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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser molekulare Ansatz zur Bestimmung der bakteriellen Fitness ermöglicht die präzise und genaue Detektion von Mikroorganismen mithilfe einzigartiger genomischer DNA-Barcodes, die über digitale PCR quantifiziert werden. Das Protokoll beschreibt die Berechnung des Wettbewerbsindex für Salmonellenstämme; Die Technologie ist jedoch leicht an Protokolle anpassbar, die eine absolute Quantifizierung jedes genetisch verformbaren Organismus erfordern.

Zusammenfassung

Ein Wettbewerbsindex ist eine gängige Methode zur Beurteilung der bakteriellen Fitness und/oder Virulenz. Der Nutzen dieses Ansatzes wird durch seine Leichtigkeit zu erfüllen und seine Fähigkeit, die Fitness vieler Stämme auf einen wilden Organismus zu standardisieren veranschaulicht. Die Technik wird jedoch durch verfügbare phänotypische Marker und die Anzahl der Stämme begrenzt, die gleichzeitig bewertet werden können, was die Notwendigkeit für eine große Anzahl von Replikationsexperimenten erzeugt. Gleichzeitig mit einer großen Anzahl von Experimenten sind die Arbeits- und Materialkosten für die Quantifizierung von Bakterien auf der Grundlage von phänotypischen Markern nicht unerheblich. Um diese negativen Aspekte zu überwinden und gleichzeitig die positiven Aspekte beizubehalten, haben wir einen molekularbasierten Ansatz entwickelt, um Mikroorganismen direkt nach technischen genetischen Markern auf bakterielle Chromosomen zu quantifizieren. Einzigartige, 25 Basispaar-DNA-Barcodes wurden an einem harmlosen Ort auf dem Chromosom von Wildtyp- und mutierten Salmonellenstämmen eingefügt. In-vitro-Wettbewerbsexperimente wurden mit Inocula durchgeführt, die aus gepoolten Stämmen bestehen. Im Anschluss an den Wettbewerb wurden die absoluten Zahlen der einzelnen Stämme anhand der digitalen PCR quantifiziert, und die Wettbewerbsindizes für jede Sorte wurden aus diesen Werten berechnet. Unsere Daten deuten darauf hin, dass dieser Ansatz zur Quantifizierung von Salmonellen äußerst empfindlich, genau und präzise ist, um sowohl sehr reichlich (hohe Fitness) als auch seltene (niedrige Fitness) Mikroorganismen zu erkennen. Darüber hinaus ist diese Technik leicht an nahezu jeden Organismus mit modifizierenden Chromosomen sowie an verschiedene experimentelle Konstruktionen anpassbar, die eine absolute Quantifizierung von Mikroorganismen erfordern.

Einleitung

Die Beurteilung von Fitness und Virulenz pathogener Organismen ist ein grundlegender Aspekt der mikrobiologischen Forschung. Es ermöglicht Vergleiche zwischen Stämmen oder zwischen mutierten Organismen, was es Forschern ermöglicht, die Bedeutung bestimmter Gene unter bestimmten Bedingungen zu bestimmen. Traditionell nutzt die Virulenzbewertung ein tierisches Infektionsmodell mit verschiedenen Bakterienstämmen und beobachtet das Ergebnis des infizierten Tieres (z. B. Infektiöse Dosis50, Tödliche Dosis50, Zeit bis zum Tod, Symptomschwere, Symptome usw.). Dieses Verfahren liefert wertvolle Beschreibungen der Virulenz, erfordert jedoch, dass Stämme erhebliche Unterschiede in den Ergebnissen verursachen, um Variationen vom Wildtyp zu erkennen. Darüber hinaus sind die Ergebnisse semiquantitativ, da die Krankheitsprogression und die Symptomschwere im Laufe der Zeit subjektiv quantifiziert werden können, die Interpretation der Virulenz im Vergleich zum Wildtyp qualitativer ist (d. h. mehr, weniger oder gleich virulent). Eine häufige Alternative zur Durchführung von Tierinfektivitätstests besteht darin, wettbewerbsfähige Indizes (CIs) zu generieren, Werte, die Die Fitness oder Virulenz eines Stammes direkt mit einem Wildtyp-Gegenstück in einer gemischten Infektion vergleichen1. Diese Technik hat zahlreiche Vorteile gegenüber einem traditionellen Tiermodell der Infektion, indem sie Virulenz auf einen Wildstamm standardisiert und einen quantifizierbaren Wert bestimmt, der den Grad der Dämpfung widerspiegelt. Diese Technik kann auch angepasst werden, um Genwechselwirkungen in Bakterien zu analysieren, indem ein aufgehobener Wettbewerbsindex (COI)2ermittelt wird. Die Berechnung eines COI für eine Gruppe mutierter Organismen ermöglicht es den Forschern zu bestimmen, ob zwei Gene unabhängig voneinander zur Pathogenese beitragen oder ob sie an demselben Virulenzweg beteiligt und voneinander abhängig sind. Darüber hinaus erfordert die Berechnung eines CI die Aufzählung von Bakterien, die wertvolle Einblicke in die Pathogenese von Organismen liefern können. CIs und COIs ermöglichen es Forschern auch, avirulente Stämme zu asses, die keine klinischen Krankheiten verursachen, aber immer noch Unterschiede in der Fitness haben. Diese Technik wird durch die Verwendung von traditionellen Antibiotikaresistenzmarkern zur Identifizierung von Stämmen eingeschränkt, wodurch die Anzahl der Eingangsstämme auf jeweils nur ein oder zwei begrenzt wird. Aufgrund dieser Einschränkung sind eine große Anzahl von experimentellen Gruppen und Replikationen erforderlich, was neben der Erhöhung der Arbeits- und Materialkosten auch die Chancen für Variabilität unter experimentellen Bedingungen und ungenaue Ergebnisse erhöht. (Für eine gründliche Überprüfung der Vorteile und Anwendungen der Verwendung von gemischten Infektionen zur Untersuchung von Virulenz, Fitness, und Gen-Wechselwirkungen, siehe C.R. Beuzén und D.W. Holden 1)

Es wurde versucht, diese Einschränkung zu überwinden, wie z. B. die Verwendung fluoreszierend markierter Zellen, die über die Durchflusszytometrie3,4,5quantifiziert werden. Diese Technik quantifiziert Zellen mit entweder 1) markierten Antikörpern gegen phänotypische Marker oder 2) endogen produzierten fluoreszierenden Proteinen. Die Verwendung von markierten Antikörpern hat eine Nachweisgrenze von 1.000 Zellen/ml und erfordert daher eine hohe Anzahl von Zellen, um3zu analysieren. Zellen, die fluoreszierende Proteine exezieren, haben eine veränderte Physiologie und sind anfällig für Fitnessveränderungen infolge einer hohen Proteinexpression6. Beide Methoden sind durch die Anzahl der fluoreszierenden Marker begrenzt, die mit Derdurchflusszytometrie nachweisbar sind. Ein Fortschritt in der molekularen Quantifizierung wurde durch die Entwicklung einer Mikroarray-Technik erreicht, die Dämpfung in 120 Stämmen aus einer anfänglichen gemischten Infektion von über 1.000 Stämmen in einem murinen Modell7erkannte. Diese Technik nutzte eine Mikroarray-Analyse von RNA aus mutierten Stämmen, die zu einer erheblichen Variabilität des Ergebnisses führten.  Dennoch stellte sie fest, dass große Pools gemischter Infektionen ein nützliches Werkzeug sein können und dass durch den Einsatz empfindlicher Nachweistechniken Unterschiede in der bakteriellen Virulenz identifiziert werden können. Mit der Entwicklung der Sequenzierung der nächsten Generation erweiterte Tn-seq den Nutzen von Transposonmutationen und ermöglichte eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung von Bakterien, die nach dem Zufallsprinzip mutiert waren8,9,10, 11. Kürzlich wurde ein alternatives Protokoll entwickelt, das Transposons überflüssig macht und stattdessen DNA-Barcodes verwendet, um genomische Veränderungen und ihre Auswirkungen auf die Fitness leichter zu identifizieren und zu verfolgen12. Diese Technologie ist ein großer Fortschritt, aber das Einfügen der genomischen Barcodes ist immer noch ein zufälliger Prozess. Um die Zufälligkeit früherer Experimente zu überwinden, entwickelten Yoon et al. eine Methode zur Berechnung der CIs von Salmonellenstämmen mithilfe einzigartiger DNA-Barcodes, die an präzisen Stellen auf den Chromosomen von Bakterien eingefügt wurden13. Einzigartige Barcode-Stämme wurden mit einer qPCR-basierten Methode mit SYBR-Grün und Primern, die für jeden eindeutigen Barcode spezifisch sind, erkannt. Die Technik wurde durch die von qPCR auferlegten Einschränkungen eingeschränkt, einschließlich Unterschieden in der Primer-Effizienz und der geringen Empfindlichkeit, was durch die Notwendigkeit von geschachtelter PCR vor qPCR belegt wird. Dennoch zeigte dieser Ansatz, dass gezielte genomische Modifikationen für den Nachweis und die potentielle Quantifizierung von Pools mehrerer Bakterienstämme genutzt werden könnten.

Im folgenden Protokoll beschreiben wir eine neuartige Methodik zur Durchführung bakterieller Wettbewerbsexperimente mit großen Pools gemischter Inocula, gefolgt von einer genauen Quantifizierung mit einer hochsensiblen digitalen PCR-Technik. Das Protokoll beinhaltet die genetische Kennzeichnung von Bakterienstämmen mit einem einzigartigen DNA-Barcode, der auf eine harmlose Region des Chromosoms eingefügt wird. Diese Modifikation ermöglicht eine schnelle und genaue Quantifizierung von Stämmen mithilfe moderner molekularer Technologie anstelle herkömmlicher serieller Verdünnungen, Nachahmung und Zählen von Koloniebildenden Einheiten, die auf phänotypischen Markern basieren (d. h. Antibiotikaresistenz ). Die Modifikationen ermöglichen die gleichzeitige Bewertung vieler Stämme in einem einzigen gepoolten Inokulum, wodurch die Möglichkeit einer experimentellen Variabilität erheblich reduziert wird, da alle Stämme genau den gleichen Bedingungen ausgesetzt sind. Während diese Technik in Salmonella enterica serovar Typhimurium entwickelt wurde, ist sie hochgradig anpassungsfähig an jeden genetisch verformbaren Organismus und nahezu jedes experimentelle Design, bei dem genaue Bakterienzahlen erforderlich sind, was eine neue Werkzeug zur Erhöhung der Genauigkeit und des Durchsatzes in mikrobiologischen Laboratorien ohne die Einschränkungen, die durch frühere Methoden auferlegt wurden.

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Protokoll

1. Integrieren Sie einzigartige DNA-Barcodes auf ein Plasmid, das die notwendigen Komponenten für den Allelic-Austausch enthält

HINWEIS: Ein neues Plasmid namens pSKAP mit einer hohen Kopierzahl und erhöhter Transformationseffizienz im Vergleich zum bestehenden pKD13 Allelic Exchange Plasmid wurde erstellt. Dies wird in den Schritten 1.1-1.12 (Abbildung 1) beschrieben. Die fertigen Plasmide, die eindeutige DNA-Barcodes und Komponenten für den Allelaustausch enthalten, sind über ein Plasmid-Repository (Materialtabelle )verfügbar.

  1. Reinigen Sie pKD1314 und pPCR Script Cam SK+ aus über Nacht angebauten Bakterienkulturen aus Luria-Bertani (LB) Brühe, ergänzt mit 50 g/mL Kanamycin oder 25 g/ml Chloramphenicol (für pKD13 und pPCR Script Cam SK+) (Tabelle 1).
  2. Führen Sie Restriktionsverdauungen auf beiden Plasmiden mit kommerziellen Restriktionsenzymen HindIII und BamHI gemäß den Spezifikationen des Herstellers durch.
  3. Entfernen Sie Restriktionsenzyme und ausgeschnittene DNA aus der pPCR Script Cam SK+ Reaktion und reinigen Sie das 3.370-Basis-Paar (bp) Plasmid-Rückgrat mit einem handelsüblichen DNA-Reinigungskit gemäß den Spezifikationen des Herstellers.
  4. Trennen Sie die Fragmente von der pKD13-Einschränkungsverdauung auf einem 1% Agarose-Gel mit einer Elektrophoresekammer.
  5. Visualisieren Sie Bänder mit einem Blaulichttransilluminator und verbrauchen Sie das 1.333 bp Fragment aus dem Gel (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Dieses Fragment enthält das FRT-flankierte Kanamycin-Resistenzgen, das für den chromosomalen Allelersatz erforderlich ist.
  6. Reinigen Sie die ausgeschnittene DNA aus Schritt 1.5 mit einem kommerziellen Gel-Extraktionskit.
  7. Um pSKAP zu erstellen, ligate das gereinigte Fragment von pKD13 (ab Schritt 1.6) in pPCR Script Cam SK+ (ab Schritt 1.3) mit einer kommerziellen T4-DNA-Ligase nach den Spezifikationen des Herstellers.
  8. Transformieren Sie chemisch kompetente DH5-Zellen mit dem ligattierten pSKAP-Plasmid nach dem Herstellerprotokoll (Tabelle 1).
  9. Transformanten auf LB-Agarplatten verteilen, die mit 50 g/ml Kanamycin ergänzt werden, und bei 37 °C über Nacht inkubieren.
  10. Wählen Sie eine Kolonie von der Platte und streifen Sie sie auf einer neuen LB-Agarplatte, ergänzt mit 50 g/ml Kanamycin, und bebrüten Sie sie bei 37 °C über Nacht. Wählen Sie eine Kolonie aus dieser Platte und verwenden Sie, um LB-Brühe mit 50 g/ml Kanamycin ergänzt zu impfen. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 °C mit ständiger Erregung.
  11. Verwenden Sie ein kommerzielles Plasmid-Miniprep-Kit, um pSKAP von der über Nacht bakteriellen Kultur zu reinigen.
  12. Führen Sie eine diagnostische Restriktionsverdauung des Plasmids ab Schritt 1.11 mit Hind III und Bam HI gemäß herstellerspezifischen Spezifikationen durch. Visualisieren Sie Fragmente auf einem 1% Agarose-Gel wie in den Schritten 1.4-1.5.
    HINWEIS: Die pSKAP Gesamtgröße sollte 4.703 bp sein. Fragmente nach Schritt 1.12 sollten 3.370 und 1.333 bp sein.
  13. Entwerfen Sie PCR-Primer für die einfügungsweise standortgesteuerte Mutagenese (SDM) (Tabelle 2 und S1) so, dass eine eindeutige 25-Basepair-DNA-Sequenz an Position 725 von pSKAP eingefügt wird (Abbildung 2).
    HINWEIS: Die Barcode-DNA wird in das Plasmid etwas außerhalb des FRT-flankierten Kanamycin-Resistenzgens eingeführt, so dass der Barcode bei der anschließenden Entfernung der Kanamycin-Resistenzkassette nicht verloren geht. Wenn Sie neue Barcode-Sequenzen erzeugen, verwenden Sie Online-Tools, um sicherzustellen, dass die fluoreszierend markierten zielspezifischen PCR-Sonden (im Folgenden einfach als "Sonden" bezeichnet) effizient an die neue Sequenz binden. Einfügesequenzen, die bis heute entworfen wurden, sowie die erforderlichen Primer, um sie zu erstellen, sind in den Tabellen 2 und S1enthalten.
  14. Bereiten Sie SDM-Reaktionen mit einer kommerziellen High-Fidelity-DNA-Polymerase, den gewünschten Primer-Paaren (Tabelle 2) und pSKAP-Vorlage vor. Stellen Sie den Thermocycler so ein, dass er folgendes durchführt: 1) 98 °C für 30 s, 2) 98 °C für 10 s, 56 °C für 15 s, 72 °C für 2 min, 3) Wiederholungsschritte 2, 24-fach, 4) 72 °C für 5 min, 5) bei 4 °C halten.
  15. Nach Abschluss der PCR, deplete pSKAP-Vorlage durch Hinzufügen des Restriktionsenzyms Dpn I zur Reaktion. Bei 37 °C für 20 min inkubieren.
    HINWEIS: Produkte von PCR sollten auf einem Agarose-Gel visualisiert werden, um die Größe und Reinheit des Produkts zu überprüfen. Eine Kontroll-Dpn-I-Verdauung, die aus der unveränderten pSKAP-Vorlage besteht, kann in nachfolgenden Schritten durchgeführt und verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Vorlagen-DNA vollständig verdaut wird.
  16. Verwenden Sie 5 l des Produkts ab Schritt 1,15, um 100 l kommerziell chemisch kompetente DH5-Zellen gemäß den Empfehlungen des Herstellers umzuwandeln.
  17. Transformanten auf LB-Agarplatten verteilen, die mit 25 g/ml Chloramphenicol ergänzt werden, und über Nacht bei 37 °C brüten.
  18. Wählen Sie eine Kolonie (oder Kolonien) aus Nachtplatten und streifen Sie auf einzelne LB-Agarplatten, die mit 25 g/ml Chloramphenicol ergänzt werden, und brüten Sie bei 37 °C über Nacht. Wählen Sie eine Kolonie aus Nachtplatten und verwenden Sie, um 5 ml LB-Brühe zu impfen, ergänzt mit 25 g/ml Chloramphenicol. Inkubieren Kultur(en) über Nacht bei 37 °C mit ständiger Agitation.
  19. Verwenden Sie ein kommerzielles Plasmid-Miniprep-Kit, um Plasmide aus der Nachtkultur zu reinigen.
  20. Sanger-Sequenz gereinigte Plasmide mit dem M13 Forward Sequenzierungsprimer (Tabelle 2). Vergleichen Sie mutierte Region mit dem ursprünglichen Plasmid und bewerten Sie die SDM-Einfügegenauigkeit.
  21. Nach bestätigung der Barcode-Einfügung und Genauigkeit, weisen Sie jedem Barcode und Plasmid einen Namen.
    HINWEIS: Barcodes, die bisher generiert wurden, haben eine zweistellige Bezeichnung zugewiesen: AA, AB, AC, ..., BA, BB, BC, etc. Barcoded-Plasmide werden als pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC, ..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC usw. bezeichnet.
  22. Wiederholen Sie die Schritte 1.14-1.21, um die gewünschte Anzahl von DNA-Barcodes zu generieren.

2. DNA Barcode auf das Chromosom von S einführen. Typhimurium

HINWEIS: Einfügen von DNA-Barcodes in das S. Typhimuriumchromosom wird durch die Verwendung einer von Datsenko und Wanner14 beschriebenen allelischen Austauschmethode erreicht, die für den Einsatz in S modifiziert wurde. Typhimurium.

  1. Bestimmen Sie den Ort auf dem S. Typhimurium-Genom, bei dem der DNA-Barcode eingefügt werden soll (Abbildung 3).
    HINWEIS: Wählen Sie einen großen, intergenen Bereich des Chromosoms aus. Vermeiden Sie Regionen, die nicht-kodierende RNA produzieren. Diese Studie nutzte einen Ort nach dem Put P zwischen den Rückständen 1.213.840 und 1.213.861 (ermittelt aus der Genombaugruppe GCA_000022165.1). Diese Region wurde zuvor genetisch manipuliert, da gene15transkomplementiert wurden. Alternativ könnte ein DNA-Barcode eingeführt werden, während gleichzeitig ein Gen von Interesse gestört wird. Dies würde minimale Änderungen an diesem Protokoll erfordern und die erstellung von Mutanten optimieren.
  2. Entwerfen Sie PCR-Primer, um den einzigartigen Barcode und das FRT-flankierte Kanamycin-Resistenzgen aus dem gewünschten pSKAP-Barcode-haltigen Plasmid aus Schritt 1.21 (Tabelle 2) zu verstärken. Fügen Sie 40-Nukleotid-Erweiterungen, die homologe sind, zu der Region hinzu, die in Schritt 2.1 ausgewählt wurde, bis zum 5' Ende jedes Primers (Tabelle 2).
  3. Führen Sie die Verstärkung mit einer kommerziellen High-Fidelity-Polymerase, den Primern ab Schritt 2.2 und dem gewünschten pSKAP-Barcode-haltigen Plasmid als Vorlage durch. Stellen Sie den Thermocycler so ein, dass er folgendes durchführt: 1) 98 °C für 30 s, 2) 98 °C für 10 s, 3) 56 °C für 15 s, 4) 72 °C für 60 s, Wiederholungsschritte 2-4 29-mal, 5) 72 °C für 5 min, 6) bei 4 °C halten.
  4. Nach Abschluss der PCR, deplete Template DNA mit DpnI, wie in Schritt 1.15 beschrieben. Reinigen und konzentrieren Sie die DNA mit einem kommerziellen DNA-Reinigungskit nach den Spezifikationen des Herstellers.
  5. Siehe das zuvor veröffentlichte Protokoll zum Generieren von Mutanten in S. Typhimuriumstamm 14028s aus PCR-Produkten14,16,17,18.
    HINWEIS: Es ist nicht unbedingt notwendig, dass das Kanamycinresistenzgen aus dem Chromosom entfernt wird. Die Exzision des Gens ist jedoch minimal störend für das bakterielle Chromosom, da es zu einer 129 bp Narbe führt, die potenzielle nachgeschaltete Gene im Rahmen belassen würde. Es wird empfohlen, dass der Stamm, der das Kanamycin-Resistenzgen enthält, beibehalten wird, da er verwendet werden kann, um Barcodes zwischen Stämmen über P22-vermittelte Transduktion zu bewegen.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 – 2.5, um die gewünschten Stämme mit den entsprechenden Barcodes zu erstellen.
    HINWEIS: Barcodes können in den Wildtyp S eingeführt werden. Typhimurium, das dann weiteren genetischen Manipulationen ausgesetzt werden kann, oder Barcodes können in Stämme eingeführt werden, die zuvor genetisch verändert wurden.

3. Bakterielle Wachstumsbedingungen und In-Vitro-Wettbewerbstests

  1. Aus Bakterienbestand, Streifen gewünscht S. Typhimurium-Stämme, die jeweils einen einzigartigen DNA-Barcode auf LB-Agarplatten beherbergen. Teller über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  2. Wählen Sie aus jedem Stamm eine einzelne Kolonie aus und impfen Sie 5 ml LB-Brühe. 20 h bei 37 °C bei konstanter Rührung inkubieren.
    HINWEIS: Fahren Sie mit der Nachtkultur schritt 3.5, um reine genomische DNA (gDNA) aus jedem Barcode-Stamm zu sammeln. Dies ist für nachfolgende Validierungs- und Kontrollexperimente in Abschnitt 6 erforderlich.
  3. Übertragen Sie für jeden Wettbewerbstest ein gleiches Volumen jeder Nachtkultur in eine entsprechend große sterile Röhre. Durch kräftiges Wirbeln für mindestens 5 s die Stämme gründlich vermischen.
    HINWEIS: Das Volumen jeder zu übertragenden Nachtkultur sollte für jede Bedingung und Replikation sowie für die Isolierung von gDNA zur Quantifizierung des Eingangs ausreichen. Obwohl es nicht unbedingt notwendig ist, die optische Dichte von Kulturen zu messen, da die absolute Anzahl der Eingangsmikroorganismen mit Hilfe der digitalen PCR quantifiziert wird, sollte die Anzahl der Eingangsbakterien für jeden Stamm ungefähr gleich sein, um Engpässe zu vermeiden oder ungleiche Konkurrenz zu Beginn des Experiments. Repräsentative Wettbewerbsassays in diesem Protokoll verglichen Wachstumsraten von 8 Stämmen gleichzeitig. Für einzelne Versuchsentwürfe können zusätzliche oder weniger Stämme erforderlich sein.
  4. 100 l des gemischten Inokulums in 4,9 ml sterile LB-Brühe übertragen. Bei 37 °C für die gewünschte Zeit oder auf eine gewünschte optische Dichte inkubieren.
  5. Ernten Sie 500 l des Inokulums durch Zentrifugation bei >12.000 x g für 1 min. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Fahren Sie sofort mit Abschnitt 4 mit den Zellen fort.
  6. Entfernen Sie zu den gewünschten Zeitpunkten 500 L-Aliquots der Kultur und ernten Sie Zellen durch Zentrifugation bei >12.000 x g für 1 min. Entfernen und entsorgen Sie überstand.
    HINWEIS: Wenn Sie Aliquots an mehreren Zeitpunkten sammeln, frieren Sie Pellets bei -20 °C ein oder fahren Sie sofort nach jeder Sammlung mit Schritt 4.1 fort.

4. Sammeln und Quantifizieren von gDNA aus S. Typhimurium (ab den Schritten 3.5 und 3.6)

  1. Ernte gDNA aus Zellen mit einem kommerziellen gDNA-Reinigungskit. Wenn verfügbar, führen Sie den optionalen RNA-Erschöpfungsschritt aus.
    HINWEIS: RNA-Erschöpfung ist nicht notwendig; Das Vorhandensein von RNA erhöht jedoch künstlich die DNA-Konzentration, was zu abnormen Berechnungen in späteren Schritten führt. Wenn Sie ein kommerzielles gDNA-Reinigungskit verwenden, befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers, um sicherzustellen, dass die Säule nicht mit DNA überlastet ist. Es ist keine minimale DNA-Konzentration erforderlich, wenn die Probe in späteren Schritten quantifizierbar ist.
  2. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die DNA in jeder Probe zu quantifizieren.
    HINWEIS: DNA kann mit jeder zuverlässigen Methode quantifiziert werden.
  3. Berechnen Sie die gDNA-Kopiernummer basierend auf der bakteriellen Genomgröße mit der folgenden Gleichung, wobei: X die Menge der DNA in ng und N die Länge eines doppelsträngigen DNA-Moleküls (die Genomgröße) ist.
    figure-protocol-13579
    HINWEIS: 660 g/Mol wird als durchschnittliche Masse von 1 DNA bp verwendet. Je nach Nukleotidzusammensetzung des Organismus können kleine Variationen vorhanden sein. Zahlreiche Rechner stehen online zur Verfügung, um die Berechnung durchzuführen.

5. Design Primer und Sonden für die quantitative Detektion von DNA-Barcodes über dDigital PCR

  1. Design-Primer, um den Barcode-Bereich des Szu verstärken. Typhimuriumchromosom nach dem PutP (Abbildung 3C und Tabelle 2).
    HINWEIS: Primer- und Sondendesigns können durch zahlreiche Online-Programme (Tabelle der Materialien) erleichtert werden. Wenn Barcodes alle an der gleichen Loci eingefügt werden, ist ein einziger Satz von Amplifikationsgrundierungen universell für alle Barcodes.
  2. Design 6-Carboxyfluorescein (FAM)-basierte und/oder Hexachlorfluorescein (HEX)-basierte Sonden spezifisch für jeden Barcode (Tabelle 2 und S1).
    HINWEIS: Der in diesem Experiment verwendete Tröpfchenleser ist in der Lage, sowohl FAM- als auch HEX-basierte Sonden gleichzeitig in einer Multiplex-Reaktion zu erkennen. Entwerfen Sie 1/2 der Sonden, um FAM und 1/2 zu verwenden, um HEX zu verwenden. Dies ist kein notwendiger Schritt, sondern reduziert den Einsatz von Reagenzien und die experimentellen Kosten, wenn sie umgesetzt werden.
  3. Erstellen Sie 20x Primer-Sonden-Master-Mischungen, die 1) 20 mM jeder Vorwärts- und Rückwärtsverstärkungsgrundierung, 2) 10 mM einer einzelnen FAM-Sonde und 3) 10 mM einer einzelnen HEX-Sonde (wenn Multiplexing) enthalten.

6. Validieren Sie die Empfindlichkeit und Spezifität jedes Pprimer-Sonden-Sets für jeden Genom-Barcode mit digitaler PCR

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die Validierung von acht eindeutigen Barcodes mit acht eindeutigen Sonden als Beispiel. Die Anzahl der verwendeten Barcodes kann erhöht oder verringert werden, um verschiedene experimentelle Designs aufzunehmen.

  1. Erstellen Sie einen Pool von gDNA, der jeden Barcode mit Ausnahme eines Barcodes enthält. Verwenden Sie diesen Pool als Verdünnungsmittel, um eine Verdünnungsserie mit gDNA durchzuführen, die den einzelnen verbleibenden Barcode enthält (Musterverdünnungsschema ist in Abbildung 4angegeben).
    HINWEIS: Die Verwendung von gepoolter gDNA als Verdünnungsmittel sorgt für einen konsistenten Hintergrund bei gleichzeitiger Ermittlung der Empfindlichkeit. Unter Verwendung der in Schritt 4.3 ermittelten Kopiernummern verdünnen Sie gDNA auf eine Kopiernummer innerhalb des empfohlenen digitalen PCR-Bereichs (1-100.000 Kopien pro 20-L-Reaktion). Beachten Sie, dass der Bereich für jedes einzelne Ziel (Barcode) festgelegt ist, nicht für die gesamte gDNA.
  2. Bereiten Sie Reaktionen für digitale PCR in doppelter Weise gemäß den Empfehlungen des Herstellers für die Verwendung eines digitalen PCR-Supermix für die sondenbasierte Chemie vor. Verwenden Sie die Mischungen aus Schritt 6.1 als Vorlagen-DNA. Verwenden Sie den 20x Primer-Sonden-Master-Mix aus Schritt 5.3, der die Sonde für den verdünnten Barcode in Schritt 6.1 enthält.
  3. Bereiten Sie Replizierbare Steuerungsreaktionen für digitale PCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers für die Verwendung eines digitalen PCR-Supermixs für die sondenbasierte Chemie vor. Kontrollreaktionen für jeden Sondenmix müssen aus 1) keinen Vorlagensteuerelementen (NTCs), 2) Negativkontrollen und 3) positiven Steuerelementen bestehen.
    HINWEIS: Die minimale Anzahl von Replikationskontrollreaktionen beträgt zwei. Dieses Beispielprotokoll verwendet vier NTCs, sechs Negative-Steuerelemente und sechs positive Steuerelemente für jeden Barcode. Negativkontrollen sollten gDNA mit jedem Barcode enthalten, mit Ausnahme des Barcodes, der der zu prüfenden Sonde entspricht. Dadurch wird die Spezifität der einzelnen Tests überprüft.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 6.1-6.3, um digitale PCR-Reaktionen für jedes barcoded gDNA-Beispiel zu erstellen. Eine Probenplattenanordnung ist in Abbildung 5dargestellt.
    HINWEIS: Diese und nachfolgende Schritte werden auf der Grundlage einer spezifischen digitalen PCR-Plattform beschrieben, die Tröpfchen und strömungsbasierte Technologie nutzt. Alternative digitale PCR-Plattformen, die Chip-basierte Technologie nutzen, können leicht durch geringfügige Änderungen an diesem Protokoll ersetzt werden. Schritt 6.4 kann mehr als eine 96-Well-Platte erfordern, um alle Primer-Sets zu validieren. Im Gegensatz zu qPCR können separate Platten, die von der digitalen PCR analysiert werden, ohne standardisierte Referenzbrunnen zwischen Platten problemlos verglichen werden.
  5. Generieren Sie Tröpfchen für jede Reaktionsbedingung mit einem Tröpfchengenerator gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  6. Neu angelegte Tröpfchen in die entsprechende 96-Well-Platte geben. Verwenden Sie 200 L Pipettenspitzen auf einer Mehrkanalpipette mit 5-50 l.
    HINWEIS: Beim Pipetieren von Tröpfchen, Pipette langsam und glatt! Der Hersteller digitaler PCR-Geräte empfiehlt, nur Pipetten und Pipettenspitzen eines bestimmten Herstellers (z.B. Ranin) zu verwenden. Diese Pipettenspitzen haben eine glatte Öffnung ohne mikroskopische Kunststofffragmente, die Tröpfchen zerstören oder die Mikrofluidik des Tröpfchenlesers beschädigen können. Zahlreiche Tipps-Marken wurden untersucht und beobachtet, um ein Spektrum an Fertigungsqualität zu haben. Äquivalente Ergebnisse wurden mit Pipettenspitzenalternativen erzielt; Bei abweichender Abweichung von den Empfehlungen des Herstellers ist jedoch Vorsicht geboten.
  7. Nachdem alle Tröpfchen erzeugt und übertragen wurden, versiegeln Sie die Platte mit einem Folienplattenversiegeler.
  8. Verwenden Sie den vom Hersteller empfohlenen Thermocycler, um die folgenden Zyklusbedingungen zu erfüllen: 1) 94 °C für 10 min; 2) 94 °C für 1 min, Rampenrate auf 1 °C/s eingestellt; 3) 55 °C für 2 min, Rampenrate auf 1 °C/s eingestellt; 4) Wiederholen Sie die Schritte 2 und 3 49 Mal; 5) 98 °C für 10 min; 6) bei 4 °C bis 24 h halten.
    HINWEIS: Die Wärmeübertragung in einer Tröpfchenreaktion ist nicht identisch mit der Standard-PCR. Reaktionsbedingungen können eine Änderung erfordern.
  9. Während Thermocycling durchgeführt wird, programmieren Sie die Datenanalyse-Software mit den Platten-Setup-Informationen wie Beispielname, Experimentiertyp (absolute Quantifizierung), Supermix verwendet, Ziel 1 Name (FAM-Barcode-Name), Ziel 1-Typ (NTC, positive Kontrolle, Negativsteuerelement oder unbekannt), Ziel-2-Name (HEX-Barcodename), Ziel-2-Typ (leer, positiv, negativ gesteuert oder unbekannt). Die informationen zum Einrichten der endgültigen Platte sind in Abbildung 5dargestellt.
  10. Nachdem das Thermocycling abgeschlossen ist, übertragen Sie die abgeschlossenen Reaktionen auf den Tröpfchenleser und starten Sie den Lesevorgang gemäß den Anweisungen des Herstellers.

7. Quantifizieren Sie die Anzahl der Bakterien in einem Wettbewerbsindex-Experiment

  1. Verdünnung der gDNA isoliert und quantifiziert von Abschnitt 4 auf eine geeignete Konzentration, wie oben beschrieben.
  2. Bereiten Sie Reaktionen für digitale PCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers für die Verwendung des entsprechenden Supermix. Verwenden Sie DNA aus Schritt 7.1 als Vorlage. Verwenden Sie einen 20-fachen Primer-Sonden-Master-Mix, der die Sonde (oder Sonden bei der Erkennung von FAM und HEX) für mögliche Barcodes enthält, die im Experiment vorhanden sind.
  3. Bereiten Sie zusätzliche digitale PCR-Reaktionen wie in Schritt 7.2 mit verschiedenen 20x Primer-Sonden-Master-Mixen vor, bis alle Barcodes, die im experimentellen Design verwendet werden, erkannt werden können.
  4. Fügen Sie Steuerelemente für jede Bedingung ein, wie in 6.3 beschrieben. Dazu gehören 1) keine Vorlagensteuerelemente (NTCs), 2) Negativsteuerelemente und 3) positive Steuerelemente.
  5. Fahren Sie mit dem Protokoll fort, wie in den Schritten 6.5-6.10 beschrieben.

8. Analysieren Sie digitale PCR-Daten und berechnen Sie absolute Kopiernummern

  1. Wenn alle Brunnen gelesen wurden und die Ausführung abgeschlossen ist, öffnen Sie die .qlp-Datendatei mit der Datenanalysesoftware.
    HINWEIS: Die hier beschriebenen Dateitypen und Datenanalyseverfahren sind spezifisch für einen digitalen PCR-Hersteller. Bei Verwendung alternativer digitaler PCR-Plattformen sind Dateitypen und Datenanalyseverfahren spezifisch für die verwendete Plattform und sollten gemäß den vom Hersteller empfohlenen Spezifikationen durchgeführt werden.
  2. Wählen Sie alle Brunnen aus, die den gleichen Primer-Sonden-Master-Mix verwenden.
  3. Untersuchen Sie auf der Registerkarte Tröpfchen die Anzahl der in jedem Brunnen analysierten Tröpfchen (sowohl positive als auch negative Tröpfchen). Schließen Sie alle Brunnen aus, der weniger als 10.000 Tröpfchen insgesamt enthält.
  4. Wechseln Sie zur Registerkarte 1D-Amplituden, und untersuchen Sie die Amplituden positiver und negativer Tröpfchen. Stellen Sie sicher, dass sie aus zwei unterschiedlichen Populationen bestehen.
  5. Verwenden Sie innerhalb der Software die Schwellenwertfunktion, um einen Grenzwert zwischen positiven und negativen Tröpfchen für jede verwendete Sonde vorzunehmen (Abbildung 6).
    HINWEIS: Alle Bohrungen, die den gleichen Primer-Sonden-Master-Mix aus Schritt 5.3 verwenden, sollten die gleichen Schwellenwerte haben.
  6. Sobald entsprechende Schwellenwerte auf alle Brunnen angewendet wurden, berechnet die Software die Anzahl der DNA-Kopien in jeder Reaktion. Exportieren Sie Daten in eine Kalkulationstabelle, um weitere Analysen zu erleichtern.
    HINWEIS: Die Datenanalysesoftware verwendet die Anzahl der positiven und negativen Tröpfchen, die zu einer Poisson-Verteilung passen, um die Kopiernummer zu bestimmen.
  7. Berechnen Sie anhand der Werte aus Schritt 8.6 die anfängliche Kopiernummer jedes eindeutigen genomischen Barcodes in der Probe. Bestimmen Sie die mittlere falsch-positive Rate von den negativen Kontrollreaktionen und subtrahieren Sie diesen Wert von den Werten, die in experimentellen Reaktionen erhalten wurden. Multiplizieren Sie die Werte nach Bedarf basierend auf den Verdünnungen, die beim Einrichten jedes Experiments durchgeführt wurden (Tabelle 3).

9. Bestimmen Sie die relative Fitness eines Organismus durch Berechnung des CI oder COI aus digitaler PCR-basierter Quantifizierung von Barcoded-Stämmen

  1. Berechnen Sie das CI eines Barcode-Stamms mit den folgenden Formeln, wobei: EinOutput ist die absolute Quantifizierung des Barcode-Stamms zu einem bestimmten Zeitpunkt, WTOutput ist die absolute Quantifizierung von Barcode-Wild-Typ-Bakterien an der gleichen Zeitpunkt ist AInput die absolute Quantifizierung des Eingangsinokulums des Barcode-Stamms, WTInput ist die absolute Quantifizierung des Eingangsinokulums von Barcode-Wild-Typ-Bakterien, XOutput ist die Summierung aller Stämme bei der gleiche Zeitpunkt ist XInput die Summe des gesamten Eingangsinokulums aller Barcode-Stämme.

figure-protocol-25396
figure-protocol-25465
HINWEIS: Sehen Sie sich die Diskussion für Vor- und Nachteile und die am besten geeignete Verwendung jeder Formel an.

  1. Wiederholen Sie Schritt 9.1 für jede Barcode-Dehnung zu allen Zeitpunkten.
  2. Berechnen Sie ggf. die COI anhand der folgenden Formeln: EinOutput ist die absolute Quantifizierung eines Barcode-Stamms mit mutiertem Gen A zu einem bestimmten Zeitpunkt, ABOutput ist die absolute Quantifizierung eines Barcode-Stamms. mit den mutierten Genen A und B gleichzeitig ist AInput die absolute Quantifizierung des Eingangsinokulums des Barcode-Stamms mit dem mutierten Gen A,ABInput ist die absolute Quantifizierung des Eingangsinoculums Barcode-Stamm mit mutierten Genen A und B, BOutput ist die absolute Quantifizierung eines Barcode-Stamms mit mutiertem Gen B zu einem bestimmten Zeitpunkt, undB-Eingang ist die absolute Quantifizierung des Eingangs Inokulum des Barcode-Stamms mit mutiertem Gen B.

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UND/ODER
figure-protocol-26742

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Ergebnisse

Die Anwendung dieser Methode erfordert, dass geeignete Kontrollreaktionen durchgeführt werden, um die Empfindlichkeit und Spezifität jeder Sonde zu validieren, die zur Identifizierung der Ziel-DNA verwendet wird. In diesem repräsentativen Experiment haben wir acht eindeutige DNA-Barcodes mit den acht entsprechenden Sonden zur Identifizierung validiert. Alle acht Sonden wiesen sowohl bei NTC als auch bei negativen Kontrollreaktionen eine geringe Rate falscher Positivwerte auf (T...

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Diskussion

Die Fähigkeit, Mikroorganismen genau zu quantifizieren, ist für die mikrobiologische Forschung von größter Bedeutung, und die Fähigkeit, einzigartige Stämme aus einer anfänglichen gemischten Population aufzuzählen, hat sich als ein unschätzbares Instrument zur Bewertung von Fitness- und Virulenzmerkmalen in bakterien. Die Techniken dazu sind jedoch nicht im Schritttempo mit den modernen Entwicklungen in der Molekularbiologie vorangekommen. Die Technologie, um die Chromosomen vieler Bakterien, einschließlich

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom George F. Haddix President es Faculty Research Fund und dem National Institute of General Medical Science der National Institutes of Health (NIH) unter der Nummer GM103427 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesEppendorf22600028Procure from any manufacturer
16 mL culture tubesMidSci8599Procure from any manufacturer
5-200 μL pipette tipsRAININ30389241Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality
5-50 μL multichannel pipetteRAININ17013804Use alternative multichannel pipettes with caution
AgaroseThermoFisher ScientificBP160-500Procure from any manufacturer
BLAST AnalysisNCBIN/Ahttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction ModuleBio Rad1851197Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Chemically competent DH5αInvitrogen18258012Procure from any manufacturer or prepare yourself
ChloramphenicolThermoFisher ScientificBP904-100Procure from any manufacturer
Cytation5 Microplate readerBioTekCYT5MFProcure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro)Bio RadN/AMust procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR 96-Well PlatesBio Rad12001925Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Droplet Reader OilBio Rad1863004Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)Bio Rad1863024Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet GeneratorBio Rad1864008Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet GeneratorBio Rad1863009Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Droplet Generation Oil for ProbesBio Rad1863005Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
KanamycinThermoFisher ScientificBP906-5Procure from any manufacturer
Luria-Bertani agarThermoFisher ScientificBP1425-2Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl
Luria-Bertani brothThermoFisher ScientificBP1426-2Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceableBio Rad1814040Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
PCR TubesEppendorf951010022Procure from any manufacturer
Petri dishesThermoFisher ScientificFB0875712Procure from any manufacturer
pPCR Script Cam SK+Stratagene/Agilent211192No longer available commercially
Primer/Probe DesignIDTN/Ahttps://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP and pSKAP_BarcodesAddgenePlasmid numbers 122702-122726www.addgene.org
PX1 PCR Plate SealerBio Rad1814000Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet GeneratorBio Rad1864002Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet ReaderBio Rad1864003Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Salmonella typhimurium strain ATCC 14028sATCCATCC 14028swww.atcc.org
Take3 Micro-Volume PlateBioTekTAKE3Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHIThermoFisher ScientificFERFD0054Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest DpnIThermoFisher ScientificFERFD1704Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest HindIIIThermoFisher ScientificFERFD0504Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro KitThermoFisher ScientificFERK0832Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Miniprep KitThermoFisher ScientificFERK0503Procure from any manufacturer
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseThermoFisher ScientificF534LProcure from any manufacturer
Thermo Scientific T4 DNA LigaseThermoFisher ScientificFEREL0011Procure from any manufacturer
ThermocyclerBio Rad1861096Procure from any manufacturer
UVP Visi-Blue TransilluminatorThermoFisher ScientificUV95043301Or other transiluminator that allows visualization of DNA
Water, Molecular Biology GradeThermoFisher ScientificBP28191Procure from any manufacturer

Referenzen

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