Caenorhabditis elegans 2-Arachidonoylglycerol Quantification için Bir Deuterated Standart Sentezi

Özet

Bu çalışma, C. elegansendokannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) tespit etmek ve ölçmek için sağlam ve basit bir yöntem açıklar. 2-AG'nin izotopik seyreltme ve sıvı kromatografi-elektrosprey iyonizasyon-tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) ile ölçülmesi için hazırlanmış ve kullanılan analitik bir deuterated standarttır.

Özet

Bu çalışma sıvı kromatografi-elektrosprey iyonizasyon-tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) ile 2-arachidonoyl gliserol (2-AG) nitel ve nicel analiz etmek için analitik bir standart hazırlamak için bir yöntem sunar. Endofanbinoidler çeşitli organizmalarda birden fazla biyolojik süreci düzenleyen lipid mediatörleri korunur. C. elegansyılında, 2-AG farklı rollere sahip olduğu bulunmuştur, dauer oluşumu ve kolesterol metabolizması modülasyonu da dahil olmak üzere. Bu rapor, 2-AG nicelleştirme için gerekli olan kısırlaştırılmış standartların maliyetleri ve istikrarı ile ilgili zorlukların üstesinden gelmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Standardın sentezi için prosedür basittir ve organik sentez uzmanlığı veya özel ekipmangerek kalmadan, herhangi bir laboratuvarda yapılabilir. Buna ek olarak, Folch yöntemic. elegans kültüründen deuterated standart ayıklamak için bir değişiklik açıklanmıştır. Son olarak, kararlı izotopik etiketli analog 1-AG-d₅ kullanarak 2-AG'yi saptamak için nicel ve analitik bir yöntem tanımlanmıştır ve bu da hızlı kromatografik bir çalışmada güvenilir sonuçlar sağlar. Bu prosedür, c. eleganlarda 2-AG'nin birden fazla rollerinin incelenmesinde ve farklı organizmalardaki metabolitlerin diğer çalışmaları için de geçerli olmak için yararlıdır.

Giriş

Endofanbinoidler çeşitli organizmalarda birden fazla biyolojik süreci düzenler ve lipid aracıları korunur^1. İlk keşfedilen ve en iyi karakterize endanabinoidler anandamid (arachidonoylethanolamide, AEA) ve 2-arachidonoyl gliserol (2-AG). Endokannabinoidler beyin ödül sistemleri nin yanı sıra uyuşturucu bağımlılığı, bellek, ruh hali ve metabolik süreçler de dahil olmak üzere birçok kritik rol oynamaktadır². AEA ve 2-AG sadece gerektiğinde sentezlenir ve kısa kullanım ömrüne sahiptirler ve taşıma protein geri alımı ve hidroliz³ile bozulurlar.

Caenorhabditis elegans gibi hayvan modellerinin kullanımı(C. elegans)apoptoz, hücre sinyalizasyonu, hücre döngüsü, hücre polaritesi, gen regülasyonu, metabolizma, yaşlanma, ve cinsiyet belirleme^4,5. Ayrıca, C. elegans çoklu doymamış yağ asitlerinin (PUFA) fizyolojik rollerini incelemek için mükemmel bir modeldir. AEA C. elegans tespit edilmiştir ve diyet kısıtlaması⁶altında azalır. Bu eksiklik endofanabinoid ile takviyesi ile bastırılabilir bir diyet kısıtlama mekanizması ile nematod ömrünü uzatır. Son zamanlarda, 2-AG ve AEA C. elegans⁷kolesterol ticaretinin düzenlenmesinde temel rol oynadığı keşfedilmiştir. Daha da önemlisi, bu eksojen 2-AG ile takviyesi Dauer arrest, Niemann-Pick tip C1 C. elegans mutantlar bozulmuş kolesterol ticareti neden olduğu kurtarma olabilir tespit edilmiştir.

2-AG'nin kolesterol ticareti ve nematoddaki diğer biyolojik süreçlerle (yani monoaminik sinyalizasyon, nosisepsiyon ve lokomotion) olan ilişkisini daha iyi anlamak için, bu endojen metabolitin incelenmesi ve nasıl olduğu bazı çevre ve beslenme koşulları altında etkilenen^{8,9,10,11,12,13}. Bu nedenle, farklı alanlardaki bilim adamları için kullanımı kolay olan C. elegans'ta endojen 2-AG'yi tespit etmek ve ölçmek için bir yöntem tasarlamak ve optimize etmek zorunludur, özellikle de nematodun bu konudaki davranışlarını inceleyenler için. endkannabinoid.

2008 yılında, Lethonen ve iş arkadaşları LC-MS analitik yöntemler¹⁴kullanarak C elegans 2-AG ve AEA tespit başardı. 2011 yılında, diğer endokannabinoidler¹⁵bu tekniği genişletmek başardı. Daha yeni çalışmalar, c. elegansendokannabinoidlerin saptandırıp ölçülmesinde başarılı olan diğer analitik yöntemler göstermiştir , kütle spektrometresi ve GC-MS¹⁶dahil^,17,18, ve ayrıca benzer analitik yöntemlerdiğer modellere genişletilebilir^{bildirilmiştir 19}.

Biyolojik numunelerde 2-AG'nin ölçülmesi için kullanılan daha önce bildirilen analitik yöntemler genellikle ticari olarak edinilen ve satın alma için kullanılabilirlik gerektiren deuterated standartların kullanımını içerir^20,21. Endofabinoidlerin LC-MS/MS sayısallaştırılması için birçok analitik standart farklı sağlayıcılardan ticari olarak mevcuttur. Yine de, onlar pahalı, duyarlı, ve zaman içinde okside olmak, birden fazla çift bağ varlığı nedeniyle. Bu standartların en yaygın sürümleri okta-deuterated araşidonik asit dayanmaktadır ve izotop seyreltme LC-MS/MS¹⁴tarafından nicelleştirmek için uygundur^,22. Ayrıca, bu standartların çoğu gliserol pozisyon 2 ikame edilir, onlar asil göç eğilimli beri çoğu koşullar altında kararsız hale^19,23.

Bu deuterated standartların maliyetleri ve istikrarı ile ilgili zorlukları aşmak için, gliserol-d dayalı analitik bir standart hazırlamak için uygun ve basit bir yöntem sunulmaktadır₅. Penta-deuterated standart hazırlamak için sırası standart 1-AG-d_sonuçlarıüç aşamalı bir prosedür gerektirir 5 , hangi istikrarlı ve asil göç geçmez (2-monoasilglisitler sentezamaçlayan ana konu).

Burada temel amaç, analitik olarak nötralizasyon standardının sentezi, nematod örneklerinin hazırlanması ve çıkarılması ve LC-MS/MS ile analiz dahil olmak üzere, C. eleganlarda2-AG'yi incelemek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem göstermektir (Şekil 1 ). Bu sentetik prosedür sofistike organik sentez bilgisi veya özel ekipman olmadan ulaşılabilir, endocannabinoid etkisi altında C. elegans davranış okuyor farklı alanlardan bilim adamları için uygun hale. Yöntem aynı zamanda diğer çalışma modelleri için genişletilebilir, farklı hedefler için yararlı hale. Burada bildirildiği gibi hazırlanan standart, 2 AG'nin etkili bir şekilde tekrarlanabilir bir şekilde saptanması ve ölçülmesi için hızlı ve güvenilir bir kromatografik yöntem geliştirmek için başarıyla uygulanmıştır.

Protokol

1. 1-AG-d₅ hazırlığı

NOT: 1-AG-d_5'i nicelik selahtları için deuterated iç standart olarak elde etmek için aşağıdaki protokolü uygulayın.

1. Diferansiyel koruma
   1. Sadece birincil alkolleri korumak için, ilk bir Pasteur pipet kullanarak 10 mL reaksiyon tüpü gliserol-d₈ 38 mg ekleyin ve manyetik karıştırıcı ekleyin.
   2. 5 mL Hamilton şırıngası kullanarak 5 mL susuz diklorotan (DCM) ekleyin ve tüpe kuru N₂ ile doldurularak hareketsiz bir atmosfer elde edin.
   3. Distile etil asetat ile dolu sığ bir Dewar şişesi kullanarak bir banyo hazırlayın.
   4. Hermetik olarak kapalı reaksiyon tüpünü banyonun içine yerleştirin ve çözücü dondurulunceye kadar etil asetata yavaşça sıvı N₂ ekleyerek soğutun.
      DİkKAT: Sıvı oda sıcaklığında (RT) şiddetle kaynar ve gözler ve cilt temas ederken ciddi yanıklara neden olabilir.
   5. Bir Hamilton şırınga kullanarak susuz çarpıştığında 54 mg ekleyin.
      DİkKAT: Çarpıştırıcı uçucudur ve çok güçlü ve tatsız bir kokusu vardır.
   6. Tert-butildimethylsilyl klorür 70 mg ekleyin ve manyetik bir karıştırıcı üzerinde -78 °C'de 3 saat boyunca tüm çözeltiyi karıştırın.
   7. 3 saat sonra, RT sıcak reaksiyon bırakın ve ek bir 12 saat karıştırmaya devam edin.
   8. Reaksiyonu gidermek için 2 mL salamura ekleyin.
   9. Çözeltiyi 2 mL distile diklorometan ile 3x ayıklayın ve her seferinde organik ekstresi kaydedin.
   10. Üç organik özleri birleştirin ve sodyum sülfat üzerinde kurulayın.
   11. Çözücü projeksiyonları önlemek için bir vakum döner evaporatör azaltılmış basınç altında diklorometan buharlaştırın dikkatle.
   12. Sabit faz olarak silika jel ve %10 0'lık heksan/etil asetat gradienti kullanarak kolon kromatografisi ile ham karışımı arındırın, %100 heksandan başlayıp %100 etil asetat ile bitirin.
   13. Ürün içeren fraksiyonları birleştirin ve saf 1-O,3-O-bis-(TBDMS) gliserol-d₅ renksiz bir sıvı olarak elde etmek için bir vakum döner evaporatör azaltılmış basınç altında çözücü kaldırın.
2. Esterleşme
   1. 1-O,3-O-bis(TBDMS)-glycerol-d₅ (daha önce sentezlenen) bir Pasteurette kullanarak 10 mL reaksiyon tüpü ne mg ekleyin ve bir manyetik karıştırıcı ekleyin.
   2. 5 mL Hamilton şırıngası kullanarak 2 mL susuz diklorotan ekleyin ve tüpünü inert bir atmosfer elde etmek için kuru N₂ ile doldurun.
   3. Çözeltiyi buz banyosu kullanarak 0 °C'ye kadar soğutun.
   4. Çok hacimli ayarlanabilir mikropipet kullanarak araşidonik asit 36 mg ekleyin ve karıştırın.
   5. 4-dimethylaminopyridine 15 mg ekleyin ve karıştırın.
   6. N, N'-diisopropilcarbodiimide 15 mg çok hacimli ayarlanabilir mikropipet kullanarak ekleyin ve karıştırın.
   7. Karışımın 0 °C'de 3 saat boyunca reaksiyona sayılsın.
   8. 3 saat sonra, RT sıcak reaksiyon bırakın ve ek bir 12 saat karıştırmaya devam edin.
   9. Reaksiyonu gidermek için 2 mL su ekleyin.
   10. Organik çözeltiyi 3x, 2 mL distile diklorotan (DCM) ile ayırıcı bir huni kullanarak ayıklayın.
   11. Aynı tüp içine üç organik özler yerleştirin ve sodyum sülfat üzerinde kuru.
   12. Çözücü projeksiyonları önlemek için bir vakum döner evaporatör azaltılmış basınç altında diklorometan buharlaştırın dikkatle.
   13. Sabit faz olarak silika jel ve %10 artırarak heksan/etil asetat gradienti kullanarak kolon kromatografisi ile ham karışımı arındırın, %100 heksandan başlayıp %50 heksan/%50 etil asetat ile bitirin.
   14. Saf 1-O, 3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d_5'i sarımsı bir sıvı olarak elde etmek için ürün içeren fraksiyonları birleştirin ve vakum döner evaporatörde azaltılmış basınç altında çözücüü çıkarın.
3. Korumadan Arındır
   1. Pasteurpipe kullanarak 10 mL'lik reaksiyon tüpüne 1-O,3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d₅ (daha önce sentezlenmiş) 15 mg ekleyin ve manyetik karıştırıcı ekleyin.
   2. 5 mL Hamilton şırıngası kullanarak 2 mL susuz THF ekleyin ve tüpkuru N₂ ile doldurularak hareketsiz bir atmosfer elde edin.
   3. Çözeltiyi buz banyosu kullanarak 0 °C'ye kadar soğutun.
   4. Bir Hamilton şırıngası kullanarak THF'ye 1M tetrabutylamonyum florür çözeltisi 150 μL damla şeklinde ekleyin.
   5. Reaksiyon RT sıcak ve 1 saat için karıştırın.
   6. 1 saat sonra reaksiyonu gidermek için 2 mL su ekleyin.
   7. Çözeltiyi 2 mL distile diklorometan ile 3x ayıklayın.
   8. Üç organik özleri birleştirin ve sodyum sülfat üzerinde kurulayın.
   9. Bir vakum döner evaporatör azaltılmış basınç altında diklorometan buharlaştırmak saf 1-AG-d₅ sarımsı bir sıvı olarak elde etmek.
4. Silika jel 60 F₂₅₄ önceden kaplanmış alüminyum levhalar üzerinde yapılan ince tabaka kromatografi ile tüm reaksiyonları izleyin. 4-anisaldehit etanolik çözeltisi ile boyandıktan sonra 254 nm UV lambaaltında bantları görselleştirin.

2. Standart stok ve ölçüm çözümlerinin hazırlanması

1. 1000 ppm standart stok çözeltisini elde etmek için dahili standart 1-AG-d_5'i 1 mL'de 1 mL'de ve sonicate'i 1 dk'da çözün.
2. Solucanlarda sayısallaştırma için kullanılan 1.000 ppb çözeltisini hazırlamak için, önce 10 ppm'lik bir çözelti hazırlayın: Hamilton şırıngası kullanarak stok çözeltisinden 10 μL alın ve 990 μL ACN ekleyerek 1 mL'lik son hacmine seyreltin.
3. Hamilton şırıngası kullanarak adım 2.2'de üretilen çözeltiden 100 μL alın ve ölçütleme için kullanılan 1.000 ppb çözeltisini elde etmek için 900 μL ACN ekleyerek 1 mL'lik son bir hacme seyreltin.
4. Tam bir solubilizasyon sağlamak için her adım arasında 1 dakika sonicate. Standartların konsantrasyonlarını ve bütünlüğünü korumak için çözümleri -78 °C'de saklayın. Standart çözelti kullanıldıktan sonra, oksidasyonu önlemek için şişeyi kapatmadan önce biraz azot akışı.

3. C. eleganların büyümesi ve bakımı

NOT: E. coli OP50 ile nematod büyüme ortamı (NGM) agar plakaları tohum ve bu plakalar üzerinde solucanlar yaymak.

1. 17 g agar ile NaCl 3 g karıştırın.
2. Pepton 2,5 g ekleyin, sonra H₂O 975 mL ekleyin.
3. 50 dk için otoklav, sonra 55 °C için şişe soğutun.
4. Aşağıdakileri karıştırın: 1 mL 1 M CaCl₂, 1 mL 1 M MgSO₄, 25 mL 1 M KH₂PO₄ tampon (hepsi daha önce otoklavlanmış olan) ve etanolde 5 mg/mL kolesterol 1 mL.
5. Steril bir ortam korurken, NGM çözeltisini 60 mm Petri plakaya dağıtArak plakaları hacminin üçte ikisine kadar doldurun. Plakaları 4 °C'de saklayın.
6. -80 °C gliserol stoğundan LB agar plakasına E. coli bakteri kültürünü yerleştirin. Bir gecede 37 °C'de tabakta yetişsin.
7. Ajitasyon ile bir gecede 37 °C'de 100 mL sıvı LB aşılamak için tek bir koloni toplayıp.
   NOT: Bu suşu bu süre içinde sabit faza ulaşabileceğinden, o.D.'yi kontrol etmek gerekli değildir.
8. Depolanan NGM plakalarını çıkarın, laminar akış kaputundaki kapakları çıkarın ve plakalardan fazla neliğin buharlaşmasına izin vermek için açık bırakın.
9. Tabaklar kuruduktan sonra, yayılmadan plakanın ortasına 100 μL OP50 E. coli eklemek için pasteur pipetkullanın.
10. OP50 E. coli çimlerini rt'de veya 37 °C'de 8 saat boyunca büyümeye bırakın.
11. Hipoklorit tedavisi veya "ağartma" ile elde edilen istenilen sayıda solucan embriyosu ekleyin (Bölüm 4).
    NOT: Solucan ilavesinden önce plakaları RT'ye soğutun.

4. C elegans kültürlerini senkronize etmek için beyazlatma tekniği

1. 6 cm NGM plakaları üzerine tohum ve yığın solucanlar.
2. Plaka üzerinde yeterli sayıda yumurta ve gravid yetişkin elde etmek için solucanlar 2-3 gün boyunca büyüyen bırakın.
3. Yeterli yumurta/yetişkin olduğunda, plakanın üzerine 5 mL M9 dökün.
4. Solucanları cam pipet kullanarak 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
5. 2000 x g 2 dakika için tüp santrifüj ve solucanlar pelet.
6. M9'un çoğunu emerek solucan peletinin bozulmasını önleyin.
7. 3 mL beyazlatma çözeltisi ekleyin (NaOH:NaOCl:H₂O oranı 2:1:1 oranı).
8. Çözeltiyi 5 dakika veya bozulmamış yetişkin solucan sayısı azalana kadar karıştırmak için hafifçe ters çevirin.
   DİkKAT: 5 dakikadan fazla çamaşır suyu yapmayın.
9. 2.000 x g ve emme solucan pelet rahatsız etmeden ağartma çözeltisi en 1 dakika için santrifüj.
10. 15 mL M9 ekleyin ve iyice karıştırın.
11. Santrifüj tekrar 2000 x g 1 dk için.
12. Solucan peletini bozmadan M9'un çoğunu emme.
13. Adımları 4.10-4.12 bir veya iki kez daha tekrarlayın.
14. Taze M9 5 mL ekleyin ve ajite.
15. Yumurtalar nazik sallanan bir gecede yumurtadan izin verin.

5. Solucan numunesi hazırlama

1. Ağartma işlemi ile elde edilen N2 embriyoları 20 °C'de M9 tamponunda (15 mL santrifüj tüpünde 5 mL) bir gecede yumurtadan çıksın.
2. 2 dk 2.000 x gtüpü santrifüj ederek senkronize L1'leri hasat edin.
3. Solucanları M9 tamponu 1x ile yıkayın ve canlı L1 solucanlarının sayısını ölçün.
4. 1 mL OP50 E. coli (önceden kurutulmuş) ile NGM plakaları (10 cm çapında) içine yaklaşık 10.000 solucan tohumu.
5. Solucanlar L4 aşamasına ulaşana kadar plakaları 20 °C'de 48 saat kuluçkaya yatırın.
6. 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde soğuk M9 tamponu kullanarak solucanları hasat edin, 1x yıkayın ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
7. Solucanları 1 dk için 2.000 x g'de santrifüj ile peletleyin, süpernatantın çoğunu ortadan kaldırın, tüpleri sıvı nitrojene batırın ve -80 °C'de saklayın.

6. Lipid çıkarma

1. Buz üzerinde N2'ye ait yaklaşık 100 μL dondurulmuş solucan peletini eritin, 1,3 mL metanol ekleyin ve numuneyi 4 dakika sonicate edin.
2. 2.6 mL kloroform ve 1.3 mL 0.5 M KCl/0.08 M H₃PO_4'ü 1:2:1, 1.000 ppb iç standart 1-AG-d_5'eson orana ekleyin ve 50 μg/mL konsantrasyonunda antioksidan ajan olarak bülate hidroksitoluene ekleyin.
3. Girdap 1 dakika ve buz üzerinde 15 dakika ultrasonik su banyosunda sonicate için örnekler.
4. Girdap 1 dk ve santrifüj için 2x 20 dk 2.000 x g faz ayırma ikna etmek için.
5. Alt faztoplamak ve temiz bir tüp içinde toplamak, azot altında kuru ve ACN 100 μL katı kalıntı sıcağı yeniden askıya.

7. HPLC-MS/MS ile endkanabinoid analizi

1. Nematod örneklerinden 2-AG'yi tespit etmek ve ölçmek için ESI üçlü dörtkutuplu kütle spektrometresi ile birleştirilmiş sıvı kromatografikullanın.
2. Ters faz HPLC için aşağıdaki oranı kullanın: 0,0-0,5 dk H₂O:ACN (40:60), 0,5-6,5 dk H₂O:ACN (40:60) ila (25:75), 6.5-7,5 dk H₂O:ACN (25:75), 7,5-8,0 dk H₂O:ACN (25:75) ila (40:60), 8.0-12.0 dk H₂O: ACN (40:60).
3. Kolon sıcaklığını 40 °C'de koruyun ve otomatik numune tepsisi sıcaklığını 10 °C'ye ayarlayın.
4. Aşağıdaki iyonizasyon koşullarını ayarlayın: pozitif-iyon modu; kurutma gazı (N₂) sıcaklık = 300 °C; kurutma gazı akış hızı = 10 L/dk; nebülizör basıncı = 10 UA; ve kap. gerilim = 4 kV.
5. Analit tespiti için MRM'yi aşağıdaki geçişlerle kullanın: 2-AG için 379,2 m/z ila 289,2 m/z; ve 384,2 m/z için 289,2 m/z için 1-AG-d₅.

8. Solucanlarda Endokannabinoid nicelleştirme

1. Deuterated iç standart 1-AG-d₅ kullanın ve iç standarda analit in tepe alan oranlarını hesaplamak.
2. Aşağıdaki geçişleri kullanın: 2-AG için 384,2 m/z ila 287,2 m/z; ve 379.2 m/z için 287.2 m/z için 1-AG-d₅.
3. Endojen 2-AG konsantrasyonu, standardın konsantrasyon değerini kullanarak, çözünen standardın en yüksek alan oranlarıyla karşılaştırarak hesaplayın.

Sonuçlar

İzotopik olarak etiketlenmiş bir analog, 3 aşamalı sentetik bir yöntem kullanılarak ticari olarak mevcut d₈-gliserol ve araşidonik asitten başarıyla sentezlenmiştir(Şekil 2, Şekil 3). Bu adımlar basittir ve gelişmiş ekipmanlar, özel olarak kontrol edilen koşullar veya pahalı reaktifler gerektirmez. Bu nedenle, bu yöntem sağlam dır ve farklı yağ asitleri içeren monoasilgliseritleri sentezlemek i?...

Tartışmalar

Endocannabinoidler C. elegans⁷dauer oluşumunun düzenlenmesinde rol yapmış lipidlerin bir sınıfıdır. Daha spesifik olarak, çoklu doymamış yağ asitlerinin (PUPO) sentezi kolesterol ticareti ve solucanların üreme gelişimi için önemlidir. Burada 2-AG, endokannabinoid içeren bir araşidonik asit, bozulmuş kolesterol^{metabolizması}var solucanlarda normal döngüsüne dauer larva geri sorumlu olduğu ortaya 7 .

Kolesterol tica...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-dimethylaminopyridine	Sigma-Aldrich	107700	reagent grade, 99%
antioxidant BHT	Sigma-Aldrich	W21805
Arachidonic acid	Sigma-Aldrich	10931
Glycerol-d8	Sigma-Aldrich	447498
Mass detector Triple Quadrupole	Thermo Scientific		TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	D125407
NMR spectrometer	Bruker		Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column	Thermo Fisher	25003-052130	C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride	Sigma-Aldrich	190500	reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride	Sigma-Aldrich	216143	1.0M in THF
UHPLC System	Thermo Scientific		Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)