カエノルハブ炎エレガンスにおける2-アラチドノイルグリセロールの定量のための過熱基準の合成

要約

本研究では、C.エレガンスにおけるエンドカンナビノイド2-アラキドノイルグリセロール(2-AG)を検出し、定量する堅牢でわかりやすい方法について述べている。同位体希釈および液体クロマトグラフィー-エレクトロプレーメントイオン化タンデム質量分析法(LC-ESI-MS/MS)による2-AGの定量に使用した分析的過熱規格です。

要約

本研究では、液体クロマトグラフィー・エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法(LC-ESI-MS/MS)により、2-アラキドノールグリセロール(2-AG)を定性的かつ定量的に分析する分析基準を作成する方法を提示する。エンドカンナビノイドは、様々な生物の複数の生物学的プロセスを調節する保存脂質メディエーターです。C.エレガンスでは、2-AGは、ダウアー形成およびコレステロール代謝の変調を含む異なる役割を有することが見出されている。本報告では、2-AG定量に必要な過量規格のコストと安定性に関連する困難を克服する方法について説明する。標準の合成のためのプロシージャは簡単で、有機合成の専門知識または特別な装置の必要性なしであらゆる実験室で行うことができる。さらに、C.エレガンス培養から過熱基準を抽出するフォルチ法の改変について説明する。最後に、安定な同位体標識アナログ1-AG-d5を用いて2-AGを検出する定量的および分析的方法について説明し、高速クロマトグラフィー実行で信頼性の高い結果を提供する。この手順は、異なる生物における代謝産物の他の研究にも適用可能である一方で、C.エレガンスにおける2-AGの複数の役割を研究するのに有用である。

概要

エンドカンナビノイドは、様々な生物の中で複数の生物学的プロセスを調節し、脂質メディエー^ター1を保存している。最初に発見され、最もよく特徴付けられたエンドカンナビノイドは、アナンダミド(アラキドノエレタノールアミド、AEA)および2-アラキドノイルグリセロール(2-AG)である。エンドカンナビノイドは、脳報酬システムだけでなく、薬物中毒、記憶、気分、代謝^{プロセス2}に関与するものを含む多くの重要な役割を果たしています。AEAおよび2-AGは必要なときだけ合成され、短い寿命を持ち、輸送タンパク質の再取り込みおよび加水^分解3によって分解される。

カエノルハブ炎エレガンス(C.エレガンス)のような動物モデルの使用は、アポトーシス、細胞シグナル伝達、細胞周期、細胞極性、遺伝子調節、代謝、老化を含む多種多様な生物学的プロセスを研究することが重要になっています。と性決定^4,5.さらに、C.エレガンスは多価不飽和脂肪酸(PUFA)の生理的役割を研究するための優れたモデルです。AEAはC.エレガンスで同定され、食事^制限6の下で減少する。この欠乏は、内因性カンナビノイドの補充によって抑制することができる食事制限メカニズムを介して線虫の寿命を延ばす.最近、2-AGとAEAがC.エレガンス7におけるコレステロール密売の規制において基本的な役割を果たしていることが判明した。さらに重要なことは、外因性2-AGによる補充は、ニーマンピックタイプC1 C.エレガンス変異体におけるコレステロールの密売障害によって引き起こされるダウアー逮捕を救うことができると判断された。

線虫内のコレステロールの密売やその他の生物学的プロセス(すなわち、単一アミノ化作動性シグナル伝達、非cicepepingおよび移動)との2-AGの関係をより深く理解するためには、この内因性代謝産物とその方法を研究することが重要である。特定の環境および食事条件の下で影響を受ける^{8,9,10,11,12,13}.したがって、異なる分野の科学者、特にこれに関連して線虫の行動を研究する人にとって使いやすいC.エレガンスの内因性2-AGを検出し、定量する方法を設計し、最適化することが不可欠です。エンドカンナビノイド。

2008年、レトネンと同僚は、LC-MS分析^方法14を用いてC.エレガンスの2-AGおよびAEAを同定することに成功した。2011年に、彼らは他のエンドカンナビノイ^ド15にこの技術を拡大することができました。より最近の研究は、質量分析およびGC-MS^16、17、18を含むC.エレガンスにおけるエンドカンナビノイドの検出と定量化に成功した他の分析方法を示しており、同様の分析方法が他の^モデル19に拡張できることも報告されている。

生物学的試料中の2-AGを定量するために使用される以前に報告された分析方法は、通常、商業的に取得され、^{購入20、21}の可用性を必要とする過形規格の使用を伴う。エンドカンナビノイドのLC-MS/MS定量のための多くの分析基準は、異なるプロバイダから市販されています。それにもかかわらず、それらは高価であり、敏感であり、複数の二重結合の存在のために、時間の経過とともに酸化される。これらの標準の最も一般的なバージョンは、オクタ割溶化アラキドン酸に基づいており、同位体希釈LC-MS/MS^14、22による定量に適しています。また、これらの標準のほとんどは、グリセロールの位置2に置き換え、彼らはアシル^{移行19、23}に傾向があるので、ほとんどの条件下で不安定になります。

これらの過熱規格のコストおよび安定性に関連する困難を克服するために、グリセロールd₅に基づいて分析標準を調製するための便利で簡単な方法が提示される。ペンタ割り当て標準を調製する順序は、標準の1-AG-d₅をもたらす3段階の手順を必要とし、これは安定しており、アシル移行を受けていない(2-モノアシルグリセロールの合成を目指す場合の主な問題)。

ここでの主な目的は、分析的過熱規格の合成、線虫サンプルの調製と抽出、LC-MS/MSによる分析を含む、C.エレガンスにおける2-AGを研究するための簡単で再現性の高い方法を示す(図1)).この合成手順は、高度な有機合成知識や特殊な装置なしで達成可能であり、内因性カンナビノイドの影響下でC.エレガンスの行動を研究している異なる分野の科学者に適しています。この方法は他のスタディモデルにも拡張可能で、異なるターゲットに役立ちます。ここで報告されているように、この規格は、再現可能な方法で2-AGの効果的な検出と定量を可能にする高速で信頼性の高いクロマトグラフィー法の開発に成功するために適用されています。

プロトコル

1. 1-AG-d₅調製

注:定量アッセイの定量内部標準として1-AG-d₅を取得する場合は、以下に説明するようにプロトコルに従ってください。

1. 差動保護
   1. 一次アルコールのみを保護するために、まずパスツールピペットを使用して10 mL反応管にグリセ_ロールd8の38mgを追加し、磁気攪拌機を追加します。
   2. 5 mLハミルトンシリンジを使用して無水ジクロロメタン(DCM)の5 mLを追加し、不活性な雰囲気を得るために_乾燥N2でチューブを充填します。
   3. 蒸留酢酸エチルで満たされた浅いデュワーフラスコを使用してお風呂を準備します。
   4. 気密に閉じた反応管を浴中に入れ、溶媒が凍るまで酢酸エチルに_液体N2をゆっくりと加えて冷却する。
      注意:液体は室温(RT)で激しく沸騰し、目や皮膚に接触すると重度の火傷を引き起こす可能性があります。
   5. ハミルトン注射器を使用して54mgの無水コリジンを添加します。
      注意:コリジンは揮発性であり、非常に強く、不快な香りを持っています。
   6. 塩化テルトブチルジメチルシルを70mg加え、磁気攪拌機で-78°Cで3時間全体をかき混ぜます。
   7. 3時間後、RTで温めるために反応を残し、さらに12時間撹拌し続けます。
   8. 反応をクエンチするために塩水の2 mLを追加します。
   9. 分離漏斗を用いて蒸留ジクロロメタンの2mLで溶液3xを抽出し、毎回有機抽出物を保存する。
   10. 3つの有機エキスを組み合わせ、硫酸ナトリウムの上に乾燥させます。
   11. 溶媒の突起を避けるために、真空ロータリーエバポレータで減圧下でジクロロメタンを慎重に蒸発させます。
   12. シリカゲルを静止相として使用し、100%ヘキサンから始まり、酢酸エチル100%で仕上げ、10%増加したヘキサン/酢酸エチルグラデーションを使用して、カラムクロマトグラフィーによって粗混合物を浄化します。
   13. 製品含有画分を組み合わせ、真空ロータリーエバポレーターで減圧下で溶媒を除去し、無色液体として純粋な1-O,3-O-bis-(TBDMS)グリセ_ロールd5を得ます。
2. エステル
   1. 1-O,3-O-bis(TBDMS)-グリセロール-d₅₍以前に合成)の10mgをパスツールピペットを使用して10mL反応管に加え、磁気攪拌機を添加する。
   2. 5 mLハミルトンシリンジを使用して無水ジクロロメタンの2 mLを追加し、不活性な雰囲気を得るために_乾燥N2でチューブを充填します。
   3. 氷浴を使用して溶液を0°Cに冷却します。
   4. 多体調節可能なマイクロピペットを使用してアラキドン酸の36mgを追加し、攪拌します。
   5. 4-ジメチルアミノピリジンの15 mgを追加し、攪拌.
   6. 多体調節可能なマイクロピペットを使用してN、N'-ジソプロピルカルボジミドの15mgを追加し、攪拌します。
   7. 混合物を0°Cで3時間反応させます。
   8. 3時間後、RTで温めるために反応を残し、さらに12時間撹拌し続けます。
   9. 反応をクエンチするために水の2 mLを追加します。
   10. 分離漏斗を用いて蒸留ジクロロメタン(DCM)の2mLで有機溶液3xを抽出する。
   11. 3つの有機エキスを同じチューブに入れ、硫酸ナトリウムの上に乾燥させます。
   12. 溶媒の突起を避けるために、真空ロータリーエバポレータで減圧下でジクロロメタンを慎重に蒸発させます。
   13. シリカゲルを静止相として使用し、100%ヘキサンから始まり、50%ヘキサン/50%酢酸エチルで仕上げ、10%増加ヘキサン/酢酸エチルグラデーションを使用して、カラムクロマトグラフィーによって粗混合物を浄化します。
   14. 製品含有画分を組み合わせ、真空ロータリーエバポレータで減圧下で溶媒を除去し、黄色がかった液体として純粋な1-O、3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d₅を得ます。
3. デプロテクション
   1. 1-O,3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d₅₍以前に合成)の15mgをパスツールピペットを使用して10mL反応管に加え、磁気攪拌機を添加する。
   2. 5 mLハミルトンシリンジを使用して無水THFの2 mLを追加し、不活性な雰囲気を得るために_乾燥N2でチューブを充填します。
   3. 氷浴を使用して溶液を0°Cに冷却します。
   4. ハミルトン注射器を用いてTHFに1Mテトラブチラムモニウム溶液を150μL滴下に添加します。
   5. RTに反応を暖め、1時間かき混ぜます。
   6. 1時間後、反応をクエンチするために水の2 mLを追加します。
   7. 分離漏斗を用いて蒸留ジクロロメタンの2 mLで溶液3xを抽出する。
   8. 3つの有機エキスを組み合わせ、硫酸ナトリウムの上に乾燥させます。
   9. 真空ロータリーエバポレータ内の減圧下でジクロロメタンを蒸発させ、黄色がかった液体として純粋な1-AG-d-d5を得る。
4. シリカゲル60 F₂₅₄プレコーティングされたアルミニウムシート上で行われる薄層クロマトグラフィーによってすべての反応を監視します。4-アニサルデヒドのエタノール溶液で染色した後、254 nm UVランプの下のバンドを視覚化します。

2. 標準在庫および測定ソリューションの準備

1. ACNの1mLに内部標準1-AG-d₅の1mgを溶解し、1分間超音波処理し、1,000 ppmの標準ストック溶液を得る。
2. ワームの定量に使用される1,000 ppb溶液を調べるために、まず10ppm溶液を調べ、ハミルトンシリンジを使用して10μLのストック溶液を取り出し、ACNの990 μLを加えて1mLの最終体積に希釈します。
3. ハミルトンシリンジを使用してステップ2.2で生成された溶液から100μLを取り出し、ACNの900 μLを加えて1mLの最終体積に希釈し、定量に使用される1,000 ppb溶液を得ます。
4. 完全な可溶化を確保するために、各ステップの間に1分間超音波処理。基準の濃度と完全性を維持するために、-78 °Cで溶液を保管してください。標準的な溶液を使用した後、酸化を防ぐためにバイアルを閉じる前にいくつかの窒素を流します。

3. C.エレガンスの成長と維持

注:大腸菌OP50で線虫成長培地(NGM)寒天プレートを播種し、これらのプレート上にワームを伝播します。

1. NaClの3gを寒天の17gと混ぜます。
2. 2.5gのペプトンを加_え、H2Oの975 mLを加えます。
3. オートクレーブを50分間冷却し、フラスコを55°Cに冷却します。
4. 以下を混合する:1 M CaCl₂の1 mL、1 M MgSO₄の1 mL、1M KH₂PO₄バッファーの25 mL(いずれも以前にオートクレーブされた)、およびエタノール中の5mg/mLコレステロールの1mLを混合する。
5. 無菌環境を維持しながら、NGM溶液を60mmペトリプレートに分配し、プレートを体積の3分の2に充填します。プレートを4°Cに保存します。
6. -80 °CグリセロールストックからLB寒天プレートに大腸菌細菌培養剤をストリークします。それは37 °Cで一晩プレート上で成長してみましょう。
7. 攪拌で37°Cで一晩液体LBの100 mLを接種するために単一のコロニーをピックアップします。
   注:この株は、この時間の間に静止した段階に達することができるので、O.D.をチェックする必要はありません。
8. 保存されたNGMプレートを取り外し、層流フードの蓋を取り外し、プレートから余分な水分を蒸発させるために開いたままにしておきます。
9. プレートを乾燥させたら、パスツールピペットを使用して、広がることなくプレートの中心にOP50大腸菌の100 μLを追加します。
10. OP50大腸菌の芝生を放置し、RTまたは37°Cで8時間一晩成長します。
11. 次亜塩素酸塩処理または「漂白」(セクション4)によって得られた所望の数のワーム胚を加える。
    注:ワームを追加する前に、RTにプレートを冷却します。

4. Cエレガンス培養を同期させる漂白技術

1. 6 cm NGM プレートに種子とチャンクワーム。
2. プレート上の卵と灰色の大人の十分な数を得るために2〜3日間成長するワームを残します。
3. 十分な卵/大人ができたら、プレートにM9の5 mLを注ぎます。
4. ガラスピペットを使用して15 mL遠心チューブにワームを転送します。
5. 2,000 x gでチューブを遠心分離し、ワームをペレットします。
6. M9の大部分を吸引し、ワームペレットの乱れを回避する。
7. 漂白液の3 mLを加える(NaOH:NaOCl:H₂Oの2:1比)。
8. 溶液を5分間、または無傷の成虫の数が減少するまで、穏やかに反転します。
   注意:5分以上漂白しないでください。
9. 2,000 x gで1分間遠心分離機を吸引し、ワームペレットを邪魔することなく漂白液のほとんどを吸引する。
10. M9の15 mLを追加し、よく混ぜます。
11. 1分間2000 x gで再び遠心分離機。
12. ワームペレットを邪魔することなく、M9の大部分を吸引する。
13. 手順 4.10-4.12 をもう 1 回または 2 回繰り返します。
14. 新鮮なM9の5 mLを追加し、攪拌します。
15. 卵は穏やかな揺れで一晩孵化してみましょう。

5. ワームサンプル調製

1. 漂白手順により得られたN2胚をM9バッファー(15mL遠心管中5mL)で一晩孵化させ、20°Cで行う。
2. 2,000 x gで2分間チューブを遠心分離することによって同期L1を収穫する。
3. M9バッファー1xでワームを洗浄し、ライブL1ワームの数を定量化します。
4. 約10,000匹のミミズをNGMプレート(直径10cm)に種をまき、1mLのOP50大腸菌(以前に乾燥)する。
5. ワームがL4段階に達するまで、20°Cで48時間プレートをインキュベートします。
6. 15 mL遠心管で冷たいM9バッファーを使用してワームを収穫し、それらを1倍に洗浄し、1.5 mLチューブに移します。
7. 2,000 x gで1分間遠心分離してワームをペレットし、上清の大部分を除去し、液体窒素にチューブを浸し、-80°Cで保存します。

6. 脂質抽出

1. 氷上でN2に属する凍結ワームペレットを約100μLで解凍し、1.3mLのメタノールを加え、4分間超音波処理します。
2. クロロホルムの2.6mL、および0.5M KCl/0.08 M_{H 3}PO₄の1.3mLを最終比1:2:1、内部標準1-AG-d₅の1,000ppb、および50μg/mLの最終濃度で抗酸化剤としてブチル化ヒドロキシトルエンを添加する。
3. 超音波水浴で1分間サンプルを渦にし、氷の上で15分間超音波水浴で超音波処理します。
4. 2,000 x gで1分間サンプル2xと遠心分離を2倍、遠心分離を行い、位相分離を誘導します。
5. 下相を回収し、きれいなチューブに集め、窒素の下で乾燥させ、ACNの100μLで固体残渣を再中断します。

7. HPLC-MS/MSによるエンドカンナビノイド分析

1. ESI三重四重極質量分析計と組み合わせた液体クロマトグラフィーを使用して、線虫サンプルから2-AGを検出して定量します。
2. 逆相 HPLC には次の比率を使用します: 0.0-0.5 分 H₂O:ACN (40:60), 0.5-6.5 分 H₂O:ACN (40:60) から (25:75) 6.. 5-7.5 分 H₂O:ACN (25:75), 7.5-8.0 分 H₂O:ACN (25:75) から (40:60), 8.0-12.0 分 H₂O:ACN (40:60)
3. カラム温度を40°Cに保ち、オートサンプラートレイ温度を10°Cに設定します。
4. 次のイオン化条件を設定します: 正イオンモード;乾燥ガス (N₂₎温度 = 300 °C;乾燥ガス流量 = 10 L/分;ネブライザー圧力 = 10 UA;とキャップ。電圧 = 4 kV。
5. アナリテ検出では、2-AG の場合は 379.2 m/z から 289.2 m/z までの MRM を使用します。1-AG-d₅の場合は 384.2 m/z から 289.2 m/z まで。

8. ワームにおけるエンドカンナビノイド定量

1. 過量化内部標準 1-AG-d₅を使用し、内部標準に対するアナリテのピーク面積比を計算します。
2. 2-AG の場合は、384.2 m/z から 287.2 m/z の遷移を使用します。1-AG-d₅の場合は 379.2 m/z から 287.2 m/z まで。
3. 標準の濃度値を用いて、過熱規格のピーク面積比と比較して内因性2-AGの濃度を算出する。

結果

同位体標識されたアナログを、3段階合成法を用いて市販_のd8-グリセロールおよびアラキドン酸から合成することに成功した(図2、図3)。これらのステップは簡単で、洗練された装置、特別に制御された条件、または高価な試薬を必要としない。したがって、この方法は堅牢であり、異なる脂肪酸を含むモノアシルグ...

ディスカッション

エンドカンナビノイドは、C.エレガンス7におけるダウアー形成の調節に関与している脂質のクラスである。より具体的には、多価不飽和脂肪酸(PUFA)の合成は、コレステロールの密売およびワームの生殖発達にとって重要である。2-AG、エンドカンナビノイドを含むアラキドン酸は、コレステロール代謝を損なったワームの通常のサイクルにダウアー幼虫を回復させる責...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-dimethylaminopyridine	Sigma-Aldrich	107700	reagent grade, 99%
antioxidant BHT	Sigma-Aldrich	W21805
Arachidonic acid	Sigma-Aldrich	10931
Glycerol-d8	Sigma-Aldrich	447498
Mass detector Triple Quadrupole	Thermo Scientific		TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	D125407
NMR spectrometer	Bruker		Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column	Thermo Fisher	25003-052130	C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride	Sigma-Aldrich	190500	reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride	Sigma-Aldrich	216143	1.0M in THF
UHPLC System	Thermo Scientific		Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)