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Method Article
살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수
요약
세균 적합성을 결정하기 위한 이 분자 기반 접근법은 디지털 PCR을 통해 정량화되는 독특한 게놈 DNA 바코드를 사용하여 미생물을 정확하고 정확하게 검출할 수 있도록 합니다. 프로토콜은 살모넬라 균주에 대한 경쟁 지수를 계산하는 것을 설명합니다. 그러나 이 기술은 유전적으로 가단성 유기체의 절대 정량화를 요구하는 프로토콜에 쉽게 적응할 수 있습니다.
초록
경쟁 지수는 세균적 적합성 및/또는 독성을 평가하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 접근법의 유용성은 수행하기 쉽고 야생 형 유기체에 많은 균주의 적합성을 표준화하는 능력에 의해 예시됩니다. 이 기술은 그러나, 유효한 자형표 마커 및 동시에 평가될 수 있는 긴장의 수에 의해, 복제 실험의 큰 숫자에 대한 필요를 만드는 제한됩니다. 많은 수의 실험과 동시에, 자형표 마커에 기초한 박테리아를 정량화하기 위한 인건비 및 재료 비용은 중요하지 않다. 긍정적인 양상을 유지하면서 이러한 부정적인 측면을 극복하기 위해, 우리는 세균 염색체에 유전 마커를 엔지니어링 한 후 미생물을 직접 정량화하는 분자 기반 접근법을 개발했습니다. 독특한, 25 염기 쌍 DNA 바코드는 살모넬라의야생 형 및 돌연변이 균주의 염색체에 무해한 궤적에 삽입되었다. 시험관내 경쟁 실험은 풀링된 균주로 구성된 이노큘라를 사용하여 수행하였다. 경쟁 후, 각 스트레인의 절대 숫자는 디지털 PCR을 사용하여 정량화하고 각 변형에 대한 경쟁 지수는 그 값에서 계산되었다. 우리의 데이터는 살모넬라정량화에 대한 이 접근법이 매우 풍부하고 정확하며, 매우 풍부하고(높은 체력) 및 희귀(낮은 피트니스) 미생물을 모두 검출하는 데 매우 민감하고 정확하며 정확하다는 것을 나타냅니다. 또한,이 기술은 미생물의 절대 정량화를 필요로하는 다양한 실험 설계뿐만 아니라 수정 할 수있는 염색체를 가진 거의 모든 유기체에 쉽게 적응 할 수 있습니다.
서문
병원성 유기체의 적합성 과 독성을 평가하는 것은 미생물학 연구의 근본적인 양상입니다. 그것은 균주 사이 또는 돌연변이된 유기체 사이 비교를 가능하게 합니다, 이는 연구원이 특정 조건의 밑에 특정 유전자의 중요성을 결정하는 것을 허용합니다. 전통적으로, 독성 평가는 다른 세균성 긴장을 사용하여 감염된 동물의 결과를 관찰하는 감염의 동물 모형을 이용합니다 (예를 들면 감염성 복용량50,치명적인 복용량50,죽음에 시간, 현상 엄격, 부족의 증상 등) 이 절차는 독성에 대한 귀중한 설명을 제공하지만 야생 형의 변화를 감지하기 위해 결과에 상당한 차이를 일으키기 위해 균주가 필요합니다. 더욱이, 결과는 질병 진행및 현상 엄격이 시간이 지남에 따라 주관적으로 정량화될 수 있기 때문에, 야생 형에 비교된 독성의 해석은 더 질적입니다 (즉, 더, 더 적게, 또는 동등하게 악성). 동물 감염 성 검사를 수행하는 일반적인 대안은 경쟁 지수 (CIs)를 생성하는 것입니다, 직접 혼합 감염에서 야생 형 대응에균주의 적합성 또는 독성을 비교값 1. 이 기술은 야생 형 균주에 독성을 표준화하고 감쇠정도를 반영하는 정량적 값을 결정함으로써 감염의 전통적인 동물 모델에 비해 많은 장점을 갖는다. 이 기술은 또한 취소된 경쟁 지수(COI) 2를 결정함으로써 박테리아에서의유전자 상호작용을 분석하기 위해 적응될 수 있다. 돌연변이 된 유기체의 그룹에 대한 COI를 계산하면 연구원은 두 유전자가 독립적으로 발병 기전에 기여하는지 또는 동일한 독성 경로에 관여하고 서로 의존하는지 여부를 결정할 수 있습니다. 추가적으로, CI를 계산하는 것은 유기체의 병인에 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 박테리아의 열거를 요구합니다. C와 COIs는 또한 연구원이 임상 질병을 일으키지 않지만 여전히 체력에 차이가있는 avirulent 균주를 어지러이로 할 수 있습니다. 이 기술은 긴장을 확인하기 위하여 전통적인 항생 저항 마커의 사용에 의해 제한되고, 따라서 입력 긴장의 수를 한 번에 하나 또는 두개로 제한합니다. 이러한 제한으로 인해 많은 수의 실험 그룹과 복제가 필요하며, 이는 인건비와 재료 비용을 추가하는 것 외에도 실험 조건의 가변성과 부정확한 결과의 변동성을 증가시킵니다. (독성, 피트니스 및 유전자 상호 작용을 연구하기 위해 혼합 감염을 사용하는 이점과 응용 프로그램에 대한 철저한 검토는 C.R. Beuzón 및 D.W. Holden 1참조)
이러한 한계를 극복하기 위한 시도가 이루어지고 있으며, 형광 표지세포의 사용이 유세포분석3,4,5를통해 정량화되었다. 이 기술은 1) 표지된 항체를 사용하여 세포에 자형표 또는 2) 내인성 형광 단백질을 생성하여 정량화합니다. 표지된 항체의 사용은 1,000 개의 세포 / mL의 검출한계를 가지고 있으며,따라서 3을 분석하기 위해 많은 수의 세포가 필요합니다. 형광 성 단백질을 발현하는 세포는 변형된 생리학을 가지며 고단백 발현으로 인한 체력 변화에 취약하다6. 두 방법 모두 유세포측정법을 사용하여 검출가능한 형광 마커의 수에 의해 제한된다. 분자 정량화의 발전은 뮤린 모델7에서1,000 개 이상의 균주의 초기 혼합 감염에서 120 개의 균주에서 감쇠를 감지하는 마이크로 어레이 기술의 개발을 통해 달성되었습니다. 이 기술은 결과에 있는 상당한 가변성으로 이끌어 내는 돌연변이된 긴장에서 RNA의 마이크로어레이 분석을 이용했습니다. 그럼에도 불구하고, 그것은 혼합 된 감염의 큰 풀이 유용한 도구가 될 수 있으며 민감한 검출 기술을 활용하여 세균 독성의 차이를 식별 할 수 있음을 확립했습니다. 차세대 염기서열 분석의 발달로 Tn-seq는 트랜스포종 돌연변이의 유용성을 확장하여 무작위로 돌연변이된 박테리아를 정량화하는강력한 방법을 8,9,10, 11. 트랜스포손의 필요성을 제거하고 대신 DNA 바코드를 사용하여 게놈 변화와 피트니스에 미치는 영향을 보다 쉽게 식별하고 추적하는 대체 프로토콜이 최근에 개발되었습니다12. 이 기술은 중요한 발전이지만 게놈 바코드의 삽입은 여전히 임의의 과정입니다. 이전 실험의 무작위성을 극복하기 위해, Yoon et al.은 박테리아13의염색체 상에서 정확한 위치에 삽입된 독특한 DNA 바코드를 사용하여 살모넬라 균주의 CI를 계산하는 방법을 개발하였다. 고유한 바코드 균주는 각 고유 바코드에 특적인 SYBR 녹색 및 프라이머를 사용한 qPCR 기반 방법을 사용하여 검출되었습니다. 이 기술은 프라이머 효율성의 차이와 낮은 감도를 포함하여 qPCR에 의해 부과된 제약 조건에 의해 제한되었으며, qPCR 이전에 중첩-PCR의 필요성이 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고, 이 접근은 표적으로 한 게놈 수정이 다중 세균성 긴장의 풀을 검출하고 잠재적으로 정량화하기 위해 이용될 수 있었다는 것을 보여주었습니다.
다음 프로토콜에서, 우리는 매우 민감한 디지털 PCR 기술을 사용하여 정확한 정량화 뒤에 혼합 inocula의 큰 풀과 세균 경쟁 실험을 수행하는 새로운 방법론을 설명합니다. 프로토콜은 염색체의 무해한 지구에 삽입된 유일한 DNA 바코드를 가진 유전으로 표지하는 세균성 긴장을 관련시킵니다. 이 수정을 통해 기존 직렬 희석, 복제 도금 및 표현형 마커(즉, 항생제 내성)에 의존하는 식민지 형성 단위 를 계산하는 대신 현대 분자 기술을 사용하여 균주를 빠르고 정확하게 정량화할 수 있습니다. ). 수정은 모든 균주가 정확한 동일한 조건에 노출되기 때문에 단일 풀화 접종에서 많은 균주의 동시 평가를 허용, 실질적으로 실험 가변성의 가능성을 감소. 또한, 이 기술은 살모넬라 장테리카 혈청염에서 개발되었지만, 모든 유전적으로 가단성 유기체및 정확한 세균 수가 필요한 거의 모든 실험 설계에 매우 적응력이 있어 새로운 이전 방법에 의해 부과 된 제약없이 미생물학 실험실의 정확성과 처리량을 높이기 위한 도구입니다.
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프로토콜
1. 고유 DNA 바코드를 플라스미드에 통합하여 전기 교환에 필요한 구성 요소를 포함
참고: 기존 pKD13 알릴릭 교환 플라스미드에 비해 카피 수가 높고 변환 효율이 향상된 pSKAP라는 새로운 플라스미드가 만들어졌습니다. 이는 단계 1.1-1.12(도1)에 기재되어 있다. 독특한 DNA 바코드와 알레르산화 를 위한 성분을 포함하는 최종 화된 플라스미드는 플라스미드 저장소(재료 표)를 통해 사용할 수 있습니다.
- 상업용 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 pKD1314 및 pPCR 스크립트 캠 SK+를 루리아-베르타니 (LB) 국물에서 재배한 밤새 세균 배양물에서 50 μg/mL 카나마이신 또는 25 μg/mL 클로람페니콜(pKD13 및 pPCR 스크립트 캠용)으로 보충 SK+, 각각)(표 1).
- 제조 업체의 사양에 따라 상업적 제한 효소 힌드 III와 BamHI를 사용 하 여 두 플라스미드에 제한 소화를 수행 합니다.
- pPCR 스크립트캠 SK+반응에서 제한 효소 및 절제된 DNA를 제거하고 제조사의 사양에 따라 시판되는 DNA 클린업 키트를 사용하여 3,370염기 쌍(bp) 플라스미드 백본을 정화한다.
- pKD13 제한 소화로부터 단편을 전기 동공 챔버를 사용하여 1% 아가로즈 겔상에서 분리한다.
- 청색광 트랜지칠레이터를 사용하여 밴드를 시각화하고 겔로부터 1,333 bp 의단편을 절제한다(도 1C).
참고: 이 단편은 염색체 말투모 대체를 위해 요구되는 FRT 측면 카나마이신 저항 유전자를 포함합니다. - 상용 겔 추출 키트를 사용하여 1.5단계에서 절제된 DNA를 정제한다.
- pSKAP를 생성하려면, pKD13(1.6단계)으로부터 정제된 단편을 pPCR 스크립트 캠 SK+(1.3단계에서)로 리게이트하여 제조사의 사양에 따라 상용 T4 DNA 리가아를 사용한다.
- 제조자의 프로토콜에 따라 결찰된 pSKAP 플라스미드로 화학적으로 유능한DH5α 세포를 변형시킨다(표 1).
- LB 한천 플레이트에 50 μg/mL 카나마이신을 보충하고 밤새 37°C에서 배양하여 형질전환제를 퍼뜨입니다.
- 접시에서 식민지를 선택하고 50 μg / mL 카나마이신으로 보충 된 새로운 LB 한천 접시에 줄무늬를 하고 37 °C에서 밤새 배양합니다. 이 접시에서 식민지를 골라 LB 국물을 50 μg/mL 카나마이신으로 보충한 접종에 사용하십시오. 일정한 교반으로 37°C에서 밤새 배양한다.
- 상업용 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 밤새 세균 배양으로부터 pSKAP를 정화합니다.
- 제조업체의 사양에 따라 Hind III 및 Bam HI를 사용하여 1.11 단계에서 플라스미드의 진단 제한 소화를 수행합니다. 단계 1.4-1.5에서와 같이 1% 아가로즈 겔에 단편을 시각화합니다.
참고: pSKAP 총 크기는 4,703 bp여야 합니다. - PSKAP의 위치(725)에서 독특한 25-염기쌍 DNA 서열을 삽입하는 방식으로 삽입 부위 지시 돌연변이 발생(SDM)(표2 및 S1)을위한 PCR 프라이머를 설계한다(도 2).
참고: 바코드 DNA는 FRT 측면 카나마이신 내성 유전자 바로 바깥쪽에 플라스미드에 삽입되므로 가나마이신 저항 성 카세트를 후속 제거하는 동안 바코드가 손실되지 않습니다. 새로운 바코드 시퀀스를 생성하는 경우 온라인 도구를 사용하여 형광 표지된 표적 별 PCR 프로브(이하 "프로브"라고 함)가 새 시퀀스에 효율적으로 바인딩되도록 합니다. 현재까지 설계된 삽입 시퀀스와 이를 만드는 데 필요한 프라이머가 표 2 및 S1에제공됩니다. - 상업적이고 고충실도 DNA 폴리머라제, 원하는 프라이머 쌍(표2)및 pSKAP 템플릿을 사용하여 SDM 반응을 준비한다. 열사이클러를 설정하여 30초동안 98°C, 2) 10s의 경우 98°C, 15초동안 56°C, 2분 동안 72°C, 3) 반복단계 2, 24회, 4) 5분 동안 72°C, 5) 4°C에서 유지한다.
- PCR이 완료된 후, 반응에 제한 효소 Dpn I를 첨가하여 pSKAP 템플릿을 고갈시. 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
참고: PCR에서 제품 크기와 제품의 순도를 확인 하기 위해 아가로즈 젤에 시각화 해야 합니다. 수정되지 않은 pSKAP 템플릿으로 구성된 대조군 Dpn I 소화를 수행하고 템플릿 DNA가 완전히 소화되도록 하기 위해 후속 단계에서 사용될 수 있다. - 1.15단계에서 제품의 5 μL을 사용하여 제조업체의 권고에 따라 상업적으로 유능한 DH5α 세포의 100 μL을 변형시킵니다.
- LB 한천 플레이트에 25 μg/mL 클로람페니콜을 보충하고 밤새 37°C에서 배양하여 형질전환제를 발라주시킵니다.
- 하룻밤 접시에서 콜로니 (또는 콜로니)를 선택하고 25 μg / mL 클로람페니콜로 보충 된 개별 LB 한천 플레이트에 줄무늬를 하고 37 °C에서 밤새 배양하십시오. 하룻밤 접시에서 식민지를 선택하고 25 μg / mL 클로람페니콜로 보충 된 LB 국물 5 mL을 접종하는 데 사용합니다. 일정한 교반을 가진 37°C에서 밤새 배양 배양체.
- 상업용 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 야간 배양물로부터 플라스미드를 정화합니다.
- Sanger 서열정제는 M13 전방 염기서열 분석 프라이머를 사용하여 플라스미드를 정제하였다(표 2). 돌연변이 된 영역을 원래 플라스미드와 비교하고 SDM 삽입 정확도를 평가합니다.
- 바코드 삽입 및 정확성을 확인한 후 각 바코드와 플라스미드이름을 지정합니다.
참고: 현재까지 생성된 바코드에는 AA, AB, AC, ..., BA, BB, BC 등 두 글자로 지정되어 있습니다. 바코드 플라스미드는 pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC, ..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC 등으로 표시됩니다. - 1.14-1.21 단계를 반복하여 원하는 DNA 바코드 수를 생성합니다.
2. S의 염색체에 DNA 바코드를 소개합니다. 티피무리움
참고: S에 DNA 바코드 삽입. 티피무륨 염색체는 Datsenko 및 Wanner14에 의해 기술된 말조 교환 방법을 사용하여 S에서 사용하기 위해 수정된 것을 달성한다. 티피무리움.
- S의 궤적을 결정합니다. DNA 바코드를 삽입하는 티피무륨 게놈(도 3).
참고: 염색체의 큰, 간 내성 영역을 선택합니다. 비코딩 RNA를 생성하는 영역은 피하십시오. 본 연구는 잔기 1,213,840과 1,213,861(게놈 어셈블리 GCA_000022165.1로부터 결정)사이에 P를 넣어의 궤적 다운스트림을 이용하였다. 이 지역은 이전에 유전자15의트랜스 보완을 위해 유전으로 조작되었습니다. 양자택일로, DNA 바코드는 동시에 관심의 유전자를 중단하는 동안 소개될 수 있었습니다. 이렇게 하려면 이 프로토콜을 최소한으로 변경하고 돌연변이 생성을 간소화해야 합니다. - 원하는 pSKAP 바코드 함유 플라스미드로부터 독특한 바코드 및 FRT 측면 카나마이신 내성 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머를설계1.21단계(표 2). 단계 2.1에서 선택된 영역에 상동되는 40-뉴클레오티드 확장을 각 프라이머의5' 말단에 추가한다(표 2).
- 상용 고충실도 폴리머라제, 단계 2.2로부터의 프라이머, 및 원하는 pSKAP 바코드 함유 플라스미드를 템플릿으로 사용하여 증폭을 수행한다. 열사이클러를 설정하여 30초동안 98°C, 2) 10s의 경우 98°C, 3) 15s의 경우 56°C, 4) 60초동안 72°C, 반복단계 2-4 29회, 5분 동안 72°C, 6) 4°C에서 유지한다.
- PCR의 완료 후, 단계 1.15에 기재된 바와 같이 DpnI를 사용하여 템플릿 DNA를 고갈시다. 제조업체의 사양에 따라 상업용 DNA 정화 키트를 사용하여 DNA를 정화하고 농축합니다.
- S. PCR 제품 14,16,17,18에서티피무륨 균주14028s.
참고: 카나마이신 내성 유전자가 염색체로부터 절제되는 것은 필수적이지 않습니다. 그러나, 유전자의 절제는 잠재적인 다운스트림 유전자를 프레임에 남겨둘 129 bp 흉터 귀착되는 세균성 염색체에 최소한으로 파괴적입니다. 가나마이신 내성 유전자를 함유하는 균주는 P22 매개 트랜스덕션을 통해 균주 간에 바코드를 이동하는 데 사용될 수 있으므로 유지되는 것이 좋습니다. - 2.3 – 2.5 단계를 반복하여 적절한 바코드로 원하는 균주를 만듭니다.
참고: 바코드는 야생 형 S에 도입 될 수있다. 그 때 추가 유전 조작을 복종될 수 있는 Typhimurium, 또는 바코드는 이전에 유전으로 변경된 긴장으로 소개될 수 있습니다.
3. 세균 성장 조건 및 시험관 내 경쟁 어 세
- 박테리아 스톡, 줄무늬 희망 S. 티피무리움 균주는 각각 LB 한천 플레이트에 독특한 DNA 바코드를 품고 있습니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 인큐베이트 플레이트.
- 각 균주에서 단일 콜로니를 선택하고 LB 국물의 5 mL을 접종하십시오. 일정한 교반과 37 °C에서 20 시간 동안 배양.
참고: 하룻밤 배양을 사용하여, 각 바코드 균주로부터 순수한 게놈 DNA(gDNA)를 수집하기 위해 3.5단계로 진행한다. 이는 섹션 6의 후속 유효성 검사 및 제어 실험에 필요합니다. - 각 경쟁 분석에 대해, 각 하룻밤 배양물의 동일한 부피를 적절한 크기의 멸균 튜브로 옮김을 옮김. 철저하게 적어도 5 s에 대한 적극적으로 소용돌이에 의해 함께 균주를 혼합.
참고: 전송하는 각 하룻밤 배양의 부피는 입력을 정량화하기 위해 gDNA를 분리할 뿐만 아니라 각 조건에 대해 충분해야 하며 복제되어야 합니다. 절대 입력 미생물이 디지털 PCR을 사용하여 정량화되기 때문에 배양물의 광학 밀도를 측정하는 것이 전적으로 필요한 것은 아니지만, 각 균주에 대한 입력 박테리아의 수는 병목 현상을 피하기 위해 거의 같아야 합니다. 실험 초기에 불평등한 경쟁을 펼쳤다. 이 프로토콜의 대표적인 경쟁 분석에서는 8종의 성장률을 동시에 비교했습니다. 개별 실험 설계에 추가 또는 더 적은 균주가 필요할 수 있습니다. - 혼합 접종의 100 μL을 4.9 mL 멸균 LB 국물에 옮김. 원하는 시간 또는 원하는 광학 밀도로 37°C에서 배양합니다.
- 1 분 동안 >12,000 x g에서 원심 분리에 의해 접종의 500 μL을 수확하십시오. 세포와 함께 섹션 4로 즉시 진행하십시오.
- 원하는 시점에서 배양 및 수확 세포의 500 μL aliquots를 1 분 동안 >12,000 x g에서 원심 분리하여 제거하십시오.
참고: 여러 시점에서 알리쿼트값을 수집하는 경우, 펠릿을 -20°C에서 동결하거나 각 수집 후 즉시 4.1단계로 진행한다.
4. S에서 gDNA수집 및 정량화 티피무리움(3.5단계 및 3.6단계에서)
- 상업적인 gDNA 정제 키트를 사용하여 세포로부터 gDNA를 수확합니다. 가능한 경우 선택적 RNA 고갈 단계를 수행합니다.
참고: RNA 고갈은 필요하지 않습니다. 그러나 RNA의 존재는 인위적으로 DNA 농도를 증가시켜 후속 단계에서 비정상적인 계산으로 이어집니다. 상업용 gDNA 정제 키트를 사용하는 경우 제조업체의 권장 사항을 따라 컬럼이 DNA로 과부하되지 않도록 하십시오. 샘플이 후속 단계에서 정량화 할 수있는 경우 필요한 최소 DNA 농도가 없습니다. - 분광광도계를 사용하여 각 샘플의 DNA를 정량화합니다.
참고: DNA는 어떤 신뢰할 수 있는 방법을 사용하여 정량화될 수 있습니다. - 다음 방정식을 사용하여 세균 게놈 크기에 기초하여 gDNA 카피 수를 계산합니다: X는 ng에 있는 DNA의 양이고 N은 이중 가닥 DNA 분자의 길이 (게놈 크기)입니다.
참고 : 660 g / 두더지는 1 DNA bp의 평균 질량으로 사용됩니다. 수많은 계산기는 계산을 수행하기 위해 온라인으로 사용할 수 있습니다.
5. dDigital PCR을 통한 DNA 바코드의 정량적 검출을 위한 설계 프라이머 및 프로브
- S. putP의 티피무리움 염색체 다운스트림(도3C 및 표2).
참고: 프라이머 및 프로브 설계는 수많은 온라인프로그램 (재료 표)에 의해 촉진 될 수있다. 바코드가 모두 같은 로시에 삽입되는 경우 모든 바코드에 대해 단일 증폭 프라이머 세트가 보편적입니다. - 각 바코드에 특화된 6-카복플루오레세인(FAM) 기반 및/또는 헥사클로로플루오레세인(HEX) 기반 프로브를 설계합니다(표2 및 S1).
참고: 이 실험에 사용된 액적 리더기는 멀티플렉스 반응에서 FAM 및 HEX 기반 프로브를 동시에 검출할 수 있다. FAM과 1/2를 활용하여 HEX를 활용하는 프로브의 1/2를 설계합니다. 이는 필요한 단계는 아니지만 시약 사용 및 실험 비용을 감소시킬 것이다. - 1) 20 mM의 각 전진 및 역증폭 프라이머, 2) 단일 FAM 프로브의 10 mM, 3) 단일 HEX 프로브의 10 mM을 포함하는 20x 프라이머-프로브 마스터 믹스(멀티플렉싱하는 경우)를 확인한다.
6. 디지털 PCR을 사용하여 각 게놈 바코드에 대해 설정된 각 Pprimer-프로브세트의 민감도 및 특이성 검증
참고: 이 프로토콜은 8개의 고유한 프로브가 있는 8개의 고유 바코드의 유효성을 검사하는 것을 예로 들 수 있습니다. 다양한 실험 설계를 수용하기 위해 활용되는 바코드 수를 늘리거나 줄이면 됩니다.
- 바코드를 제외한 모든 바코드가 포함된 gDNA 풀을 만듭니다. 이 풀을 희석제로서 사용하여 단일 잔류 바코드를 포함하는 gDNA를 사용하여 희석 계열을 수행한다(샘플 희석 방식은 도4에 제공된다).
참고: 풀링된 gDNA를 희석제로 사용하면 감도를 확인하면서 일관된 배경을 확보할 수 있습니다. 4.3단계에서 결정된 카피 번호를 사용하여 gDNA를 권장 디지털 PCR 범위 내의 카피 번호로 희석합니다(20 μL 반응당 1-100,000부). 범위는 총 gDNA가 아닌 각 고유 대상(바코드)에 대해 설정됩니다. - 프로브 기반 화학용으로 설계된 디지털 PCR 슈퍼믹스를 사용하기 위한 제조업체의 권장 사항에 따라 중복으로 디지털 PCR에 대한 반응을 준비합니다. 6.1단계에서의 혼합물을 템플릿 DNA로 사용한다. 6.1단계에서 희석된 바코드에 대한 프로브를 포함하는 5.3단계에서 20x 프라이머-프로브 마스터 믹스를 사용하십시오.
- 프로브 기반 화학용으로 설계된 디지털 PCR 슈퍼믹스를 사용하기 위한 제조업체의 권장 사항에 따라 디지털 PCR에 대한 복제 제어 반응을 준비합니다. 각 프로브 믹스에 대한 제어 반응은 1) 템플릿 컨트롤(NTC), 2) 음성 제어 및 3) 양수 제어로 구성되어야 합니다.
참고: 복제 제어 반응의 최소 수는 2개입니다. 이 예제 프로토콜은 각 바코드에 대해 4개의 NPC, 6개의 네거티브 컨트롤 및 6개의 포지티브 컨트롤을 사용합니다. 네거티브 컨트롤에는 테스트 중인 프로브에 해당하는 바코드를 제외한 각 바코드가 포함된 gDNA가 포함되어야 합니다. 이렇게 하면 각 프로브의 특이성이 확인됩니다. - 6.1-6.3 단계를 반복하여 각 바코드 gDNA 샘플에 대한 디지털 PCR 반응을 생성합니다. 샘플 플레이트 배열은 도5에 제시되어 있다.
참고: 이 단계와 후속 단계는 물방울 및 유량 기반 기술을 활용하는 특정 디지털 PCR 플랫폼을 기반으로 설명합니다. 칩 기반 기술을 활용하는 대체 디지털 PCR 플랫폼은 이 프로토콜을 약간 수정하여 쉽게 대체할 수 있습니다. 6.4단계는 모든 프라이머 세트를 검증하기 위해 하나 이상의 96웰 플레이트가 필요할 수 있다. qPCR과 달리 디지털 PCR로 분석된 별도의 플레이트는 플레이트 간에 표준화된 기준 웰없이 쉽게 비교할 수 있습니다. - 제조업체의 지침에 따라 액적 발생기를 사용하여 각 반응 상태에 대한 액적을 생성합니다.
- 새로 생성된 물방울을 적절한 96웰 플레이트에 옮김을 옮김. 5-50 μL 멀티채널 파이펫에 200 μL 파이펫 팁을 사용하십시오.
참고: 파이펫을 피펫팅 할 때, 피펫을 천천히 매끄럽게! 디지털 PCR 장비 제조업체는 특정 제조업체(예: Ranin)의 파이펫 및 파이펫 팁만 사용하는 것이 좋습니다. 이 파이펫 팁은 물방울을 파괴하거나 액적 리더의 미세 유체를 손상시킬 수있는 미세한 플라스틱 조각이없는 부드러운 개구부를 가지고 있습니다. 팁의 수많은 브랜드를 검사 하 고 제조 품질의 스펙트럼을 관찰 했다. 파이펫 팁 대안을 사용하여 동등한 결과를 얻었습니다. 그러나 제조업체의 권장 사항에서 벗어날 때는 주의해야 합니다. - 모든 물방울이 생성되고 옮겨진 후, 호일 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉합니다.
- 다음 사이클링 조건을 수행하기 위해 제조업체권장 열자전거 를 사용하십시오: 1) 10 분 동안 94 °C; 2) 1 분 동안 94 °C, 1 °C / s로 설정된 램프 속도; 3) 2 분 동안 55 °C, 1 °C / s로 설정된 램프 속도; 4) 2단계와 3단계 49번반복; 5) 10 분 동안 98 °C; 6) 최대 24시간 까지 4°C에서 유지합니다.
참고: 액적 반응의 열 전달은 표준 PCR과 동일하지 않습니다. 반응 조건은 수정이 필요할 수 있습니다. - 열순환이 수행되는 동안 샘플 이름, 실험 유형(절대 정량화), 슈퍼믹스 사용, 대상 1 명(FAM 바코드 이름), 대상 1형(NTC, 포지티브 컨트롤, 음수 제어 또는 알 수 없음), 대상 2 이름(HEX 바코드 이름), 대상 2 유형(빈, 양수 제어, 음수 제어 또는 알 수 없음). 최종 플레이트 설정 정보는 그림5에 나와 있습니다.
- 열순환이 완료되면 완성된 반응을 액적 리더기로 옮기고 제조업체의 지침에 따라 판독 프로세스를 시작합니다.
7. 경쟁 지수 실험에서 박테리아의 수를 정량화
- 위에서 설명한 바와 같이 gDNA를 단리하고 섹션 4로부터 적절한 농도로 정량화한 희석.
- 적절한 슈퍼믹스를 사용하기 위한 제조업체의 권장 사항에 따라 디지털 PCR에 대한 반응을 준비합니다. 7.1단계의 DNA를 템플릿으로 사용합니다. 실험에 존재하는 가능한 바코드에 대한 프로브(또는 FAM 및 HEX를 모두 검출하는 경우 프로브)가 포함된 20x 프라이머-프로브 마스터 믹스를 사용합니다.
- 실험 설계에 사용되는 모든 바코드가 감지될 때까지 다른 20x 프라이머-프로브 마스터 믹스를 사용하여 7.2 단계에서와 같이 추가 디지털 PCR 반응을 준비합니다.
- 6.3에 설명된 대로 각 조건에 대한 컨트롤을 포함합니다. 여기에는 1) 템플릿 컨트롤(NTC), 2) 음성 컨트롤 및 3) 양수 컨트롤이 포함됩니다.
- 6.5-6.10 단계에 설명된 대로 프로토콜을 계속 합니다.
8. 디지털 PCR 데이터를 분석하고 절대 복사 수를 계산
- 모든 웰을 읽고 실행이 완료되면 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 .qlp 데이터 파일을 엽니다.
참고: 여기에 설명된 파일 형식 및 데이터 분석 절차는 한 디지털 PCR 제조업체에 만해당합니다. 대체 디지털 PCR 플랫폼을 사용하는 경우 파일 형식 및 데이터 분석 절차는 사용되는 플랫폼에 따라 다르며 제조업체의 권장 사양에 따라 수행해야 합니다. - 동일한 프라이머 프로브 마스터 믹스를 사용하는 모든 웰을 선택합니다.
- 액적 탭에서 각 우물에서 분석된 액적 의 수(양수 액적 및 음수 방울 모두)를 검사합니다. 총 액적 수가 10,000개 미만인 우물을 분석에서 제외합니다.
- 1D 진폭 탭으로 이동하여 양수 및 음수 방울의 진폭을 검사합니다. 두 개의 고유한 채우기로 구성되도록 합니다.
- 소프트웨어 내에서 임계값 기능을 사용하여 활용된 각 프로브에 대해 양수 액적과 음수 방울 사이의 컷오프를 만듭니다(그림 6).
참고: 5.3 단계에서 동일한 프라이머 프로브 마스터 믹스를 사용하는 모든 웰은 동일한 임계값을 가져야 합니다. - 모든 웰에 적절한 임계값이 적용되면 소프트웨어는 각 반응의 DNA 사본 수를 계산합니다. 추가 분석을 용이하게 하기 위해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
참고: 데이터 분석 소프트웨어는 푸아송 분포에 맞는 양수 및 음수 방울수를 사용하여 복사 수를 결정합니다. - 8.6단계의 값을 사용하여 샘플의 각 고유 게놈 바코드의 초기 카피 수를 계산합니다. 음의 대조반응에서 평균 가양성 비율을 결정하고 실험 반응에서 얻은 값에서 이 값을 뺍니다. 각 실험을 설정할 때 수행된 희석에 따라 필요에 따라 값을곱합니다(표 3).
9. 바코드 균주의 디지털 PCR 기반 정량화에서 CI 또는 COI를 계산하여 유기체의 상대적 적합성 결정
- 다음 수식을 사용하여 바코드 균주의 CI를 계산합니다: 출력은 주어진 시점에서 바코드 균주의 절대 정량화이며, WT출력은 바코드형 야생 박테리아의 절대 정량화입니다. 시간 포인트, 입력은 바코드 균주의 입력 접종의 절대 정량화, WT입력은 바코드 야생 형 박테리아의 입력 접종의 절대 정량화, X출력은 모든 균주의 합계입니다 동일한 타임포인트에서 X Input은 모든 바코드 균주의 총 입력 접종을 합산한 것입니다.
참고: 각 수식의 장점, 단점 및 가장 적절한 사용에 대한 토론을 참조하십시오.
- 모든 시점에서 각 바코드 변형률에 대해 9.1 단계를 반복합니다.
- 해당되는 경우 다음 수식을 사용하여 COI를 계산합니다:출력은 주어진 시점에서 돌연변이 유전자 A가 있는 바코드 균주의 절대 정량화이며, AB출력은 바코드형 균주의 절대 정량화입니다. 돌연변이 된 유전자 A와 B를 동시에 동시에 입력하면, A입력은 돌연변이 유전자 A를 가진 바코드 균주의 입력 접종의 절대 정량화이며, AB입력은 입력 접종의 절대 정량화입니다. 돌연변이 유전자 A와 B를 가진 바코드 균주의, B출력은 주어진 시점에서 돌연변이 유전자 B를 가진 바코드 된 긴장의 절대 정량화이고, B입력은 입력의 절대 정량화입니다 돌연변이 유전자 B와 바코드 균주의 접종 .
및/또는
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결과
이 방법론의 사용은 표적 DNA를 확인하기 위하여 이용된 각 탐사기의 감도 그리고 특이성을 확인하기 위하여 적당한 통제 반응이 수행된다는 것을 요구합니다. 이 대표적인 실험에서, 우리는 식별을 위해 8개의 해당 프로브로 8개의 고유 DNA 바코드를 검증했습니다. 모든 8개의 프로브는 NTC 및 음성 대조반응 모두에서 거짓양성의 낮은 비율을 가졌고(표 3), 매우 ...
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토론
미생물을 정확하게 정량화하는 능력은 미생물학 연구에 가장 중요하며, 초기 혼합 인구에서 독특한 균주를 열거하는 능력은 적합성 및 독성 특성을 평가하기위한 귀중한 도구임이 입증되었습니다. 박테리아. 그러나, 이것을 달성하기 위한 기술은 분자 생물학에 있는 현대 발달과 보조를 맞추지 않았습니다. 이 기술은 S를 포함한 많은 박테리아의 염색체를 용이하게 수정할 수 있다. Typhimuri...
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공개
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 말
이 간행물에 보고 된 연구는 조지 F. Haddix 대통령의 교수 연구 기금과 국립 보건원의 일반 의학 연구소에 의해 지원 되었다 (NIH) 수상 번호 GM103427. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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자료
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
참고문헌
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