ラット皮質脈管構造での洗浄・インおよび染料の洗浄を監視するためのパルスレーザーダイオードベースのデスクトップ光音響断層撮影

要約

密集した脈打ったレーザーのダイオード・ベースの卓上の光音響の断層撮影 (PLD-PAT) システムは小さい動物の皮質の脈管構造の高速動的のインビボのイメージ投射のために証明される。

要約

光音響 (PA) 断層撮影 (PAT) 画像化は、様々な前臨床および臨床的適用において有用な新生生物医学的画像化モダリティである。カスタムメイドの円形リングアレイベースのトランスデューサと従来のかさばる Nd: YAG/OPO レーザーは、診療所への PAT システムの翻訳を阻害します。超小型パルスレーザダイオード (PLDs) は、現在、PA イメージングのための近赤外励起の代替源として使用されています。高速度動的 in vivo イメージングは、コンパクト PLD ベースのデスクトップ PAT システム (PLD-PAT) を使用して実証されています。デスクトップ PLD-PAT システムを使用して視覚化された実験的なプロトコルは動的な in vivo 脳イメージ投射のためのこの仕事で提供される。プロトコルは、デスクトップ PLD-PAT システム構成、脳血管イメージングのための動物の調製、およびラット皮質脈管構造におけるインドシアニングリーン (ICG) 染料取り込みおよびクリアランスプロセスの動的な可視化のための手順を説明する。

概要

光音響計算断層撮影法 (協定/PAT) は、高 ultrasond 解像度^{1、2、3、4}と豊富な光学的コントラストを組み合わせた有望な非侵襲的生体イメージングモダリティです。^5.ナノ秒パルスレーザーが生体組織内に存在する光吸収発色団にエネルギーを堆積させると、局所的な温度が上昇して組織の thermoelastic の拡大と収縮をもたらし、結果として発生する圧力波これらの圧力波は、超音波または光音響 (PA) 波として知られており、サンプルの周りの超音波トランスデューサによって検出することができる。検出された pa 信号は、断面 pa 画像を生成するために、^{6、7、8、9}の様々な再構成アルゴリズムを使用して再構築される。PA イメージングは、体¹⁰の中に存在する内因性発色団の波長依存性に起因する巨視的な器官からの微細なオルガネラに構造的および機能的情報を提供する。PAT イメージングが正常に使用された乳がん検出¹、センチネルリンパ節イメージング¹¹、オキシヘモグロビン (HbO₂)、deoxyhemoglobin (HbR)、総ヘモグロビン濃度 (HbT)、酸素飽和度 (₂)^12,図¹³は、腫瘍の血管新生¹⁴、動物全体の全身イメージング¹⁵、および他の用途である。

Nd: YAG/OPO レーザは、小型動物イメージングおよび深部組織画像化¹⁶のための光音響コミュニティで広く使用されている第一世代の PAT システムに対する従来の励起源である。これらのレーザーは ~ 10-100 Hz の低い繰り返し率で ~ 100 mJ エネルギーパルスを提供します。これらの高価でかさばるレーザーを使用した PAT イメージングシステムは、パルス反復速度が限られているため、単元素超音波トランスデューサ (SUTs) による高速イメージングには適していません。これは、動物の内部で高速で発生する生理的変化のリアルタイムモニタリングを阻害する。リニア、半円形、円形、容積型アレイなどのアレイ・ベースのトランスデューサを Nd: YAG レーザー励起で使用することで、高速イメージングが可能です。しかし、これらの配列トランスデューサは高価であり、SUTs に比べて低い感度を提供します。しかし、撮像速度は、レーザの低い繰り返し速度によって制限される。カスタマイズされたフルリングの配列のトランスデューサーが付いている最先端の単一インパルスの協定システムは50の Hz フレーム率¹⁷で PA データを得る。これらのアレイトランスデューサは、複雑なバックエンドの受信電子機器および信号増幅器を必要とするため、システム全体のコストが高くなり、臨床使用が困難になります。

小型、低コスト、高パルス繰り返し率 (KHz の次数) により、パルスレーザダイオード (PLDs) がよりリアルタイムイメージングにより有望になります。これらの利点のために、PLDs は第二世代 PAT システムの代替励起源として積極的に使用されています。PLD に基づいた PAT システムは、アレイトランスデューサ¹⁸を用いた高フレームレートイメージングに対して正常に実証されており、深部組織および脳イメージング^19、20、21、心血管疾患診断²²、リウマチ診断²³.SUTs は、アレイトランスデューサと比較して高感度で安価であるため、PAT イメージングにも広く使用されています。繊維ベース PLD システムは、ファントムイメージング²⁴のために実証されている。携帯用 PLD-PAT システムは PAT スキャナ²⁵の中の PLD を取付けることによって前に証明された。1 SUT 環状走査器を用いて、3 s の走査時間の間にファントム画像化を行い、そしてインビボでラット脳画像化を、この PLD − PAT システム¹⁹を用いて 5 s 期間中に行った。

さらに、この PLD-PAT システムを改良して、8つの音響リフレクタベースの単一要素超音波トランスデューサ (SUTRs)^26,27を使用して、よりコンパクトにしてデスクトップモデルを作成しました。ここで、SUTs は、90^°音響反射器²⁸の補助を用いて水平方向の代わりに垂直に配置した。このシステムはティッシュのイメージ投射およびインビボの小さい動物の頭脳のイメージ投射の 0.5 s そして〜 3 cm までのスキャンの時間のために使用することができる。この作品では、このデスクトップ PLD-PAT システムは、小動物におけるインビボ脳イメージングのための実験の視覚的なデモンストレーションを提供し、食品医薬品局 (FDA) の取り込みおよびクリアランスプロセスの動的な可視化のために使用されています-承認インドシアニン緑 (ICG) ラットの脳内染料。

プロトコル

全ての動物実験は、シンガポールの南洋理工大学の動物医療・ユース委員会 (動物プロトコル番号 ARF-SBS/NIE-A0331) が承認したガイドラインと規制に従って実施された。

1. システム記述

1. PLD レーザーを円形スキャナーにマウントし、PLD 出口窓の前に光ディフューザー (OD) を取り付けて出力ビームを均質にします (図 1aを見て)。PLD をレーザー・ドライバー・ユニット (LDU) に接続します。
   注: PLD は、~ 816 nm の波長パルス、持続時間で ~ 107 ns のパルス、最大パルスエネルギーである ~ 3.4 mJ までの 2 KHz 繰り返しレートを生成します。LDU は、冷却器、12 V 電源、レーザーパワーを制御するための可変高圧電源、およびパルス繰り返し速度を変更する機能ジェネレータで構成されています。
2. 図 1bに示すように、各音響反射器の表面が走査領域の中心に向かって向くように、各 SUTR ホルダーに8個の SUTRs を1つずつ取り付けます。接続ケーブルの助けを借りて、各 SUTR ケーブルを低雑音信号アンプに接続します。
   注: 超音波のトランスデューサーの中央頻度は5つの MHz であり、13の mm の直径の活動的な区域を備えている。2つのアンプはそれぞれ 24 dB のゲインを各チャンネルごとに直列に接続します。
3. チラーの電源をオンにし、チラーのスイッチをオンにして、20° c ~ 25 ° c の温度を設定します。
4. 低電圧電源の電源をオンにし、現在のコントロールをゆっくりと回転させて、現在のリミットを0.3 に設定します。電圧を12v に設定します。電流が0.1 を超えないことを確認します。
5. 高圧電源装置の電源をオンにします。「プリセット」ボタンを押して、電流を 1 A、電圧を 0 V に設定します。「出力」ボタンを有効にします: 0 V/0 A。
6. ファンクションジェネレータの電源をオンにします。この繰り返し速度でレーザーパルスを生成するには、「リコール」ボタンを押して 2 KHz の設定を選択します。
7. 図 1aに示すように、スキャナー内部にアクリルタンクを置き、SUTRs の検出面が水の中に完全に浸漬されるように水槽を水で満たしてください。
8. すべての SUTRs 検出サーフェスが水媒体の内側にあることを確認します。低雑音信号増幅器の電源をオンにします。

2. ラット脳イメージングのための動物の調製

注: 健康な雌ラット (材料のテーブルを参照) は、小動物の皮質脈管構造を画像化するための上記のデスクトップ PLD-PAT システムを実証するために使用されました。

1. 頭と体の動きを逮捕することによって、その背中に動物を保持します。麻酔は、2ミリミンの2ml の混合物 (100 mg/mL)、キシラジンの 2ml (20mg/mL)、および 1 mL の生理食塩水 (0.2 mL/100g の投与量) の腹腔内注射によって動物を接種する。
   注: 注射の後、動物のつま先は、そのような脚や体の動き、発声、または呼吸の著しい増加などの正の反射をテストするために挟まれています。このような反射作用の欠如は、動物の成功した anesthetization を確認する。
2. 麻酔とレーザー照明による乾燥を防ぐために、非常に慎重に、人工涙液軟膏をラットの目に適用します。作業台の上にうつ伏せの位置に動物を配置し、毛トリマーを使用して動物の頭皮に毛皮を削除し、優しく剃毛領域に脱毛クリームを適用し、完全に毛皮を削除します。
   1. 4〜5分後、綿棒を使用して適用されたクリームを取り除きます。
3. ラボジャックの呼吸マスク (資料の表を参照) が装備されたカスタムメイドの動物ホルダー (材料のテーブルを参照) をマウントします。
4. 頭がホルダーの水平プラットフォーム上に置かれるように、ホルダーの上にうつ伏せの位置に動物を置きます。動物をホルダーに固定するために、外科用テープを使用してください。
5. 呼吸マスクがラットの鼻と口を覆い、麻酔の混合物を送達することを確認してください。呼吸のマスクはイメージ投射窓に適するためにカスタマイズされる。市販のノーズコーンの 10% が切断され、次に手袋の一部に接続される。
6. それをオンにする前に、麻酔装置に呼吸マスクを接続します。
7. 麻酔機械のスイッチを入れ、動物の呼吸マスクに 0.75% イソフルランの酸素の 1.0 L/min を含んでいる麻酔の混合物を提供するためにそれを置くために設定しなさい。
   1. パルス濃度計を動物の後肢の1つに固定し、その生理的状態を監視する。
8. 綿の先端アプリケータを使用して、ラットの頭皮に無色の超音波ゲルの層を適用します。ラボジャックの位置をスキャナーの中央に合わせ、ラボジャックの高さを手動で調整して、イメージングプレーンがアコースティックリフレクタの中心になるようにします。

3. ラット脳における ICG の取込みとクリアランス過程の動的 in vivo イメージング

1. 360°集録スキャンのデータ集録ソフトウェア (材料表を参照) のパラメータを設定します。
2. ファンクションジェネレータの出力を有効にして PLD レーザー放射をオンにします (レーザー放射が開始されます)。その後、可変高電圧電源の電圧を、パルスエネルギーあたり最大の 120 V にゆっくりと増加させます。
3. データ集録ソフトウェア (資料表を参照) を実行して、4秒間のスキャン時間にわたって8つの SUTRs すべてを360°で回転させます。
   注: たとえば、SUTRs が4s 用に回転された場合、PLD は 8000 (= 4 x 2000) パルスを送信し、各 SUTR は 8000 A 線を収集します。これらの 8000 A 線は、20個以上の信号を平均することで400に減少します (A 線平均 = 8000/20 = 400)。遅延・サム・バック・プロジェクション・アルゴリズムに基づく再構築プログラムは、各 SUTR のスキャン半径を調べるために使用されます。
4. ファンクションジェネレータの出力を無効にして、レーザー放射をオフにします。
5. データ処理ソフトウェアの再構築アルゴリズムを使用して (資料の表を参照)、バック・プロジェクション・アルゴリズムを使用して、試行錯誤によってすべての8つの SUTRs の走査半径を調べます。
6. 0.5 s スキャン時間にわたって45°の集録を行うには、データ集録ソフトウェア (材料の表を参照) のパラメータを設定します。
   注: たとえば、SUTRs が 0.5 s のために回転する場合、PLD は 1000 (= 0.5 x 2000) パルスを提供し、各 SUTR は 1000 A ラインを収集します。これらの 1000 A 線は、20個以上の信号を平均することで400に減少します (A 線平均 = 1000/20 = 50)。
7. ファンクションジェネレーターの出力を有効にしてレーザー発光をオンにします。
8. データ集録ソフトウェア (材料表参照) プログラムを実行して、45°の8つの SUTRs をすべて回転させ、ICG を投与する前に初期制御データを取得します。
9. ファンクションジェネレータの出力を無効にして、レーザー放射をオフにします。
10. 動物の尾静脈を特定し、0.3 mL の ICG (材料表参照) (323 μ m) をラットの尾静脈に注入します。

4.

注: 1.25 ICG 粉末の mg をマイクロ計量機を用いて秤量し、5ml の蒸留水と混合し、ICG 溶液に対して323μ m の濃度を得た。

1. ファンクションジェネレーターの出力を有効にしてレーザー発光をオンにします。
2. データ集録ソフトウェア (材料表参照) プログラムを実行して、0.5 秒間のスキャン時間を45°回転で a 線を取得します。

5.

注: 0.5 s スキャン時間の間に取得された A 線は、1つの断面イメージを生成するために使用します。各スキャンの間には、約 0.4 ~ 0.6 秒の時間差があります。

1. データ取得が終わったら、データ処理ソフトウェア (資料の表を参照) でバックプロジェクションアルゴリズムを使用して、保存された A ラインから断面の脳画像を再構築します。
2. レーザーをオフにして、麻酔マシンをオフにし、ラボジャックを下げて、ステージから動物を削除します。動物をケージに戻し、意識を取り戻すまでモニターしてください。

図 1: デスクトップ PLD-PAT システムの概略。(A) デスクトップ PLD-PAT の概略を設定します。PLD: パルスレーザーダイオード、OD: 光ディフューザー、SUTR: 音響リフレクタベースの単一要素超音波トランスデューサ、AM: 麻酔機、CSP: 円形スキャニングプレート、SM: ステッピングモータ、LDU: レーザー駆動部、アンプ: アンプ、DAQ: データ集録カード。(B) 走査中心を中心とした 8 SUTRs の円形配置。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

結果

ダイナミックな in vivo 脳イメージングのために説明されたデスクトップ PLD-PAT システムの可能性は、対応する結果とこのプロトコルで展示しています。デスクトップ PLD-PAT システムの高速画像化能力は、健康な雌ラットのインビボ脳画像化を行うことによって実証された。PA 信号は、それぞれ 4 s と 0.5 s のスキャン速度でラット脳の周りの360°と45°で回転する 8 SUTRs ?...

ディスカッション

本研究では、ICG のような造影剤の生体内脳イメージングや動的な高速取り込み・クリアランスプロセスについて、ラットのような小動物の実験を行うためのデスクトップ PLD-PAT システムを使用するためのプロトコルを提示する。かさばる、高価な OPO システムは、インビボ画像の単一の断面を取得するために数分 (2-5 分) かかります。密集した、低価格の、第1世代の携帯用 PLD-PAT システムは5...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 V power supply	Voltcraft	PPS-11810	To supply operating voltage for PLD
Acoustic reflector	Olympus	F102	45 degree reflector augmented to the ultrasound transducer
Acrylic water tank	NTU workshop	Custom-made	It is used to hold water that acts as an acoustic coupling medium between animal brain and detector
Anesthetic Machine	Medical plus pte ltd	Non-Rebreathing Anaesthesia machine with oxygen concentrator.	Supplies oxygen and isoflurane to animal
Animal distributor	In Vivos Pte Ltd, Singapore		Animal distributor that supplies small animals for research purpose
Animal holder	NTU workshop	Custom-made	Used for holding animal on its abdomen
Breathing mask	NTU workshop	Custom-made	Used along with animal holder to supply anesthesia mixture to the animal
Circular Scanner	NTU workshop	Custom-made	Scanner is made out of aluminum
DAQ (Data acquisition) Card	Spectrum	M2i.4932-exp	16 bit, 30 Ms/s, 8 channels, 1 Gs, PCIe
Data acqusition software	National Instruments Corporation,Austin,TX,USA)	NI LabVIEW 2015 SP1 (32 bit)	LabVIEW based program developed in our laboratory for controlling the stepper motor and acquring the PA singnals from the detector
Data processing software	Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA)	Matlab R2015b	Matlab code developed in our laboratory for reconstructing cross-sectional PA images
Function generator	RIGOL	DG1022	To change the repetition rate of the PLD. It will provide TTL signal to synchronize the DAQ with the laser excitation.
Low noise signal amplifier	Genetron	Custom-made using Mini-circuits, ZFL-500LN-BNC	To receive, and amplify the PA signal from SUTR. Its gain is 24 dB.
Optical diffuser	Thorlabs	DG-120	Used to to make the laser beam homogeneous
Pulsed laser diode	Quantel, France	QD-Q1924-ILO-WATER	It is the excitation laser source with specifications of 816 nm wavelength, 3.4 mJ per pulse energy, 107 ns pulse width, 2 KHz maximum pulse repitition rate, dimensions : 13.0 x 7.6 x 5.0 cm
Rats	In Vivos Pte Ltd, Singapore	NTac:SD, Sprague Dawley / SD	Female, weight 100±10g, strain of rats: Sprague Dawley, age: 4-5 weeks
Stepper motor with gearbox	LIN Engineering (Servo Dynamics)	Motor: CO-5718L-01P-RO, Gearbox: DPL64/1; Power supply PW-100-24	To move the detector holder in a circular geometry. Torque: 2.08 N-m, Rotor inertia: 2.6 kg-cm2
Ultrasound gel	Progress/parker acquasonic gel	PA-GEL-CLEA-5000	Clear ultrasound gel
Ultrasound Transducer	Olympus	V309-SU/ U8423013	Ultrasonic sensors used for photoacoustic detection. Central freqency 5 MHz, 0.5 in
Variable high voltage power supply	Elektro-Automatik	EA-PS 8160-04 T	To change the laser output power