サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

要約

細菌の適合性を決定するためのこの分子ベースのアプローチは、デジタルPCRを介して定量化されたユニークなゲノムDNAバーコードを使用して微生物の正確かつ正確な検出を容易にします。プロトコルは、サルモネラ株の競争力指数の計算について説明します。しかし、この技術は、遺伝的に可鍛性の生物の絶対的な定量を必要とするプロトコルに容易に適応可能である。

要約

競争力のある指標は、細菌の適合性および/またはウイルス性を評価するために使用される一般的な方法です。このアプローチの有用性は、野生型生物に多くの株の適合性を標準化するその容易さと能力によって例示される。しかし、この技術は、利用可能なプチピックマーカーと同時に評価できる株の数によって制限され、多数の反復実験の必要性を生み出す。多数の実験と並行して、フェノティピックマーカーに基づいて細菌を定量するための労力および材料コストは重要ではない。これらの負の側面を克服しつつ、細菌染色体に遺伝子マーカーをエンジニアリングした後、微生物を直接定量化する分子ベースのアプローチを開発しました。ユニークな、25塩基対DNAバーコードは、サルモネラ菌の野生型および変異株の染色体上の無害な遺伝子座に挿入された。インビトロ競技実験は、プールされた株からなるイノキュラを用いて行った。競争の後、各株の絶対数はデジタルPCRを使用して定量化され、各株の競合指数はそれらの値から計算された。我々のデータは、サルモネラ菌を定量化するこのアプローチは、非常に豊富な(高い適合性)微生物と希少な(低フィットネス)微生物の両方を検出するための非常に敏感で正確で正確であることを示しています。さらに、この技術は、改変が可能な染色体を持つほぼすべての生物や、微生物の絶対定量を必要とする様々な実験計画に容易に適応可能です。

概要

病原性生物の適合性とウイルス性を評価することは、微生物学研究の基本的な側面である。これは、株間または変異生物間の比較を可能にし、研究者が特定の条件下で特定の遺伝子の重要性を決定することを可能にします。伝統的に、ウイルス評価は、異なる細菌株を使用して感染の動物モデルを利用し、感染した動物の結果を観察する(例えば、感染性線_量50、致死用量50、死亡時間、症状重症度、欠如症状など)。この手順は、ウイルスの貴重な説明を提供しますが、野生のタイプからの変化を検出するために結果にかなりの違いを引き起こす株が必要です。さらに、疾患の進行と症状の重症度は時間の経過とともに主観的に定量化することができるが、野生型に比べてウイルスの解釈はより質的である(すなわち、より多く、より少ない、または同様に悪性である)ので、結果は半定量的である。動物感染性アッセイを行う一般的な代替手段は、競合指数(CI)を生成する、混合感染1における野生型の対応する株の適合性またはウイルス性を直接比較する値を生成する。この技術は、野生型株に対するウイルス性を標準化し、減衰の程度を反映する定量化可能な値を決定することにより、感染の従来の動物モデルに対して多くの利点を有する。この技術はまた、取り消された競争指数(COI)2を決定することにより、細菌における遺伝子相互作用を分析するために適応することができる。変異した生物のグループのCOIを計算することで、研究者は2つの遺伝子が独立して病因に寄与しているのか、それとも同じウイルス経路に関与し、互いに依存しているのかを判断することができます。さらに、CIを計算するには、生物の病因に関する貴重な洞察を提供できる細菌の列挙が必要です。また、CIとCOIは、臨床疾患を引き起こさないが、まだフィットネスの違いを持っているアビリント株をアセスすることを可能にします。この技術は、株を同定するために従来の抗生物質耐性マーカーを使用することによって制限され、それによって入力株の数を一度に1つまたは2つだけに制限する。この制限により、大量の実験グループと反復が必要となり、人件費や材料費の増大に加えて、実験条件の変動や不正確な結果の機会も増加します。(ウイルス、フィットネス、遺伝子相互作用を研究するために混合感染症を使用することの利点とアプリケーションの徹底的なレビューについては、C.R.BeuzónとD.W.ホールデン1を参照してください)

フローサイトメトリー3、4、5を介して定量した蛍光標識細胞の使用など、この限界を克服する試みがなされている。この技術は、1)標識抗体をプノーティピックマーカーまたは2)内因性に産生した蛍光タンパク質を用いて細胞を定量する。標識抗体の使用は、1,000細胞/mLの検出の限界を有するため、3を分析するために多数の細胞を必要とする。蛍光タンパク質を発現する細胞は生理学を変化させ、高タンパク質発現に起因するフィットネス変化の影響を受けやすい6.いずれの方法も、フローサイトメトリーを用いて検出可能な蛍光マーカーの数によって制限される。分子定量の進歩は、マウス^モデル7における1,000株以上の初期混合感染から120株の減衰を検出するマイクロアレイ技術の開発によって達成された。この技術は、変異株からのRNAのマイクロアレイ分析を利用し、結果にかなりのばらつきをもたらす。 それにもかかわらず、混合感染症の大きなプールは有用なツールであり、敏感な検出技術を利用することによって、細菌のウイルス性の違いを同定できることを確立しました。次世代シーケンシングの開発により、Tn-seqはトランスポゾン変異の有用性を拡大し、ランダムに変異した細菌を定量する強力な方法^を可能にし、8、9、10、 ¹¹.トランスポゾンの必要性を排除し、代わりにDNAバーコードを使用してゲノムの変化と^{フィットネス12}への影響をより簡単に特定および追跡する代替プロトコルが最近開発されました。この技術は大きな進歩ですが、ゲノムバーコードの挿入はまだランダムなプロセスです。これまでの実験のランダム性を克服するために、ユンらは^細菌13の染色体上の正確な位置に挿入されたユニークなDNAバーコードを用いてサルモネラ菌株のCIを計算する方法を開発した。ユニークなバーコード株は、各一意のバーコードに固有のSYBRグリーンおよびプライマーを用いたqPCRベースの方法を用いて検出された。この技術は、プライマー効率の違いや感度の低さなど、qPCRによって課される制約によって制限され、qPCRの前に入れ子になったPCRの必要性が証明された。それにもかかわらず、このアプローチは、標的ゲノム修飾が複数の細菌株のプールを検出し、潜在的に定量化するために利用できることを実証した。

以下のプロトコルでは、高感度なデジタルPCR技術を用いて正確な定量を行い、混合無分病の大きなプールで細菌競合実験を行う新しい方法論を説明する。このプロトコルは、染色体の無害な領域に挿入されたユニークなDNAバーコードを用いた細菌株を遺伝的に標識することを含む。この改変により、従来のシリアル希釈、レプリカめっき、および表現力マーカーに依存するコロニー形成ユニット(すなわち抗生物質耐性)の代わりに、現代の分子技術を使用して迅速かつ正確に定量することができます。).この修飾により、単一のプールされた接種における多くの株の同時評価が可能であり、すべての株が全く同じ条件にさらされるため、実験的変動の可能性を実質的に減少させる。さらに、この技術はサルモネラ・エンテリカ・セロバー・タイフィムリウムで開発されましたが、遺伝的に可鍛性の高い生物や、正確な細菌数が必要なほぼすべての実験計画に非常に適応性が高く、新しい以前の方法によって課された制約なしで微生物学の実験室の正確さおよび効率を高めるための用具。

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プロトコル

1. アレリック交換に必要な成分を含むプラスミドに独自のDNAバーコードを組み込む

注:pSKAPという名前の新しいプラスミドは、既存のpKD13アリル交換プラスミドと比較してコピー数が多く、変換効率が向上しました。これは手順 1.1~1.12 (図1) で説明します。ユニークなDNAバーコードとアレル交換のための成分を含む確定プラスミドは、プラスミドリポジトリ(材料の表)を介して利用可能です。

1. 市販のプラスミドミニプレップキットを使用して、ルリア・ベルタニ(LB)で栽培された一晩の細菌培養物からpKD13¹⁴およびpPCRスクリプトカムSK⁺を精製し、50μg/mLカナマイシンまたは25μg/mLクロラムフェニコール(pKD13およびpPCRスクリプトカム用)SK+(それぞれ) (表1)
2. 製造元の仕様に従って、市販の制限酵素HindIIIとBamHIを使用して、両方のプラスミドに対して制限消化を行います。
3. pPCRスクリプトカムSK+反応から制限酵素および切除DNAを除去し、メーカーの仕様に従って市販のDNAクリーンアップキットを使用して3,370塩基対(bp)プラスミドバックボーンを精製します。
4. 電気泳動室を使用して1%アガロースゲルのpKD13制限消化から断片を分離します。
5. 青色光トランジルミネーションを用いてバンドを可視化し、ゲルから1,333 bpフラグメントを取り除きます(図1C)。
   注:この断片には、染色体アレリン置換に必要なFRTフランクカナマイシン耐性遺伝子が含まれています。
6. 市販のゲル抽出キットを使用して、ステップ1.5から取り除かれたDNAを精製します。
7. pSKAPを作成するには、pKD13(ステップ1.6から)からpPCRスクリプトカムSK+(ステップ1.3から)に精製された断片を、製造元の仕様に従って市販のT4 DNAリガーゼを使用してリゲートします。
8. 化学的に有能なDH5α細胞を、製造業者のプロトコルに従ってリゲテッドpSKAPプラスミドで形質転換する(表1)。
9. LB寒天プレートに転向した形質転換剤を50μg/mLカナマイシンで補い、一晩37°Cでインキュベートする。
10. プレートからコロニーを選び、50 μg/mLカナマイシンを補充した新しいLB寒天プレートにストリークし、一晩37°Cでインキュベートします。このプレートからコロニーを選び、50 μg/mLカナマイシンを補充したLBスープを接種するために使用します。一定の攪拌で37°Cで一晩培養します。
11. 市販のプラスミドミニプレップキットを使用して、一晩の細菌培養からpSKAPを精製します。
12. メーカーの仕様に従って、ヒンドIIIとBam HIを使用してステップ1.11からプラスミドの診断制限消化を行います。ステップ1.4-1.5のように1%アガロースゲルの断片を視覚化します。
    注:pSKAP の合計サイズは、ステップ 1.12 の後のフラグメントは 4,703 bp. 3,370 および 1,333 bp である必要があります。
13. pSKAPの位置725にユニークな25塩基対DNA配列を挿入するような方法で挿入部位指向変異体(SDM)(表2およびS1)のためのPCRプライマーを設計する(図2)。
    注:バーコードDNAはFRTフランクカナマイシン耐性遺伝子のすぐ外側のプラスミドに挿入され、その後のカナマイシン耐性カセットの除去時にバーコードが失われることはありません。新しいバーコード配列を生成する場合は、オンラインツールを使用して、蛍光標識された標的特異的PCRプローブ(以下、単に「プローブ」と呼ばれる)が新しい配列に効率的に結合することを保証します。現在までに設計された挿入シーケンスと、それらを作成するために必要なプライマーと共に、表 2およびS1に記載されています。
14. 市販の高忠実度DNAポリメラーゼ、所望のプライマーペア(表2)、およびpSKAPテンプレートを用いてSDM反応を調製する。サーモサイクラーを設定して、1) 98 °C を 30 s、2) 98 °C を 10 s、56 °C (15 s)、72 °C (2 分) 繰り返しステップ 2、24 回、4) 72 °C を 5 分間、5 分間保持します。
15. PCRの完了後、反応に制限酵素DpnIを添加してpSKAPテンプレートを枯渇させる。37 °Cで20分間インキュベートします。
    注:PCRの製品をアガロースゲル上で可視化し、製品の大きさと純度を確認する必要があります。未改変されたpSKAPテンプレートからなるコントロールDpn I消化を実行し、テンプレートDNAが完全に消化されるように、後続の手順で使用することができます。
16. 工程1.15から製品の5 μLを使用して、メーカーの推奨に従って、市販の化学的に有能なDH5α細胞の100 μLを変換します。
17. LB寒天プレートに形質転換剤を25μg/mLクロラムフェニコールを添加し、一晩37°Cでインキュベートする。
18. 一晩プレートからコロニー(またはコロニー)を選択し、25 μg/mLクロラムフェニコールを補充した個々のLB寒天プレートにストリークし、一晩37°Cでインキュベートします。一晩プレートからコロニーを選択し、25 μg/mLクロラムフェニコールを補充したLBスープの5 mLを接種するために使用します。一定の撹拌で37°Cで一晩培養する。
19. 市販のプラスミドミニプレップキットを使用して、一晩培養物からプラスミドを精製します。
20. M13フォワードシーケンシングプライマー(表2)を用いてサンガー配列精製プラスミド。変異した領域を元のプラスミドと比較し、SDM挿入精度を評価します。
21. バーコードの挿入と精度を確認した後、各バーコードとプラスミドに名前を割り当てます。
    注:現在までに生成されたバーコードには、AA、AB、AC、...、BA、BB、BCなどの2文字の指定が割り当てられています。バーコードプラスミドは、pSKAP_AA、pSKAP_AB、pSKAP_AC、...、pSKAP_BA、pSKAP_BB、pSKAP_BCなどとして表されます。
22. 手順 1.14-1.21 を繰り返し、所望の数の DNA バーコードを生成します。

2. Sの染色体にDNAバーコードを導入する。ティフィムリウム

注:DNAバーコードをSに挿入する。タイフィムリウム染色体は、Sで使用するために改変されたダッセンコおよびワ^ナー14によって記述されたアリル交換法を用いて達成される。ティフィムリウム

1. Sの軌跡を決定します。DNAバーコードを挿入するチフィムリウムゲノム(図3)。
   注:染色体の大きな、相互領域を選択します。非コーディング RNA を生成する領域は避けてください。本研究は、残基1,213,840と1,213,861(ゲノムアセンブリGCA_000022165.1から決定)の間に入れPの下流に置かれた遺伝子を利用した。この領域は、以前に^遺伝子15のトランス補体のために遺伝的に操作されている。あるいは、目的の遺伝子を破壊しながらDNAバーコードを導入することもできる。これを行うには、このプロトコルへの最小限の変更が必要になり、ミュータントの作成が合理化されます。
2. ステップ1.21(表2)から所望のpSKAPバーコード含有プラスミドからユニークなバーコードおよびFRTフランクカナマイシン耐性遺伝子を増幅するPCRプライマーを設計する。ステップ 2.1 で選択した領域に相同である 40-ヌクレオチド拡張を各プライマーの 5' 末端に追加します (表2)。
3. 市販の高忠実度ポリメラーゼ、ステップ2.2からのプライマー、および所望のpSKAPバーコード含有プラスミドをテンプレートとして用いて増幅を行う。サーモサイクラーを設定して、1) 98 °C を 30 s、2) 98 °C を 10 s、3) 56 °C (15 s 用、4) 72 °C 60 s、繰り返しステップ 2-4 29 回、5 分間 72 °C、6) 4 °C で保持します。
4. PCRの完了後、ステップ1.15で説明するようにDpnIを用いてテンプレートDNAを枯渇させる。製造元の仕様に従って市販のDNAクリーンアップキットを使用してDNAを精製し、濃縮します。
5. Sで変異体を生成するための以前に公開されたプロトコルを参照してください。PCR製品14、16、17、18からタイプムリウム株14028s。
   注:カナマイシン耐性遺伝子が染色体から取り除かれては必須ではない。しかし、遺伝子の切除は、潜在的な下流遺伝子をフレーム内に残す129 bpの瘢痕をもたらすので、細菌染色体に最小限の破壊をもたらす。カナマイシン耐性遺伝子を含む株は、P22媒介トランスダクションを介して株間バーコードを移動するために使用することができるので保持することをお勧めします。
6. 手順 2.3 ~ 2.5 を繰り返し、適切なバーコードで目的のひずみを作成します。
   注:バーコードはワイルドタイプSに導入できます。その後、さらなる遺伝子操作を受けることができるタイプムリウム、またはバーコードは、以前に遺伝子改変された株に導入することができる。

3. 細菌の成長条件とインビトロコンペティションアッセイ

1. 細菌ストックから、ストリーク所望のS.それぞれがLB寒天プレート上にユニークなDNAバーコードを持つタイプムリウム株。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
2. 各株から単一のコロニーを選択し、LBスープの5 mLを接種します。一定の撹拌で37°Cで20時間インキュベートします。
   注:一晩培養を使用して、ステップ3.5に進み、各バーコード株から純粋なゲノムDNA(gDNA)を収集する。これは、セクション 6 の後続の検証および制御実験に必要です。
3. 各競技アッセイについて、各一晩培養量を適切なサイズの無菌チューブに転送します。少なくとも5秒間激しく渦を混ぜることによって、株を完全に混ぜます。
   注:転送する各一晩培養の量は、各条件および反復に対して十分であり、また、入力を定量化するためにgDNAを分離するために十分である必要があります。入力微生物の絶対数はデジタルPCRを使用して定量されるため、培養物の光学密度を測定する必要は完全ではありませんが、各菌株の入力細菌数は、ボトルネックを回避するためにほぼ等しくする必要があります。実験の早い段階で不平等な競争をした。このプロトコルにおける代表的な競争アッセイは、8株の成長率を同時に比較した。個々の実験計画には、追加または少ない株が必要な場合があります。
4. 混合イヌキュラムの100 μLを4.9 mL無菌LBブロスに移す。所望の時間または所望の光学密度のために37 °Cでインキュベートする。
5. 遠心分離による接種の500 μLを1分間>12,000 x gで収穫し、上清を取り除いて廃棄する。セルを使用してセクション 4 に直ちに進みます。
6. 所望の時点で、培養物の500 μLアリコートを取り出し、1分間>12,000 x gで遠心分離により細胞を収穫します。
   注:アリコートを複数のタイムポイントで収集する場合は、-20 °Cでペレットを凍結するか、各収集後すぐにステップ4.1に進みます。

4. Sから gDNA を収集および定量する。タイフィムリウム (ステップ 3.5 および 3.6 から)

1. 市販のgDNA精製キットを用いて細胞からgDNAを収穫する。使用可能な場合は、オプションの RNA 枯渇ステップを実行します。
   注:RNA の枯渇は必要ありません。しかし、RNAの存在は人工的にDNA濃度を増加させ、その後のステップで異常な計算につながります。市販のgDNA精製キットを使用する場合は、製造元の推奨事項に従って、カラムにDNAが過負荷にならないようにしてください。サンプルが後続のステップで定量可能である場合、必要な最小DNA濃度はありません。
2. 分光光度計を使用して、各サンプルのDNAを定量します。
   注:DNAは、任意の信頼性の高い方法を使用して定量することができる。
3. 次の式を使用して細菌ゲノムサイズに基づいてgDNAコピー数を計算します:XはngのDNAの量であり、Nは二本鎖DNA分子の長さ(ゲノムサイズ)です。
   
   注:660g/モルは、1 DNA bpの平均質量として使用され、生物のヌクレオチド組成に応じて小さな変動が存在してもよい。計算を実行するために、多数の電卓がオンラインで利用可能です。

5. dDigital PCRによるDNAバーコードの定量的検出のためのプライマーとプローブの設計

1. Sのバーコード領域を増幅するプライマーを設計します。putPの下流のチフィムリウム染色体(図3Cおよび表2)。
   注:プライマーとプローブの設計は、多数のオンラインプログラム(材料の表)によって促進することができます。バーコードがすべて同じ遺伝子座に挿入されている場合、増幅プライマーの単一のセットはすべてのバーコードに対して普遍的です。
2. 各バーコードに固有の6-カルボキシフルオレセイン(FAM)ベースおよび/またはヘキサクロロフルオレセイン(HEX)ベースのプローブを設計します(表2およびS1)。
   注:この実験で使用される液滴リーダーは、多重反応でFAMおよびHEXベースのプローブの両方を同時に検出することができる。FAMを利用するプローブの1/2を設計し、HEXを利用する場合は1/2を設計します。これは必要なステップではありませんが、実装すれば試薬の使用と実験コストを削減できます。
3. 各前方および逆増幅プライマーの20 mM、2)単一のFAMプローブの10 mM、および3)単一のHEXプローブの10 mM(多重化の場合)を含む20倍プライマープローブマスターミックスを作成します。

6. デジタルPCRを使用して、各ゲノムバーコードの各Pprimerプローブセットの感度と特異性を検証する

注:このプロトコルでは、例として 8 つの一意のプローブを使用して 8 つの一意のバーコードを検証します。使用されるバーコードの数は、さまざまな実験設計に対応するために増減することができる。

1. 1 つを除くすべてのバーコードを含む gDNA のプールを作成します。このプールを希釈剤として使用して、残りのバーコードを含むgDNAを含む希釈系列を実行します(サンプル希釈スキームは図4に示されています)。
   注:プールされたgDNAを希釈剤として使用すると、感度を確認しながら一貫した背景を確保できます。ステップ 4.3 で決定したコピー番号を使用して、推奨されるデジタル PCR 範囲内のコピー番号に gDNA を希釈します (20 μL 反応あたり 1-100,000 コピー)。範囲は、gDNAの合計ではなく、一意のターゲット(バーコード)ごとに設定されます。
2. プローブベースの化学用に設計されたデジタルPCRスーパーミックスを使用するためのメーカーの推奨事項に従って、重複してデジタルPCRの反応を準備します。ステップ 6.1 の混合物をテンプレート DNA として使用します。ステップ 6.1 で希釈バーコードのプローブを含むステップ 5.3 の 20x プライマー プローブ マスター ミックスを使用します。
3. プローブベースの化学用に設計されたデジタルPCRスーパーミックスを使用するためのメーカーの推奨事項に従って、デジタルPCRの反復制御反応を準備します。各プローブミックスの制御反応は、1)テンプレートコントロール(NTC)、2)負のコントロール、および3)正のコントロールで構成されなければなりません。
   注:反復対照反応の最小数は2です。この例のプロトコルでは、各バーコードに対して 4 つの NTC、6 つの負のコントロール、および 6 つの正のコントロールを使用します。負のコントロールには、テスト対象のプローブに対応するバーコードを除き、各バーコードに gDNA を含める必要があります。これにより、各プローブの特異性が検証されます。
4. 手順 6.1-6.3 を繰り返し、バーコードされた gDNA サンプルごとにデジタル PCR 反応を作成します。サンプルプレートの配置を図5に示します。
   注:この手順とその後の手順は、液滴とフローベースの技術を利用する特定のデジタル PCR プラットフォームに基づいて説明されます。チップベースの技術を利用する代替デジタルPCRプラットフォームは、このプロトコルにわずかな変更を加えて簡単に置き換えることができます。ステップ 6.4 では、すべてのプライマー セットを検証するために、複数の 96 ウェル プレートが必要になる場合があります。qPCRとは対照的に、デジタルPCRによって分析された別々のプレートは、プレート間の標準化された参照ウェルを必要とせずに容易に比較することができる。
5. 製造元の指示に従って液滴発生器を使用して、各反応条件の液滴を生成します。
6. 新しく作成した液滴を適切な96ウェルプレートに移します。5-50 μL マルチチャンネルピペットに 200 μL ピペット チップを使用します。
   注:液滴をピペットにすると、ピペットがゆっくりとスムーズに!デジタル PCR 機器の製造元では、特定の製造元 (Ranin など) のピペットとピペット チップのみを使用することをお勧めします。これらのピペットの先端に液滴を破壊したり、液滴の読者のマイクロ流体を損傷させることができる顕微鏡のプラスチック断片なしで滑らかな開口部を持っています。数多くのブランドのヒントが調べられ、製造品質のスペクトルを持つことが観察されました。同等の結果は、ピペットチップの代替を使用して達成されています;ただし、製造元の推奨事項から逸脱する場合は注意が必要です。
7. すべての液滴が生成され、転送された後、ホイルプレートシーラーでプレートをシールします。
8. 次のサイクリング条件を実行するには、メーカー推奨のサーモサイクラーを使用してください: 1) 94 °C 10分;2) 94 °C 1分、ランプレートを1 °C/sに設定。3) 55 °C 2 分、ランプレートは 1 °C/s に設定されています。4)ステップ2と3 49回を繰り返します。5) 98 °C 10分;6)24時間まで4°Cで保持します。
   注:液滴反応における熱伝達は、標準PCRと同じではない。反応条件は、修正を必要とする場合があります。
9. サーモサイクリングが行われている間、サンプル名、実験タイプ(絶対定量)、スーパーミックス使用、ターゲット1名(FAMバーコード名)、ターゲット1タイプ(NTC、陽性制御、正対照、等のプレート設定情報を含むデータ解析ソフトウェアをプログラムする)マイナスコントロール、または不明)、ターゲット2名(HEXバーコード名)、ターゲット2タイプ(ブランク、ポジティブコントロール、負の制御、または不明)。最後のプレート設定情報を図5に示します。
10. サーモサイクリングが完了したら、完了した反応を液滴リーダーに移し、製造元の指示に従って読み取りプロセスを開始します。

7. 競合指数実験における細菌数の定量化

1. 希釈gDNAをセクション4から定量し、上述したように適切な濃度に定量した。
2. 適切なスーパーミックスを使用するためのメーカーの推奨事項に従って、デジタルPCRの反応を準備します。テンプレートとしてステップ 7.1 の DNA を使用します。実験に存在する可能性のあるバーコードについては、プローブを含む20倍プライマープローブマスターミックス(FAMとHEXの両方を検出する場合はプローブ)を1つ使用します。
3. 実験設計で使用されるすべてのバーコードが検出されるまで、異なる20倍プライマープローブマスターミックスを使用して、ステップ7.2のように追加のデジタルPCR反応を準備します。
4. 6.3 で説明されているように、各条件のコントロールを含めます。これには、1) テンプレート コントロール (NTC)、2) 負のコントロール、および 3) 正のコントロールが含まれます。
5. 手順 6.5~ 6.10 に説明するように、プロトコルを続行します。

8. デジタルPCRデータを分析し、絶対コピー数を計算する

1. すべてのウェルが読み取られ、実行が完了したら、データ分析ソフトウェアを使用して .qlp データ ファイルを開きます。
   注:ここで説明するファイルの種類とデータ分析手順は、1 つのデジタル PCR 製造元に固有のものです。代替デジタル PCR プラットフォームを使用する場合、ファイルの種類とデータ分析手順は使用するプラットフォームに固有であり、製造元の推奨仕様に従って実行する必要があります。
2. 同じプライマープローブマスターミックスを使用するすべてのウェルを選択します。
3. [液滴]タブで、各ウェルで分析された液滴の数(正と負の液滴の両方)を調べます。総液滴が10,000未満の井戸を分析から除外します。
4. [1D 振幅]タブに移動し、正と負の液滴の振幅を調べます。2 つの異なる母集団で構成されていることを確認します。
5. ソフトウェア内で、しきい値機能を使用して、使用された各プローブの正と負の液滴の間のカットオフを行います (図6)。
   注:ステップ 5.3 から同じプライマー プローブ マスター ミックスを使用するすべてのウェルは、同じしきい値を持つ必要があります。
6. 適切なしきい値がすべてのウェルに適用されると、ソフトウェアは各反応のDNAコピーの数を計算します。データをスプレッドシートにエクスポートして、さらに分析を容易にします。
   注:データ分析ソフトウェアは、ポアソン分布に適合する正と負の液滴の数を使用して、コピー番号を決定します。
7. ステップ 8.6 の値を使用して、サンプル内の各固有のゲノムバーコードの初期コピー数を計算します。負の対照反応からの平均偽陽性率を決定し、実験反応で得られた値からこの値を減算します。各実験の設定時に行われた希釈に基づいて、必要に応じて値を乗算します (表3)。

9. バーコード株のデジタルPCRベースの定量からCIまたはCOIを計算することにより、生物の相対適合性を決定する

1. 次の式を使用してバーコード株のCIを計算します:_出力は、特定の時点でのバーコード株の絶対定量であり、WT_出力は同じでバーコードされた野生型細菌の絶対定量ですタイムポイント、A_入力はバーコード株の入力接種の絶対定量であり、WT_入力はバーコードされた野生型細菌の入力接種の絶対定量であり、X_出力は、すべての株の合計である同じタイムポイント、X_入力は、すべてのバーコードされた株の入力接種の合計です。

注:各数式の利点、欠点、および最も適切な使用方法については、説明を参照してください。

2. すべてのタイムポイントでバーコードされたひずみごとにステップ 9.1 を繰り返します。
3. 該当する場合は、次の式を使用してCOIを計算します:_出力は、所定の時点で変異した遺伝子Aを有するバーコード株の絶対定量であり、AB_出力はバーコード株の絶対定量です。変異遺伝子AとBを同時に持つA入力は、変異遺伝子Aを用いたバーコード株の入力接種の絶対定量であり、AB_入力は入力イヌキュラムの絶対定量である変異遺伝子AとBを持つバーコード株のB出力は、所定の時点における変異遺伝子Bを持つバーコード株の絶対定量であり、B_入力は入力の絶対定量である変異遺伝子Bを伴うバーコード株の接種

や

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結果

この方法論を使用するには、ターゲットDNAを同定するために使用される各プローブの感度と特異性を検証するために適切な制御反応が実行される必要があります。この代表的な実験では、8つの固有のDNAバーコードを同定するための8つの対応するプローブで検証した。8つのプローブはすべて、NTCと陰性対照反応の両方で偽陽性の割合が低かった(表3)。各?...

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ディスカッション

微生物を正確に定量化する能力は微生物学の研究にとって最も重要であり、初期混合集団からユニークな株を列挙する能力は、細菌。しかし、これを実現する技術は、分子生物学の近代的な発展に伴って進歩していません。Sを含む多くの細菌の染色体を容易に改変する技術である。Typhimuriumは、ほぼ二十^年14のために利用可能であったが、この能力は、ユニークなDNA?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf	22600028	Procure from any manufacturer
16 mL culture tubes	MidSci	8599	Procure from any manufacturer
5-200 μL pipette tips	RAININ	30389241	Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality
5-50 μL multichannel pipette	RAININ	17013804	Use alternative multichannel pipettes with caution
Agarose	ThermoFisher Scientific	BP160-500	Procure from any manufacturer
BLAST Analysis	NCBI	N/A	https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module	Bio Rad	1851197	Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Chemically competent DH5α	Invitrogen	18258012	Procure from any manufacturer or prepare yourself
Chloramphenicol	ThermoFisher Scientific	BP904-100	Procure from any manufacturer
Cytation5 Microplate reader	BioTek	CYT5MF	Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro)	Bio Rad	N/A	Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR 96-Well Plates	Bio Rad	12001925	Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004	Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	Bio Rad	1863024	Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator	Bio Rad	1864008	Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator	Bio Rad	1863009	Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Droplet Generation Oil for Probes	Bio Rad	1863005	Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Kanamycin	ThermoFisher Scientific	BP906-5	Procure from any manufacturer
Luria-Bertani agar	ThermoFisher Scientific	BP1425-2	Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl
Luria-Bertani broth	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio Rad	1814040	Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
PCR Tubes	Eppendorf	951010022	Procure from any manufacturer
Petri dishes	ThermoFisher Scientific	FB0875712	Procure from any manufacturer
pPCR Script Cam SK+	Stratagene/Agilent	211192	No longer available commercially
Primer/Probe Design	IDT	N/A	https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP and pSKAP_Barcodes	Addgene	Plasmid numbers 122702-122726	www.addgene.org
PX1 PCR Plate Sealer	Bio Rad	1814000	Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Generator	Bio Rad	1864002	Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Reader	Bio Rad	1864003	Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s	ATCC	ATCC 14028s	www.atcc.org
Take3 Micro-Volume Plate	BioTek	TAKE3	Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHI	ThermoFisher Scientific	FERFD0054	Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest DpnI	ThermoFisher Scientific	FERFD1704	Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest HindIII	ThermoFisher Scientific	FERFD0504	Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit	ThermoFisher Scientific	FERK0832	Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit	ThermoFisher Scientific	FERK0503	Procure from any manufacturer
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	F534L	Procure from any manufacturer
Thermo Scientific T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	FEREL0011	Procure from any manufacturer
Thermocycler	Bio Rad	1861096	Procure from any manufacturer
UVP Visi-Blue Transilluminator	ThermoFisher Scientific	UV95043301	Or other transiluminator that allows visualization of DNA
Water, Molecular Biology Grade	ThermoFisher Scientific	BP28191	Procure from any manufacturer