreicht, die effektiv steuert die Dosierung und Timing der technischen Rezeptoren Aktivierung in akuter Weise. Wenn jedoch eine repetitive oder chronische DREADD-Aktivierung erforderlich ist, wird die Verwendung mehrerer i.p.-Injektionen nicht mehr möglich. Um dieses Problem anzugehen, wurden verschiedene Strategien für die chronische CNO-Lieferung berichtet, einschließlich implantierter Minipumpen⁷ und intrakraniellen Kanülen^8,9. In unterschiedlichem Ausmaß verursachen all diese Strategien Stress und Schmerzen¹⁰, und erfordern einen chirurgischen Eingriff, der auch einen direkten Einfluss auf die Zutest-Verhaltensreaktionen haben könnte¹¹. Hier beschreiben wir drei nicht-invasive Strategien für die chronische CNO-Entbindung.

Zu diesem Zweck wurden Mäuse stereotaxisch in den Hippocampus mit einem Adeno-assoziierten Virus (AAV) injiziert, der eine technische Version des exzitatorischen M3-Muskarinrezeptors (hM3Dq) kodiert, der bei Aktivierung durch den Liganden CNO zum burstartigen Abfeuern von Neuronen⁶. Es wurde zuvor gezeigt, dass ein einzelner Augentropfen, der CNO enthält, effektiv eine robuste Aktivierung der DREADD-exemitten Neuronen¹²auslösen kann. Hier beschreiben wir eine modifizierte Methode zur wiederholten Abgabe von Augentropfen. Um eine chronische und nachhaltige Kontrolle der Designerrezeptoren zu erreichen, beschreiben wir als nächstes eine nicht-invasive Strategie, Um cNO an Mäuse durch das Trinkwasser zu liefern. Schließlich beschreiben wir ein alternatives Paradigma für die Bereitstellung von CNO im Trinkwasser während eines begrenzten Zeitfensters. Die Motoraktivität der Mäuse sowie das Trinkverhalten und der Konsum von süßen Kalorienlösungen beschränken sich meist auf den dunklen Teil des Hellen/Dunkel-Zyklus^13,14. Daher haben wir ein Protokoll angenommen, das auf der Vorliebe der Maus für Saccharose basiert. Durch die Messung der Induktion des unmittelbar-frühen Gens c-Fos in AAV-infizierten Zellen, als Auslese für neuronale Aktivierung^12,15, fanden wir heraus, dass diese CNO-Lieferstrategien DREADD-kontrollierte Neuronen über erweiterte Dauer.

Protokoll

Alle Tiere wurden nach den Richtlinien der Tierpflege- und Einsatzausschüsse des National Institute of Mental Health (NIMH) behandelt. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um den Schmerz und die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren.

1. Adeno-assoziierte Virusinjektionen im Hippocampus

HINWEIS: Wilde männliche Mäuse mit gemischtem Hintergrund (B6/129 F1 Hybrid, 3 Monate alt) wurden für stereotaxisch mit einem AAV injiziert, der den M3-Muskarinrezeptor (hM3Dq) in den Hippocampus kodiert. Während des gesamten Experiments wurden Mäuse eingeschossig untergebracht, unter einem normalen 12 h Licht: 12 h dunkler (T24) Zyklus, mit Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum.

1. Vor der Durchführung stereotaxic Operationen, reinigen und sterilisieren Sie den stereotaxic Rahmen und alle benötigten Instrumente.
   HINWEIS: Chirurgische Vorhänge könnten verwendet werden, um ein steriles Feld zu erhalten und den Wärmeverlust der Maus zu reduzieren.
2. Tief anästhesieren die Maus mit Isofluran. Passen Sie dazu zunächst den Sauerstoffdurchflussmesser auf ca. 1,5 l/min an, und stellen Sie dann den Isofluran-Verdampfer auf ca. 3-5% für die Induktion und ca. 1-3% für die Wartung ein.
   1. Um sicherzustellen, dass das Tier vollständig bewusstlos ist, kneifen Sie die Pfote der Maus; das Tier richtig beästhetisiert wird, wenn die zuckende Reaktion auf Kneifen fehlt.
3. Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen, um die Stabilität der Körpertemperatur der Maus zu erhalten.
4. Rasieren Sie die Oberseite des Kopfes und fixieren Sie den Kopf der Maus auf den stereotaxic Rahmen. Dann tragen Sie okuläreschutzige Schmiermittel auf die Augen, reinigen Sie die Oberfläche durch Schrubben mit Povidon-Jod und 70% Ethanol, und setzen Sie den Schädel mit einem sterilen Skalpell aus.
5. Kalibrieren Sie den Rahmen auf den Bregma-Punkt, und bohren Sie dann auf eine medial-laterale Koordinate von 2,9 mm und eine vordere-hintere Koordinate -2,7 mm, um den Hippocampus anzugreifen.
   HINWEIS: Wenn ein anderes Gehirnziel injiziert werden muss, bestimmen Sie die gewünschten Injektionskoordinaten mit dem Paxinos- und Franklin-Mausatlas¹⁶.
6. Sobald das Gehirn exponiert ist, injizieren Sie einseitig 90 nL des AAV in der dorsal-ventralen Tiefe von -3,0 mm im Hippocampus mit einem Mikroinjektor und gezogenen Mikrokapillarpipetten (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Siehe Materialtabelle für den in diesem Experiment verwendeten Titer von AAV. Passen Sie für andere Gehirnbereiche das AAV-Injektionsvolumen nach Bedarf an.
7. Am Ende des chirurgischen Eingriffs den Schnitt mit Nylonnähten schließen und topische Antibiotika auf die Wundstelle auftragen.
8. Analgetika (Buprenorphin, 0,1 mg/kg) sofort nach der Operation und 4-6 Stunden nach der Operation systemisch verabreichen.
9. Beginnend 4 Wochen nach der Injektion, unterwerfen Mäuse eines der im folgenden Abschnitt beschriebenen Paradigmen, um Neuronen, die den Erregerrezeptor des Designers exzessieren, chronisch zu kontrollieren.

2. Repetitive CNO-Lieferung mit Augentropfen

1. Akklimatisieren Sie die Tiere mit der Handhabung durch Scruffing jede Maus 3 min täglich für 3-4 Tage vor der Verabreichung von Augentropfen.
2. Clozapin-N-oxid (CNO, 5 mg) in 1 ml steriler 0,9%iger Salinelösung auflösen (Lagerlösung: 5 mg CNO/ml). Halten Sie die Lösung bei 4 °C gekühlt.
3. Wägen Sie jede Maus, bevor Sie mit dem Experiment beginnen, um die Menge an Zuliefern von CNO zu bestimmen. Verwenden Sie 1-3 l Tropfen (pro Auge), um 1,0 mg CNO / kg Körpergewicht zu erreichen.
   HINWEIS: Als Beispiel sollte eine 20 g Maus bilaterale (jeweils 2 l) Augentropfen erhalten.
4. Geben Sie die Augentropfen während der inaktiven (Licht-)Phase von Mäusen, 2 h, bevor die Lichter ausschalten(ZeitgeberZeit (ZT) 10). In Fällen, in denen CNO während der aktiven (dunklen) Phase von Mäusen abgegeben werden muss, stellen Sie sicher, dass dunkles rotes Licht für eine ordnungsgemäße Behandlung von Tieren auftritt.
   HINWEIS: Es sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um zu vermeiden, dass der zirkadiane (und helle/dunkle) Zyklus von Versuchstieren gestört wird.
   1. Laden Sie mit einer P10-Mikropipette die erforderliche Menge (1-3 l) CNO-Lösung, um 1,0 mg CNO/kg zu erreichen.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine neue und sterile Pipettenspitze für jeden Augentropfen. In dieser Reihe von Experimenten wurden bilaterale Augentropfen von CNO durchgeführt; Wenn jedoch eine niedrigere CNO-Konzentration erforderlich ist, könnten auch einseitige Augentropfen angewendet werden.
   2. Immobilisieren Sie die Maus über scruff.
   3. Die Lösung langsam vertreiben, bis sich ein stabiles Tröpfchen an der Pipettenspitze bildet.
   4. Bringen Sie das Tröpfchen vorsichtig in die Nähe der Hornhaut des Mausauges, bis die Lösung geliefert wird. Die Pipettenspitze sollte niemals das Mausauge kontaktieren.
   5. Lassen Sie die Maus los und legen Sie sie wieder in ihren Heimischenkäfig.
5. Wiederholen Sie diesen Vorgang jeden Tag für 5 Tage.
   HINWEIS: Diese Dauer kann entsprechend den experimentellen Anforderungen angepasst werden.
6. Für Kontrollexperimente verwenden Sie AAV/DREADD-injizierte Mäuse, die einer Scheinbehandlung unterzogen wurden (Augentropfen, die nur eine Salinlösung enthalten), und Mäuse, die mit einem leeren Vektor (z. B. AAV/mCherry) injiziert wurden, die dem beschriebenen CNO-Augentropfenprotokoll ausgesetzt sind.

3. Chronische CNO-Behandlung durch Trinkwasser

1. Machen Sie kleine Flaschen mit 50 ml (Kunststoff) konischen Rohren und Gummistopfen aus; Abdeckung mit Aluminiumfolie, um lichtvermittelte Effekte auf die CNO-Stabilität zu vermeiden.
2. Ersetzen Sie drei Tage vor Beginn der CNO-Behandlung normale Wasserflaschen durch kleine Flaschen, die 10 ml normales Wasser enthalten, damit sich Mäuse an sie akklimatisieren können. Befestibe die Flaschen mit Klebeband an den Käfigen.
3. Messen Sie den täglichen Wasserverbrauch für jede Maus.
4. Wägen Sie jede Maus, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
5. Clozapin-N-oxid (CNO, 5 mg) in 1 ml 0,9% steriler Salinelösung auflösen. Kühlen Sie die Lagerlösung bei 4 °C.
6. Verwenden Sie das Körpergewicht und die durchschnittliche Menge an Wasser verbraucht, um die Konzentration der CNO-Lösung zu definieren, um 1,0 mg CNO / kg (Körpergewicht) zu erreichen.
   HINWEIS: Erwachsene männliche Mäuse (ca. 20 g Körpergewicht) verbrauchen 5 ml Wasser pro Tag (Abbildung2A). Um eine CNO-Konzentration von 1 mg CNO/kg zu erreichen, sollte daher eine CNO-Stammlösung von 6,4 l zu einem Endvolumen von 8 ml Wasser (Endkonzentration: 4 g CNO/ml) hinzugefügt werden. So ergibt die Dosis CNO für ein 20 g Tier, das 5 ml Wasser pro Tag trinkt, 1 mg CNO/kg.
7. Bestimmen Sie die optimale CNO-Dosis, die die maximale Wirksamkeit bei minimaler CNO-Konzentration anzeigt, indem Sie eine Reihe von Konzentrationen testen. Führen Sie eine Dosis-Wirkungs-Analyse durch, um die optimale CNO-Dosis für die Trinkwassermethode zu bestimmen.
   HINWEIS: Für dieses Experiment wurden folgende CNO-Dosen getestet: 1,0 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,1 mg/ml und Saline. 1,0 mg CNO/kg wurde zuerst getestet, basierend auf i.p.- und Augentropfenprotokollen.
8. Füllen Sie die Flasche am 1. Tag mit 8 ml normalem Wasser und fügen Sie die erforderliche Menge CNO hinzu.
   HINWEIS: Diese Menge Wasser ist genug für 24 h ad libitum WasserZugang für eine erwachsene männliche Maus. Wenn andere Nagetierarten verwendet werden, messen Sie zuerst die Menge des täglich verbrauchten Wassers, um das benötigte Volumen zu bestimmen.
9. Überwachen Sie den Zustand der Tiere während des gesamten Protokolls, um sicherzustellen, dass es keine Nebenwirkungen gibt, die durch Wasser + CNO-Verbrauch verursacht werden.
10. Nach 24 h die Flaschen durch Frischwasser + CNO-Lösung ersetzen. Zeichnen Sie das am Vortag verbrauchte Volumen auf.
11. Entsorgen Sie die Wasser+ CNO-Lösung, die nicht in Abfallbehältern verbraucht wurde. Entsorgen Sie Plastikflaschen und ersetzen Sie die Gummistopfen jeden Tag, nachdem sie gemäß den Richtlinien der Tieranlage desinsäuert wurden.
    HINWEIS: Mischen Sie wässrige Abfälle nicht mit organischen Lösungsmitteln. Wenden Sie sich an den Chemical Disposal Service, um Anweisungen für die Lagerung und Abholung zu erhalten.
12. Ersetzen Sie die Flaschen jeden Tag für 5 Tage zur gleichen Zeit.
    HINWEIS: Diese Dauer kann entsprechend den experimentellen Anforderungen angepasst werden.
13. Schließen Sie Kontrollgruppen ein, wie in Schritt 2.6 beschrieben.

4. Eingeschränkte CNO-Behandlung mit Mäusen, die Saccharose bevorzugt

1. 3 Tage vor Beginn der CNO-Behandlung eine kleine Flasche mit 10 ml Wasser + 1% Saccharose auf den Käfig legen, vorzugsweise weg von der ursprünglichen Wasserflasche.
   HINWEIS: Verwenden Sie dieselben kleinen Flaschen, die in Schritt 3.1 beschrieben sind.
2. Setzen Sie Tiere während des letzten Teils ihrer aktiven Phase dem Wasser aus + 1% Saccharose aus (ZT 18 – 24). Nach dieser Belichtung die Flasche mit Wasser + Saccharose aus dem Käfig entfernen.
   HINWEIS: Es können verschiedene Zeitfenster der CNO-Lieferung verwendet werden. Darüber hinaus könnten Mäuse unter einen invertierten Hell-Dunkel-Zyklus gestellt werden, bei dem das Licht in den Abendstunden eintritt, um die CNO-Lieferung zu erleichtern.
3. Messen Sie den täglichen Wasser + 1% Saccharoseverbrauch für jede Maus.
4. Wägen Sie jede Maus, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
5. Verwenden Sie das Körpergewicht und die durchschnittliche Menge an Wasser + 1% Saccharose verbraucht, um die Dosis der CNO-Lösung zu bestimmen, um 1,0 mg CNO / kg (Körpergewicht) zu erreichen.
   HINWEIS: Die optimale CNO-Dosis, die die maximale Wirksamkeit bei minimaler CNO-Konzentration anzeigt, sollte getestet werden, wie in Schritt 3.6 erläutert.
6. Füllen Sie am 1. Tag Flaschen mit 5 ml Wasser + 1% Saccharose + CNO (1 mg CNO/ Kg) und legen Sie sie während des festgelegten Zeitfensters auf den Käfig (immer am gleichen Ort).
7. Am Ende des zeitbeschränkten Zeitfensters die Flaschen entfernen und die Menge an Wasser + Saccharose + CNO verbrauchen messen.
   HINWEIS: Materialien und Lösungen werden wie zuvor in Schritt 3.11 beschrieben desinfiziert oder verworfen.
8. Wiederholen Sie diesen Vorgang jeden Tag für 5 Tage.
   HINWEIS: Diese Dauer kann entsprechend den experimentellen Anforderungen angepasst werden.
9. Schließen Sie eine Kontrollgruppe ein, wie in Schritt 2.6 beschrieben.

5. Datenanalyse

1. Perfuse Mäuse intrakardinativ mit 4% Paraformaldehyd (PFA) entweder 2 oder 6 h nach Erhalt der letzten repetitiven (5. Tag) CNO Augentropfen. Wenn CNO durch Trinkwasser geliefert wird, ersetzen Sie CNO + Wasser mit Wasser am Ende der aktiven Phase der Maus, und durchdringen Sie dann die Maus nach 2 oder 6 h Post-CNO-Zugriff.
   HINWEIS: Wenn die Lichtexposition die c-Fos-Induktion im Interessenbereich beeinträchtigen könnte, halten Sie Mäuse am letzten Tag der Experimente und vor der Perfusion in ständiger Dunkelheit.
2. Sezieren Sie das Gehirn vorsichtig aus und tauchen Sie in 4% PFA-Lösung für 9-12h.
3. Nach der PFA-Fixierung, kryoprotect das Gehirngewebe mit einer 30% Saccharose-Lösung (warten, bis das Gehirn sinkt), dann abschnitt das Gehirn mit einem Kryostat.
4. Übertragen Sie die koronalen Hirnabschnitte (35 m) in eine Lösung, die 1x PBS, 10% Rinderserumalbumin und 0,3% Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur enthält.
5. Inkubieren Sie die Hirnabschnitte mit einer Anti-c-Fos (1:2500) Antikörperlösung bei 4 °C über Nacht bei ständiger Rührung.
6. Nach 3 Waschungen von jeweils 5 min mit einer Lösung, die 1x PBS und 0,3% Triton X-100 enthält, inkubieren Sie die Proben mit einem Alexa-konjugierten Sekundärantikörper (1:500) für 1 h bei Raumtemperatur weg vom Licht und mit konstanter Rührung.
7. Erhalten Sie digitale Bilder mit einem konfokalen Mikroskop. Zusammenstellen und verarbeiten Sie aufgenommene Bilder mit einer Fotobearbeitungs- und Analysesoftware (z. B. Adobe Photoshop).
8. Um die AAV-infizierten Flächen (mCherry(+)-Zellen mithilfe der ImageJ-Software zu analysieren und zu messen, und quantifizieren Sie für die Datenanalyse die Anzahl der c-Fos(+)-Zellen innerhalb dieses Bereichs, um die Anzahl der aktivierten Zellen pro Fläche zu erhalten. Kombinieren Sie die Ergebnisse aus 3 separaten Abschnitten pro Tier.

Ergebnisse

Wir beobachteten, dass eine wiederholte CNO-Lieferung mit Augentropfen eine robuste Induktion der c-Fos-Expression in den meisten infizierten Neuronen hervorrief (Abbildung 1C), was zeigt, dass die Wirksamkeit der CNO-Bereitstellung während der wiederholten Exposition aufrechterhalten wird. Darüber hinaus wurde eine signifikante Induktion von c-Fos in Proben beobachtet, die 2 h nach der CNO-Behandlung entnommen wurden, verglichen mit Proben, die 6 h nach CNO-Exposition(Abbildungen ...

Diskussion

DREADDs haben sich als ein beliebter und effektiver Ansatzzur Fernmanipulation neuronaler Aktivität 17 herauskristallisiert. Die Entwicklung alternativer Strategien für die CNO-Bereitstellung wird das Spektrum der verfügbaren Optionen für spezifische experimentelle Einstellungen weitgehend erweitern. Darüber hinaus minimieren nicht-invasive Strategien für die Bereitstellung von CNO mögliche Fehlinterpretationen von Ergebnissen, indem sie nebenwirkungen, die sich direkt auf die Gesundheit de...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Sigma life science	#A2153-100G	Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis)
C57BL/6J mice	The Jackson laboratory	#000664	male mice, 3 months old
Capillaries	Drummond Scientific Company	#3-000-203-G/X	Outer diameter: 1.14 inch
Clozapine-N-oxide	Sigma	#C0832	5 mg
Forane	Baxter	#NDC 10019-360-60	Isoflurane, USP
Microinjector III	Drummond Scientific Company	#3-000-207	Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector
Mounting media	Invitrogen	#P36930	Prolong Gold antifade reagent
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	#15710	16% aqueous solution (methanol free), 10 mL
Primary c-Fos Antibody	Cell signaling technology	#2250S	c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL)
rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry	UNC Vector Core		Titer: ~3 x 1012 vg/mL
rAAV5/hSyn-mCherry	UNC Vector Core		Titer: ~3x10e12 vg/mL
Secondary Antibody	Invitrogen	#A21206	Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml
Triton X-100	americanbio.com	#AB02025-00100