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Resumo

Esta aproximação molecular-baseada para determinar a aptidão bacteriana facilita a deteção exata e exata dos micro-organismos usando os códigos de barras genomic originais do ADN que são quantificados através do PCR digital. O protocolo descreve o cálculo do índice competitivo para cepas de Salmonella ; Entretanto, a tecnologia é prontamente adaptável aos protocolos que exigem a quantificação absoluta de todo o organismo genetically-maleável.

Resumo

Um índice competitivo é um método comum usado para avaliar a aptidão bacteriana e/ou virulência. A utilidade desta aproximação é exemplificada por sua facilidade executar e sua habilidade de padronizar a aptidão de muitas tensões a um selvagem-tipo organismo. A técnica é limitada, no entanto, por marcadores fenotípicos disponíveis e o número de cepas que podem ser avaliados simultaneamente, criando a necessidade de um grande número de experimentos replicantes. Em simultâneo com um grande número de experimentos, os custos laborais e materiais para quantificar as bactérias com base em marcadores fenotípicos não são insignificantes. Para superar esses aspectos negativos, mantendo os aspectos positivos, desenvolvemos uma abordagem molecular para quantificar diretamente os microrganismos após marcadores genéticos de engenharia em cromossomas bacterianos. Únicos, 25 códigos de barras do ADN do par baixo foram introduzidos em um locus inócuo no cromossoma de estirpes do selvagem-tipo e do mutante das salmonelas. Experimentos de competição in vitro foram realizados usando inóculos consistindo de cepas agrupadas. Após a competição, os números absolutos de cada cepa foram quantificados por meio de PCR digital e os índices competitivos para cada cepa foram calculados a partir desses valores. Nossos dados indicam que essa abordagem para quantificar a Salmonella é extremamente sensível, precisa e precisa para detectar microrganismos altamente abundantes (de alta aptidão) e raros (baixa aptidão). Adicionalmente, esta técnica é facilmente adaptável a quase todo o organismo com os cromossomas capazes da modificação, assim como aos vários projetos experimentais que exigem a quantificação absoluta dos micro-organismos.

Introdução

Avaliar a aptidão e a virulência de organismos patogénicos é um aspecto fundamental da pesquisa em microbiologia. Permite comparações entre cepas ou entre organismos mutantes, o que permite que os pesquisadores determinem a importância de determinados genes em condições específicas. Tradicionalmente, a avaliação de virulência utiliza um modelo animal de infecção usando diferentes cepas bacterianas e observando o resultado do animal infectado (por exemplo, dose infecciosa50, dose letal50, tempo até a morte, gravidade dos sintomas, falta de sintomas, etc.). Este procedimento fornece descrições valiosas da virulência, mas exige que as tensões causem diferenças consideráveis nos resultados a fim detectar variações do selvagem-tipo. Além disso, os resultados são semiquantitativos, pois enquanto a progressão da doença e a gravidade dos sintomas podem ser quantificadas subjetivamente ao longo do tempo, a interpretação da virulência comparada ao tipo selvagem é mais qualitativa (ou seja, mais, menos ou igualmente virulenta). Uma alternativa comum à realização de ensaios de infectividade animal é gerar índices competitivos (CIs), valores que comparam diretamente a aptidão ou a virulência de uma cepa a uma contraparte de tipo selvagem em uma infecção mista1. Esta técnica tem inúmeras vantagens sobre um modelo animal tradicional de infecção, padronando a virulência para uma estirpe de tipo selvagem e determinando um valor quantificável para refletir o grau de atenuação. Esta técnica também pode ser adaptada para analisar as interações genéticas em bactérias, determinando um índice competitivo cancelado (COI)2. O cálculo de um COI para um grupo de organismos mutados permite que os pesquisadores determinem se dois genes contribuem de forma independente para a patogênese ou se estão envolvidos na mesma via de virulência e dependem uns dos outros. Adicionalmente, calcular um CI exige a enumeração das bactérias que podem fornecer introspecções valiosas na patogénese dos organismos. CIs e COIs também permitem que os pesquisadores para jumentos avirulent cepas que não causam doença clínica, mas ainda têm diferenças na aptidão. Esta técnica é limitada pelo uso de marcadores tradicionais de resistência a antibióticos para identificar cepas, limitando assim o número de cepas de entrada para apenas um ou dois de cada vez. Devido a essa limitação, é necessário um grande número de grupos experimentais e repetições, o que, além de acrescentar aos custos trabalhistas e materiais, também aumenta as oportunidades de variabilidade em condições experimentais e resultados imprecisos. (Para uma revisão minuciosa dos benefícios e aplicações do uso de infecções mistas para estudar a virulência, a aptidão e as interações genéticas, ver C.R. Beuzón e DW Holden 1)

As tentativas foram feitas para superar esta limitação, tal como o uso de pilhas fluorescently-etiquetadas quantificadas através da citometria de fluxo3,4,5. Esta técnica quantifica as células usando 1) anticorpos rotulados para marcadores fenotípicos ou 2) proteínas fluorescentes produzidas endogenamente. O uso de anticorpos rotulados tem um limite de detecção de 1.000 células/mL e, portanto, requer um elevado número de células para analisar3. As células que expressam proteínas fluorescentes têm uma fisiologia alterada e são suscetíveis a alterações de aptidão resultantes da alta expressão protéica6. Ambos os métodos são limitados pelo número de marcadores fluorescentes detectável usando a citometria de fluxo. Um avanço na quantificação molecular foi conseguido com o desenvolvimento de uma técnica do microarray que detectaram a atenuação em 120 tensões de uma infecção misturada inicial sobre de 1.000 tensões em um modelo murino7. Esta técnica utilizou uma análise do microarray do RNA das tensões mutado, que conduzem à variabilidade considerável no resultado.  Não obstante, estabeleceu que as grandes associações de infecções misturadas podem ser uma ferramenta útil e que utilizando técnicas sensíveis da deteção, as diferenças na virulência bacteriana podem ser identificadas. Com o desenvolvimento do sequenciamento da próxima geração, TN-Seq expandiu a utilidade das mutações de transposon, possibilitando um método potente para quantificar as bactérias que foram aleatoriamente mutadas8,9,10, o 11. Um protocolo alternativo foi desenvolvido recentemente que elimina a necessidade para transposons e usa preferivelmente códigos de barras do ADN para identificar mais facilmente e controlar mudanças genomic e seu impacto na aptidão12. Esta tecnologia é um avanço importante, mas a inserção dos códigos de barras genômicos ainda é um processo aleatório. Para superar a aleatoriedade de experimentos anteriores, Yoon et al. desenvolveram um método para calcular os CIs de cepas de Salmonella usando códigos de barras de DNA únicos inseridos em locais precisos sobre os cromossomas das bactérias13. Cepas com código de barras exclusivas foram detectadas usando um método baseado em qPCR com verde SYBR e primers específicos para cada código de barras exclusivo. A técnica foi limitada por restrições impostas pela qPCR, incluindo diferenças na eficiência da cartilha e baixa sensibilidade, evidenciadas pela necessidade de Nested-PCR antes da qPCR. Não obstante, esta aproximação demonstrou que as modificações genomic alvejadas poderiam ser exploradas para detectar e potencialmente quantificar associações de tensões bacterianas múltiplas.

No seguinte protocolo, nós descrevemos uma metodologia nova para executar experimentos bacterianos da competição com as grandes associações do inóculos misturado seguidas pela quantificação exata usando uma técnica digital altamente sensível do PCR. O protocolo envolve cepas bacterianas geneticamente rotuladoras com um código de barras de DNA único inserido em uma região inócuo do cromossomo. Esta modificação permite que as tensões sejam rapidamente e precisamente quantificadas usando a tecnologia molecular moderna em vez das diluições seriais tradicionais, do chapeamento da réplica, e da contagem de unidades formando da colônia que dependem dos marcadores fenotípicos (isto é resistência antibiótica ). As modificações permitem a avaliação simultânea de muitas cepas em um único inoculto agrupada, reduzindo substancialmente a possibilidade de variabilidade experimental, pois todas as cepas são expostas às mesmas condições exatas. Além disso, enquanto esta técnica foi desenvolvida em Salmonella enterica sorovar typhimurium, é altamente adaptável a qualquer organismo geneticamente maleável e quase qualquer experimento experimental onde são necessárias contagens bacterianas precisas, proporcionando uma nova ferramenta para aumentar a exatidão e a taxa de transferência em laboratórios da microbiologia sem as limitações impostas por métodos precedentes.

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Protocolo

1. incorpore códigos de barras originais do ADN em um Plasmid que contem os componentes necessários para a troca allelic

Nota: Um plasmídeo novo, nomeado pskap, com um número elevado da cópia e uma eficiência aumentada da transformação comparado ao plasmídeo alélicas pKD13 existente da troca foi criado. Isso é descrito nas etapas 1.1-1.12 (Figura 1). Os plasmídeo finalizados contendo códigos de barras de DNA e componentes exclusivos para a troca alélica estão disponíveis através de um repositório de plasmílicos (tabela de materiais).

  1. Usando um kit de protocolo de plasmídeo comercial, purificar pKD1314 e PPCR script Cam SK+ de culturas bacterianas durante a noite cultivadas em caldo de Luria-Bertani (lb) suplementado com 50 μg/ml de canamicina ou 25 μg/ml de cloranfenicol (para pKD13 e PPCR script Cam SK +, respectivamente) (tabela 1).
  2. Realizar digestões de restrição em ambos os plasmís usando enzimas de restrição comercial HindIII e BamHI de acordo com as especificações do fabricante.
  3. Remova as enzimas de restrição e o DNA extirpado do pPCR script Cam SK+ reação e purifique a espinha dorsal do plasmídeo do par 3.370-base (BP) usando um kit de limpeza de DNA disponível comercialmente de acordo com as especificações do fabricante.
  4. Separe os fragmentos da digestão da limitação de pKD13 em um gel de agarose de 1% usando uma câmara da electroforese.
  5. Visualize bandas usando um transiluminador de luz azul e extirpar o fragmento 1.333 BP do gel (Figura 1C).
    Nota: Este fragmento contem o gene FRT-ladeado da resistência do canamicina exigido para a recolocação alélicas cromossomática.
  6. Purify o ADN extirpado da etapa 1,5 usando um jogo comercial da extração do gel.
  7. Para criar o pskap, ligadura o fragmento purificado de pKD13 (da etapa 1,6) em PPCR script Cam SK+ (da etapa 1,3) usando uma ligase de DNA T4 comercial de acordo com as especificações do fabricante.
  8. Transforme células DH5α quimicamente competentes com o plasmídeo ligado pskap seguindo o protocolo do fabricante (tabela 1).
  9. Espalhe transformantes em placas de agar LB suplementados com 50 μg/mL de canamicina e incubar a 37 ° c durante a noite.
  10. Escolha uma colônia da placa e raia-lo em uma nova placa de agar LB suplementado com 50 μg/mL de canamicina e incubar a 37 ° c durante a noite. Escolha uma colônia desta placa e use para inocular o caldo LB suplementado com 50 μg/mL de canamicina. Incubar a cultura durante a noite a 37 ° c com agitação constante.
  11. Use um kit de protocolo de plasmídeo comercial para purificar o pskap da cultura bacteriana durante a noite.
  12. Realize uma digestão de restrição diagnóstica do plasmídeo da etapa 1,11 usando Hind III e Bam HI de acordo com as especificações do fabricante. Visualize fragmentos em um gel de agarose a 1% como nos passos 1.4-1.5.
    Nota: O tamanho total do pSKAP deve ser 4.703 BP. fragmentos após a etapa 1,12 devem ser 3.370 e 1.333 BP.
  13. Projete primers do PCR para o mutagênese local-dirigido insertional (SDM) (tabela 2 e S1) de tal maneira a introduzir uma seqüência original do ADN de 25 basepair na posição 725 de pskap (Figura 2).
    Nota: O ADN do código de barras é introduzido no plasmídeo apenas fora do gene FRT-ladeado da resistência do canamicina, assim que o código de barras não é perdido durante a remoção subseqüente da gaveta da resistência do canamicina. Se gerar novas sequências de código de barras, use ferramentas on-line para garantir que as sondas de PCR específicas do alvo com rótulo fluorescentamente (doravante referidas simplesmente como "sondas") se vincularão eficientemente à nova sequência. As sequências de inserção projetadas até a data, juntamente com os primers necessários para criá-las, são fornecidas nas tabelas 2 e S1.
  14. Prepare as reações SDM usando uma polimerase de DNA de alta fidelidade comercial, os pares de primer desejados (tabela 2) e o modelo pSKAP. Definir o termocicer para executar o seguinte: 1) 98 ° c para 30 s, 2) 98 ° c para 10 s, 56 ° c para 15 s, 72 ° c para 2 min, 3) Repita os passos 2, 24 vezes, 4) 72 ° c por 5 min, 5) Segure a 4 ° c.
  15. Após a conclusão do PCR, esgote o molde de pSKAP adicionando a enzima da limitação DPN I à reação. Incubar a 37 ° c durante 20 min.
    Nota: Os produtos da PCR devem ser visualizados em gel de agarose para verificar o tamanho e a pureza do produto. Um controle DPN I digestão consistindo do modelo pSKAP não modificado pode ser realizado e usado em etapas subsequentes para garantir o modelo de DNA é completamente digerido.
  16. Use 5 μL do produto da etapa 1,15 para transformar 100 μL de células DH5α comerciais quimicamente competentes de acordo com as recomendações do fabricante.
  17. Transformantes da propagação em placas do agar da libra suplementado com o cloranfenicol de 25 μg/ml e incubar em 37 ° c durante a noite.
  18. Selecione uma colônia (ou colônias) de placas de noite e raia em placas de agar LB individuais suplementadas com cloranfenicol de 25 μg/mL e incubar a 37 ° c durante a noite. Selecione uma colônia de placas overnight e use para inocular 5 mL de caldo LB suplementado com 25 μg/mL de cloranfenicol. Incubar cultura (s) durante a noite a 37 ° c com agitação constante.
  19. Use um kit de protocolo de plasmídeo comercial para purificar os plasmídeos da (s) cultura (ões) durante a noite.
  20. A seqüência de Sanger purificou os plasmíos usando o iniciador de sequenciamento do M13 Forward (tabela 2). Compare a região mutada com o plasmídeo original e avalie a precisão da insertional SDM.
  21. Depois de confirmar a inserção e precisão do código de barras, atribua um nome a cada código de barras e plasmídeo.
    Nota: Os códigos de barras gerados até à data foram atribuídos a uma designação de duas letras: AA, AB, AC,..., BA, BB, BC, etc. Os plasmís codificados são indicados como pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC,..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC, etc.
  22. Repita as etapas 1.14-1.21 para gerar o número desejado de códigos de barras de DNA.

2. introduzir DNA Barcode no cromossomo de S. Typhimurium

Nota: Inserção de códigos de barras de DNA no S. O cromossoma de typhimurium é conseguido usando um método alélicas da troca descrito por datsenko e por Wanner14 que foi modificado para o uso em S. Typhimurium.

  1. Determine o locus no S. Genoma de typhimurium no qual inserir o código de barras de DNA (Figura 3).
    Nota: Selecione uma grande região intergênica do cromossomo. Evite regiões que produzem RNA não codificante. Este estudo utilizou um locus a jusante de colocar P entre os resíduos 1.213.840 e 1.213.861 (determinado a partir do conjunto do genoma GCA_ 000022165.1). Esta região tem sido previamente manipulada geneticamente para a complementação trans dos genes15. Alternativamente, um código de barras do ADN podia ser introduzido ao simultaneamente interromper um gene do interesse. Isso exigiria alterações mínimas neste protocolo e simplificaria a criação de mutantes.
  2. Projete primers do PCR para amplificar o código de barras original e o gene FRT-ladeado da resistência do canamicina do plasmídeo de código de barras pskap desejado da etapa 1,21 (tabela 2). Adicionar 40-nucleotídeo extensões que são homólogo para a região selecionada na etapa 2,1 para o 5 ' fim de cada Primer (tabela 2).
  3. Realize a amplificação usando uma polimerase de alta fidelidade comercial, os primers da etapa 2,2 e o plasmídeo contendo código de barras pSKAP desejado como modelo. Defina o termocicer para executar o seguinte: 1) 98 ° c para 30 s, 2) 98 ° c para 10 s, 3) 56 ° c para 15 s, 4) 72 ° c para 60 s, repita os passos 2-4 29 vezes, 5) 72 ° c por 5 min, 6) Segure a 4 ° c.
  4. Após a conclusão do PCR, esgote o ADN do molde usando o DpnI como descrito em etapa 1,15. Purificar e concentrar o DNA usando um kit de limpeza de DNA comercial de acordo com as especificações do fabricante.
  5. Refira o protocolo previamente publicado para gerar mutantes em S. Tensão 14028s de typhimurium dos produtos14,16,17,18do PCR.
    Nota: Não é essencial que o gene da resistência do canamicina esteja extirpado do cromossoma. Entretanto, a excisão do gene é minimamente disruptiva ao cromossoma bacteriano porque conduz a uma cicatriz de 129 BP que deixaria os genes a jusante potenciais em-quadro. Recomenda-se que a cepa que contém o gene da resistência à canamicina seja mantida, pois pode ser usada para mover códigos de barras entre cepas via transdução mediada por P22.
  6. Repita as etapas 2,3 – 2,5 para criar as cepas desejadas com os códigos de barras apropriados.
    Nota: Os códigos de barras podem ser introduzidos no Wild-Type S. Typhimurium que pode então ser submetido a mais manipulação genética, ou códigos de barras podem ser introduzidos em cepas que têm sido previamente alteradas geneticamente.

3. condições de crescimento bacteriano e ensaios de competição in vitro

  1. Do estoque de bactérias, raia desejada S. Cepas de typhimurium que cada porto um código de barras de DNA exclusivo para placas de agar LB. Incubar placas durante a noite a 37 ° c.
  2. Selecione uma única colônia de cada cepa e inocular 5 mL de caldo LB. Incubar por 20 h a 37 ° c com agitação constante.
    Nota: Usando a cultura overnight, prossiga para o passo 3,5 para coletar o DNA genómico puro (gDNA) de cada cepa com código de barras. Isso é necessário para experimentos subseqüentes de validação e controle na seção 6.
  3. Para cada ensaio da competição, transfira um volume igual de cada cultura overnight em um tubo estéril apropriadamente feito medida. Misture completamente as estirpes juntas por vortexing vigorosamente por pelo menos 5 s.
    Nota: O volume de cada cultura durante a noite para transferência deve ser suficiente para cada condição e replicar, bem como para isolar gDNA para quantificar a entrada. Embora não seja inteiramente necessário medir densidades ópticas de culturas porque o número absoluto de microrganismos de entrada será quantificado usando PCR digital, o número de bactérias de entrada para cada cepa deve ser aproximadamente igual para evitar gargalos ou concorrência desigual no início do experimento. Os ensaios representativos da competição neste protocolo compararam taxas de crescimento de 8 tensões simultaneamente. Cepas adicionais ou menos podem ser necessárias para projetos experimentais individuais.
  4. Transferir 100 μL do inônio misto para 4,9 mL de caldo LB estéril. Incubar a 37 ° c para o tempo desejado ou para uma densidade óptica desejada.
  5. Colher 500 μL do iníbulo por centrifugação a > 12000 x g durante 1 min. remover e descartar o sobrenadante. Prossiga imediatamente para a seção 4 com as células.
  6. Nos pontos de tempo desejados, remova 500 μL de alíquotas de cultura e células de colheita por centrifugação a > 12000 x g por 1 min. Retire e descarte o sobrenadante.
    Nota: Se coletar alíquotas em vários pontos de tempo, congele Pelotas a-20 ° c ou prossiga imediatamente para a etapa 4,1 após cada coleção.

4. coletando e quantificando gDNA de S. Typhimurium (das etapas 3,5 e 3,6)

  1. Colher gDNA de células usando um kit de purificação de gDNA comercial. Se disponível, execute a etapa opcional da depleção de RNA.
    Nota: A depleção de RNA não é necessária; no entanto, a presença de RNA aumentará artificialmente a concentração de DNA, levando a cálculos aberrantes em etapas subsequentes. Se estiver usando um kit de purificação de gDNA comercial, siga as recomendações do fabricante para garantir que a coluna não esteja sobrecarregada com o DNA. Não há nenhuma concentração mínima de DNA necessária se a amostra for quantificável em etapas subsequentes.
  2. Use um espectrofotômetro para quantificar o DNA em cada amostra.
    Nota: O DNA pode ser quantificado usando qualquer método confiável.
  3. Calcule o número de cópia do gDNA com base no tamanho do genoma bacteriano usando a seguinte equação, onde: X é a quantidade de DNA em ng e N é o comprimento de uma molécula de DNA de duas cordas (o tamanho do genoma).
    figure-protocol-13219
    Nota: 660 g/mole é usado como a massa média de 1 DNA BP. pequenas variações podem existir dependendo da composição do nucleotídeo do organismo. Inúmeras calculadoras estão disponíveis on-line para realizar o cálculo.

5. Projete primers e pontas de prova para a deteção quantitativa de códigos de barras do ADN através do PCR de dDigital

  1. Projete primers para amplificar a região de código de barras do S. Cromossoma de typhimurium downstream de Putp (Figura 3C e tabela 2).
    Nota: Os projetos da primeira demão e da ponta de prova podem ser facilitados por programas em linha numerosos (tabela dos materiais). Se os códigos de barras são todos inseridos no mesmo loci, um único conjunto de primers de amplificação é universal para todos os códigos de barras.
  2. Projetar sondas com base em 6-carboxifluoresceina (FAM) e/ou hexaclorofluoresceina (HEX) específicas para cada código de barras (tabela 2 e S1).
    Nota: O leitor de gotas utilizado neste experimento é capaz de detectar simultaneamente as sondas FAM-e HEX-based em uma reação multiplex. Design 1/2 das sondas para utilizar FAM e 1/2 para utilizar HEX. Este não é um passo necessário, mas reduzirá o uso de reagentes e os custos experimentais, se implementado.
  3. Faça misturas mestras de primer-sonda de 20x contendo 1) 20 mM de cada primer de amplificação para frente e verso, 2) 10 mM de uma única sonda FAM e 3) 10 mM de uma única sonda HEX (se multiplexação).

6. valide a sensibilidade e a especificidade de cada Pprimer-jogo da ponta de prova para cada código de barras genomic usando o PCR de Digitas

Nota: Este protocolo usa Validando oito códigos de barras originais com oito pontas de prova originais como um exemplo. O número de códigos de barras utilizados pode ser aumentado ou diminuído para acomodar vários designs experimentais.

  1. Crie um pool de gDNA que contenha todos os códigos de barras, exceto um. Use este pool como o diluente para executar uma série de diluição com gDNA contendo o único código de barras restante (o esquema de diluição da amostra é fornecido na Figura 4).
    Nota: Usar gDNA agrupada como um diluente assegura um fundo consistente ao verificar a sensibilidade. Usando os números de cópia determinados na etapa 4,3, diluir gDNA a um número da cópia dentro da escala digital recomendada do PCR (1-100000 cópias por uma reação de 20 μL). Tenha em mente que o intervalo é definido para cada destino exclusivo (código de barras), não o gDNA total.
  2. Prepare reações para o PCR digital na duplicata de acordo com as recomendações do fabricante para usar um Supermix digital do PCR projetado para a química sonda-baseada. Use as misturas da etapa 6,1 como o ADN do molde. Use a mistura mestra de primer-Probe 20x da etapa 5,3 que contém a sonda para o código de barras diluído na etapa 6,1.
  3. Prepare reações de controle replicadas para PCR digital de acordo com as recomendações do fabricante para usar uma supermistura de PCR digital projetada para química baseada em sonda. As reações de controle para cada mistura de sonda devem consistir em 1) controles negativos sem controles de modelo (NTCs), 2) e 3) controles positivos.
    Nota: O número mínimo de reações de controle de repetição é dois. Este protocolo de exemplo usa quatro NTCs, seis controles negativos e seis controles positivos para cada código de barras. Os controles negativos devem conter gDNA com cada código de barras, exceto para o código de barras correspondente à sonda que está sendo testada. Isso validará a especificidade de cada sonda.
  4. Repita os passos 6.1-6.3 para criar reações de PCR digital para cada amostra de gDNA codificado. Um arranjo da placa da amostra é apresentado na Figura 5.
    Nota: Isto e as etapas subseqüentes são descritas baseadas em uma plataforma digital específica do PCR que utilize gotas e tecnologia fluir-baseada. As plataformas digitais alternativas do PCR que utilizam a tecnologia chip-based podem facilmente ser substituídas com modificações ligeiras a este protocolo. Etapa 6,4 pode exigir mais de 1 96-bem placa para validar todos os conjuntos de primer. Em contraste com a qPCR, as placas separadas analisadas por PCR digital podem ser prontamente comparadas sem a necessidade de poços de referência padronizados entre as placas.
  5. Gerar gotículas para cada condição de reação usando um gerador de gotas de acordo com as instruções do fabricante.
  6. Transfira gotículas recém-criadas para a placa 96-well apropriada. Use 200 μL de ponteiras de pipeta em uma pipeta multicanal de 5-50 μL.
    Nota: Quando as gotas de pipetagem, pipeta lentamente e suavemente! O fabricante digital do equipamento do PCR recomenda usar somente pipetas e pontas da pipeta de um fabricante particular (por exemplo, Ranin). Estas pontas da pipeta têm uma abertura Lisa sem os fragmentos plásticos microscópicos que podem destruir gotículas ou danificar o microfluídica do leitor da gota. Inúmeras marcas de dicas foram examinadas e observadas para ter um espectro de qualidade de fabricação. Resultados equivalentes foram alcançados usando alternativas de ponteira de pipeta; Entretanto, o cuidado deve ser usado ao desviar-se das recomendações do fabricante.
  7. Depois que todas as gotas foram geradas e transferidas, sele a placa com um aferidor da placa da folha.
  8. Use o termociclador recomendado pelo fabricante para realizar as seguintes condições de ciclismo: 1) 94 ° c por 10 min; 2) 94 ° c por 1 minuto, taxa da rampa ajustada em 1 ° c/s; 3) 55 ° c por 2 minutos, taxa da rampa ajustada em 1 ° c/s; 4) Repita os passos 2 e 3 49 vezes; 5) 98 ° c por 10 min; 6) Segure a 4 ° c até 24 h.
    Nota: A transferência térmica em uma reação da gota não é a mesma que o PCR padrão. As condições de reacção podem necessitar de modificação.
  9. Enquanto o termociclismo está sendo realizado, Programe o software de análise de dados com as informações de configuração da placa, como nome da amostra, tipo de experimento (quantificação absoluta), Supermix usado, nome de destino 1 (nome de código de barras FAM), tipo de alvo 1 (NTC, controle positivo, controle negativo, ou desconhecido), nome do alvo 2 (nome do código de barras HEX), tipo do alvo 2 (espaço em branco, controle positivo, controle negativo, ou desconhecido). A informação final da configuração da placa é mostrada na Figura 5.
  10. Depois que o termociclagem é completo, transfira as reações terminadas ao leitor da gota e comece o processo de leitura de acordo com as instruções do fabricante.

7. quantificar o número de bactérias em um experimento de índice competitivo

  1. Diluir o gDNA isolado e quantificado da secção 4 para uma concentração adequada, tal como descrito acima.
  2. Prepare reações para o PCR digital de acordo com as recomendações do fabricante para usar o Supermix apropriado. Use o DNA da etapa 7,1 como o modelo. Use uma mistura mestra de primer-Probe 20x que contenha a sonda (ou sondas se detectando FAM e HEX) para possíveis códigos de barras presentes no experimento.
  3. Prepare reações digitais adicionais do PCR como na etapa 7,2 usando misturas mestras diferentes da primer-ponta de prova 20x até que todos os códigos de barras utilizados no projeto experimental possam ser detectados.
  4. Inclua controles para cada condição conforme descrito em 6,3. Isso inclui 1) sem controles de modelo (NTCs), 2) controles negativos e 3) controles positivos.
  5. Continue com o protocolo conforme descrito nas etapas 6.5-6.10.

8. analise dados do PCR de Digitas e calcule números absolutos da cópia

  1. Quando todos os poços tiverem sido lidos e a execução estiver concluída, abra o arquivo de dados. QLP usando o software de análise de dados.
    Nota: Os tipos de arquivo e os procedimentos de análise de dados descritos aqui são específicos a um fabricante digital do PCR. Se utilizar plataformas de PCR digitais alternativas, os tipos de ficheiro e os procedimentos de análise de dados serão específicos da plataforma utilizada e devem ser efectuados de acordo com as especificações recomendadas pelo fabricante.
  2. Selecione todos os poços que utilizam o mesmo primer-Probe Master Mix.
  3. Na guia gotículas , examine o número de gotas analisadas em cada poço (gotas positivas e negativas). Exclua da análise qualquer poço que tenha menos de 10.000 gotículas totais.
  4. Mova para a guia amplitude 1D e examine as amplitudes de gotas positivas e negativas. Assegure-se de que compreendem duas populações distintas.
  5. Dentro do software, use o recurso de limiarização para fazer um corte entre gotas positivas e negativas para cada sonda que foi utilizada (Figura 6).
    Nota: Todos os poços que usam o mesmo primer-Probe Master Mix da etapa 5,3 devem ter os mesmos limiares.
  6. Uma vez que os limiares apropriados foram aplicados a todos os poços, o software calculará o número de cópias do ADN em cada reação. Exporte dados para uma planilha para facilitar a análise.
    Nota: O software de análise de dados usa o número de gotas positivas e negativas que são adequados para uma distribuição de Poisson para determinar o número de cópia.
  7. Usando os valores da etapa 8,6, calcule o número de cópia inicial de cada código de barras genômica exclusivo na amostra. Determine a taxa média de falso-positivo das reações de controle negativo e subtraia esse valor dos valores obtidos em reações experimentais. Multiplicar os valores conforme necessário com base nas diluições que foram executadas ao configurar cada experimento (tabela 3).

9. Determine a aptidão relativa de um organismo calculando o CI ou o COI da quantificação PCR-baseada de Digitas de estirpes de código de barras

  1. Calcule o CI de uma estirpe de código de barras utilizando as seguintes fórmulas em que: umasaída é a quantificação absoluta da cepa codificada em um determinado ponto de tempo, asaída de WT é a quantificação absoluta de bactérias do tipo selvagem com código de barras ao mesmo timepoint, aentrada é a quantificação absoluta do ininoculto de entrada da estirpe de código de barras, aentrada de WT é a quantificação absoluta do inônio de entrada de bactérias do tipo selvagem com código de barras, asaída X é a somatória de todas as cepas em o mesmo ponto de tempo, XInput é a soma do inum total de entrada de todas as cepas com código de barras.

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figure-protocol-24523
Nota: Veja a discussão de vantagens, desvantagens e o uso mais adequado de cada fórmula.

  1. Repita a etapa 9,1 para cada tensão codificada em todos os pontos de tempo.
  2. Se aplicável, calcule o COI usando as seguintes fórmulas onde: umasaída é a quantificação absoluta de uma cepa com código de barras com um gene mutado a em um determinado ponto de tempo, asaída AB é a quantificação absoluta de uma cepa de código de barras com genes mutados a e B no mesmo ponto de tempo, umaentrada é a quantificação absoluta do inóculo de entrada da cepa com código de barras com Gene mutado a, aentrada AB é a quantificação absoluta do inóculo de entrada de estirpe com código de barras com genes mutados a e b, b asaída é a quantificação absoluta de uma cepa com código de barras com gene mutado b em um determinado ponto temporal, e aentrada b é a quantificação absoluta da entrada inônio da cepa codificada com Gene Bmutado.

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E/OU
figure-protocol-25803

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Resultados

O uso dessa metodologia requer que sejam realizadas reações de controle apropriadas para validar a sensibilidade e a especificidade de cada sonda utilizada para identificar o DNA alvo. Neste experimento representativo, validamos oito códigos de barras de DNA únicos com as oito sondas correspondentes para identificação. Todas as oito sondas apresentaram baixa taxa de falsos positivos em ambas as NTC e reações de controle negativo (tabela 3), destacando sua especifi...

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Discussão

A capacidade de quantificar com precisão os microrganismos é de suma importância para a pesquisa de microbiologia, e a capacidade de enumerar cepas únicas de uma população mista inicial provou ser uma ferramenta inestimável para avaliar os traços de aptidão e virulência em Bactérias. No entanto, as técnicas para realizar isso não progrediram em ritmo com os desenvolvimentos modernos em biologia molecular. A tecnologia para modificar facilmente os cromossomas de muitas bactérias, incluindo S. Typhim...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

As pesquisas relatadas nesta publicação foram apoiadas pelo fundo de pesquisa do corpo docente do Presidente George F. Haddix e pelo Instituto Nacional de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde (NIH) o prêmio número GM103427. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesEppendorf22600028Procure from any manufacturer
16 mL culture tubesMidSci8599Procure from any manufacturer
5-200 μL pipette tipsRAININ30389241Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality
5-50 μL multichannel pipetteRAININ17013804Use alternative multichannel pipettes with caution
AgaroseThermoFisher ScientificBP160-500Procure from any manufacturer
BLAST AnalysisNCBIN/Ahttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction ModuleBio Rad1851197Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Chemically competent DH5αInvitrogen18258012Procure from any manufacturer or prepare yourself
ChloramphenicolThermoFisher ScientificBP904-100Procure from any manufacturer
Cytation5 Microplate readerBioTekCYT5MFProcure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro)Bio RadN/AMust procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR 96-Well PlatesBio Rad12001925Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Droplet Reader OilBio Rad1863004Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)Bio Rad1863024Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet GeneratorBio Rad1864008Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet GeneratorBio Rad1863009Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Droplet Generation Oil for ProbesBio Rad1863005Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
KanamycinThermoFisher ScientificBP906-5Procure from any manufacturer
Luria-Bertani agarThermoFisher ScientificBP1425-2Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl
Luria-Bertani brothThermoFisher ScientificBP1426-2Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceableBio Rad1814040Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
PCR TubesEppendorf951010022Procure from any manufacturer
Petri dishesThermoFisher ScientificFB0875712Procure from any manufacturer
pPCR Script Cam SK+Stratagene/Agilent211192No longer available commercially
Primer/Probe DesignIDTN/Ahttps://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP and pSKAP_BarcodesAddgenePlasmid numbers 122702-122726www.addgene.org
PX1 PCR Plate SealerBio Rad1814000Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet GeneratorBio Rad1864002Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet ReaderBio Rad1864003Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Salmonella typhimurium strain ATCC 14028sATCCATCC 14028swww.atcc.org
Take3 Micro-Volume PlateBioTekTAKE3Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHIThermoFisher ScientificFERFD0054Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest DpnIThermoFisher ScientificFERFD1704Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest HindIIIThermoFisher ScientificFERFD0504Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro KitThermoFisher ScientificFERK0832Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Miniprep KitThermoFisher ScientificFERK0503Procure from any manufacturer
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseThermoFisher ScientificF534LProcure from any manufacturer
Thermo Scientific T4 DNA LigaseThermoFisher ScientificFEREL0011Procure from any manufacturer
ThermocyclerBio Rad1861096Procure from any manufacturer
UVP Visi-Blue TransilluminatorThermoFisher ScientificUV95043301Or other transiluminator that allows visualization of DNA
Water, Molecular Biology GradeThermoFisher ScientificBP28191Procure from any manufacturer

Referências

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