Síntese de um padrão Deuterated para a quantificação de 2-Arachidonoylglycerol em elegans do Caenorhabditis

Resumo

Este trabalho descreve um método robusto e direto para detectar e quantificar o endocanabinóide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) em C. elegans. Um padrão analítico deuterado nos preparou e utilizou para a quantificação de 2-AG por diluição isotópica e cromatografia líquida-eletroestimulação por espectrometria de massas tandem-electrospray (LC-ESI-MS/MS).

Resumo

Este trabalho apresenta um método para preparar um padrão analítico para analisar 2-arachidonoyl glicerol (2-AG) qualitativamente e quantitativamente pela espectrometria de massas de ionização em tandem (LC-ESI-MS/MS) de cromatografia líquida-electrospray. Os endocanabinoides são conservados mediadores lipídicos que regulam vários processos biológicos em uma variedade de organismos. Em C. elegans, 2-AG foi encontrado para possuir papéis diferentes, incluindo a modulação da formação do Dauer e do metabolismo do colesterol. Este relatório descreve um método para superar as dificuldades associadas com os custos e a estabilidade de padrões deuterado exigidos para a quantificação 2-AG. O procedimento para a síntese do padrão é simples e pode ser executado em todo o laboratório, sem a necessidade para a perícia orgânica da síntese ou o equipamento especial. Além disso, é descrita uma modificação do método de Folch para extrair o padrão deuterado da cultura C. elegans . Finalmente, um método quantitativo e analítico para detectar 2-AG usando o análogo isotopicamente etiquetado estável 1-AG-d₅ é descrito, que fornece resultados de confiança em um funcionamento rápido-cromatográfico. O procedimento é útil para estudar as funções múltiplas de 2-AG em C. elegans ao igualmente ser aplicável a outros estudos dos metabolitos em organismos diferentes.

Introdução

Os endocanabinoides regulam processos biológicos múltiplos em uma variedade de organismos e são mediadores lipídicos conservados¹. Os primeiros endocanabinoides descobertos e mais bem caracterizados são anandamida (arachidonoylethanolamide, AEA) e 2-arachidonoyl glicerol (2-AG). Endocannabinoids desempenham muitos papéis críticos, incluindo os envolvidos em sistemas de recompensa cerebral, bem como a toxicodependência, memória, humor e processos metabólicos². AEA e 2-AG são sintetizados somente quando necessário e têm períodos de vida curtos, e são degradados com a recaptação e a hidrólise da proteína do transporte³.

O uso de modelos animais como Caenorhabditis elegans (C. elegans) tornou-se importante para estudar a grande variedade de processos biológicos, incluindo apoptose, sinalização celular, ciclo celular, polaridade celular, regulação genética, metabolismo, envelhecimento, e determinação do sexo^4,5. Adicionalmente, C. elegans é um excelente modelo para estudar os papéis fisiológicos de ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs). A AEA foi identificada em C. elegans e é reduzida restrição dietética⁶. Esta deficiência estende a vida útil do nematoide através de um mecanismo de restrição dietética que pode ser suprimida pela suplementação com o endocanabinoide. Recentemente, descobriu-se que 2-AG e AEA desempenham papéis fundamentais na regulação do tráfico de colesterol em C. elegans⁷. Mais importante, determinou-se que a suplementação com 2-AG exógeno pode resgatar Dauer prisão, que é causada pelo tráfico de colesterol prejudicada em Niemann-Pick tipo C1 C. elegans mutantes.

Para obter uma melhor compreensão da relação 2-AG com o tráfico de colesterol e outros processos biológicos no nematódeo (i.e., sinalização monoaminérgica, nocicepção e locomoção), é crucial estudar este metabolito endógeno e como é afetados determinadas condições ambientais e dietéticas^{8,9,10,11,12,13.} Portanto, é imperativo projetar e otimizar um método para detectar e quantificar 2-AG endógena em C. elegans que é simples de usar para cientistas de diferentes campos, especialmente aqueles que estudam o comportamento do nematódeo em relação a este endocanabinóide.

Em 2008, Lethonen e colegas de trabalho conseguiram identificar 2-AG e AEA em C. elegans utilizando métodos analíticos LC-MS¹⁴. Em 2011, conseguiram ampliar essa técnica para outros endocanabinoides¹⁵. Trabalhos mais recentes mostraram outros métodos analíticos que têm sido bem-sucedidos na detecção e quantificação de endocanabinoides em C. elegans^{, incluindo}espectrometria de massas e GC-MS^{16,17,18, e}tem também foi relatado que métodos analíticos semelhantes podem ser expandidos para outros modelos¹⁹.

Os métodos analíticos previamente relatados usados para quantificar 2-AG em amostras biológicas envolvem geralmente o uso de padrões deuterado que são adquiridos comercialmente e exigem a disponibilidade para a compra^20,21. Muitos padrões analíticos para a quantificação de LC-MS/MS de endocanabinoides estão disponíveis comercialmente a partir de diferentes fornecedores. No entanto, eles são caros, são sensíveis, e se tornam oxidados ao longo do tempo, devido à presença de múltiplas ligações duplas. As versões mais comuns destas normas baseiam-se no ácido araquidônico Octa-deuterado e são adequadas para quantificação por diluição isotópica LC-MS/MS^14,22. Além disso, a maioria destes padrões são substituídos na posição 2 do glicerol, tornando-os instáveis na maioria das condições, uma vez que são propensas à migração de acilo^19,23.

Para superar as dificuldades associadas aos custos e à estabilidade desses padrões deuterados, um método conveniente e simples é apresentado para elaborar um padrão analítico baseado em glicerol-d₅. A sequência para preparar o padrão penta-deuterated requer um procedimento de três etapas que resulte no padrão 1-AG-d₅, que é estável e não sofre migração de acilo (a principal questão quando se pretende sintetizar 2-monoacilgliceróis).

O objetivo principal aqui é mostrar um método simples e reprodutível para estudar 2-AG em C. elegans, incluindo a síntese do padrão analítico deuterado, preparação e extração das amostras de nematódeos e análise por LC-MS/MS (Figura 1 ). Este procedimento sintético é realizável sem o conhecimento orgânico sofisticado da síntese ou o equipamento especial, fazendo o apropriado para cientistas dos campos diferentes que estão estudando o comportamento de C. elegans a influência do endocanabinóide. O método também é expansível para outros modelos de estudo, tornando-o útil para diferentes alvos. O padrão, preparado como relatado aqui, foi aplicado para desenvolver com sucesso um método cromatográfico rápido e de confiança que permita a deteção e a quantificação eficazes de 2 AG em uma maneira reprodutível.

Protocolo

1.1-AG-d₅ preparação

Nota: para a obtenção de 1-AG-d₅ como um padrão interno deuterado para ensaios de quantificação, siga o protocolo conforme detalhado abaixo.

1. Proteção diferencial
   1. Para proteger somente álcoois primários, primeiro adicione 38 mg de glicerol-d₈ a um tubo de reação de 10 ml usando uma pipeta Pasteur e adicione um agitador magnético.
   2. Adicione 5 mL de diclorometano anidro (DCM) utilizando uma seringa Hamilton de 5 mL e encha o tubo com N₂ seco para produzir uma atmosfera inerte.
   3. Prepare um banho usando um balão raso de Dewar enchido com o acetato de etilo destilado.
   4. Encaixe o tubo de reacção hermeticamente fechado no interior do banho e fixe-o adicionando lentamente o líquido N₂ ao acetato de etila até que o solvente esteja congelado.
      PRECAUÇÃO: o líquido ferve violentamente à temperatura ambiente (RT) e pode provocar queimaduras graves ao contactar os olhos e a pele.
   5. Adicione 54 mg de colidina anidra usando uma seringa de Hamilton.
      Cuidado: a Collidine é volátil e tem um aroma muito forte e desagradável.
   6. Adicionar 70 mg de cloreto de tert-butildimetilsilílico e agitar toda a solução durante 3 h a-78 ° c num agitador magnético.
   7. Após 3 h, deixe a reacção para aquecer no RT e continue mexendo por um adicional de 12 h.
   8. Adicionar 2 mL de salmoura para saciar a reacção.
   9. Extraia a solução 3x com 2 mL de diclorometano destilado usando um funil de separação, salvando o extrato orgânico de cada vez.
   10. Combine os três extratos orgânicos e seque-os sobre o sulfato de sódio.
   11. Evate o diclorometano a pressão reduzida em um Evaporador giratório do vácuo com cuidado para evitar projeções solventes.
   12. Purificar a mistura bruta por cromatografia em coluna utilizando sílica gel como a fase estacionária e um gradiente de 10% crescente de hexano/acetato de etilo, a partir de 100% de hexano e acabamento com 100% de acetato de etilo.
   13. Combine as frações que contêm o produto e retire o solvente pressão reduzida em um evaporador rotativo a vácuo para obter o puro 1-O, 3-O-bis-(TBDMS) glicerol-d₅ como um líquido incolor.
2. Esterificação
   1. Adicionar 10 mg de 1-o, 3-O-bis (TBDMS)-glicerol-d₅ (previamente sintetizado) a um tubo de reacção de 10 ml utilizando uma pipeta Pasteur e adicionar um agitador magnético.
   2. Adicione 2 mL de diclorometano anidro utilizando uma seringa Hamilton de 5 mL e encha o tubo com N₂ seco para produzir uma atmosfera inerte.
   3. Resfrie a solução para 0 ° c usando um banho de gelo.
   4. Adicione 36 mg de ácido araquidônico usando uma micropipeta ajustável de vários volumes e mexa.
   5. Adicione 15 mgs de 4-dimethylaminopyridine e mexa.
   6. Adicionar 15 mg de N, n'-diisopropylcarbodiimida usando uma micropipeta ajustável de vários volumes e mexa.
   7. Deixe a mistura reagir a 0 ° c durante 3 h.
   8. Após 3 h, deixe a reacção para aquecer no RT e continue mexendo por um adicional de 12 h.
   9. Adicionar 2 mL de água para saciar a reacção.
   10. Extraia a solução orgânica 3x com 2 mL de diclorometano destilado (DCM) usando um funil de separação.
   11. Coloque os três extratos orgânicos no mesmo tubo e seque-os sobre o sulfato de sódio.
   12. Evate o diclorometano a pressão reduzida em um Evaporador giratório do vácuo com cuidado para evitar projeções solventes.
   13. Purificar a mistura bruta por cromatografia em coluna utilizando sílica gel como a fase estacionária e um gradiente de 10% crescente de hexano/acetato de etilo, a partir de 100% hexano e terminando com 50% hexano/50% acetato de etilo.
   14. Combine as frações contendo produtos e retire o solvente pressão reduzida em um evaporador rotativo a vácuo para obter o puro 1-O, 3-O-bis (TBDMS)-2-AG-d₅ como um líquido amarelado.
3. Desproteção
   1. Adicionar 15 mg do 1-o, 3-O-bis (TBDMS)-2-AG-d₅ (previamente sintetizado) a um tubo de reacção de 10 ml utilizando uma pipeta Pasteur e adicionar um agitador magnético.
   2. Adicione 2 mL de THF anidro usando uma seringa de 5 mL Hamilton, e encha o tubo com N seco₂ para produzir uma atmosfera inerte.
   3. Resfrie a solução para 0 ° c usando um banho de gelo.
   4. Adicionar 150 μL de solução de fluoreto de tetrabutylamónio de 1 M em THF usando uma seringa de Hamilton.
   5. Deixe a reação quente para RT e mexa por 1 h.
   6. Após 1 h, adicione 2 mL de água para saciar a reacção.
   7. Extraia a solução 3x com 2 mL de diclorometano destilado usando um funil de separação.
   8. Combine os três extratos orgânicos e seque-os sobre o sulfato de sódio.
   9. Evate o diclorometano a pressão reduzida em um Evaporador giratório do vácuo para obter o 1 puro AG-d₅ como um líquido amarelado.
4. Monitore todas as reações por cromatografia em camada fina realizada em gel de sílica 60 F₂₅₄ chapas de alumínio pré-revestidas. Visualize as bandas uma lâmpada UV de 254 nm após a coloração com uma solução etanólico de 4-Anisaldeído.

2. preparação de estoque padrão e soluções de medição

1. Dissolva 1 mg do padrão interno 1-AG-d₅ em 1 ml de ACN e proceda por 1 min para obter a solução de estoque padrão de 1.000 ppm.
2. Para preparar a solução 1.000 ppb utilizada para quantificação em vermes, prepare primeiro uma solução de 10 ppm: Tome 10 μL da solução de stock utilizando uma seringa de Hamilton e dilui-a num volume final de 1 mL adicionando 990 μL de ACN.
3. Tome 100 μL da solução produzida no passo 2,2 utilizando uma seringa de Hamilton e dilui-a num volume final de 1 mL adicionando 900 μL de ACN para obter a solução de 1.000 ppb utilizada para a quantificação.
4. SONICATE por 1 min entre cada passo para garantir a solubilização completa. Armazene as soluções a-78 ° c para manter as concentrações e a integridade das normas. Depois que a solução padrão é usada, flua algum nitrogênio antes de fechar o tubo de ensaio para impedir a oxidação.

3. crescimento e manutenção de C. elegans

Nota: semeie as placas do agar do meio de crescimento do nematoide (NGM) com e . coli OP50 e propague os sem-fins nestas placas.

1. Misture 3 g de NaCl com 17 g de agar.
2. Adicionar 2,5 g de peptona, em seguida, adicionar 975 mL de H₂O.
3. Autoclave para 50 min, em seguida, arrefecer o balão para 55 ° c.
4. Misture o seguinte: 1 mL de 1 M de CaCl₂, 1 ml de 1 m MgSO₄, 25 ml de 1 m KH₂po₄ tampão (todos os quais foram previamente esterilizados) e 1 ml de 5 mg/ml de colesterol em etanol.
5. Ao manter um ambiente estéril, dispense a solução de NGM em placas de Petri de 60 milímetros, enchendo as placas a dois terços de seu volume. Guarde as placas a 4 ° c.
6. Raia a cultura bacteriana de E. coli de um estoque de glicerol-80 ° c na placa de agar lb. Deixe crescer na placa durante a noite em 37 ° c.
7. Pegue uma única colônia para inocular 100 mL de LB líquida durante a noite a 37 ° c com agitação.
   Nota: não é necessário verific o O.D. porque esta tensão pode alcangar a fase estacionária sobre este tempo.
8. Retire as placas NGM armazenadas, retire as tampas na capa do fluxo laminar e deixe-a aberta para permitir a evaporação do excesso de humidade das placas.
9. Uma vez que as placas são secas, use uma pipeta de Pasteur para adicionar 100 μL de OP50 E. coli ao centro da placa sem espalhar.
10. Deixe o gramado de OP50 E. coli para crescer durante a noite no RT ou em 37 ° c por 8 h.
11. Adicionar o número desejado de embriões de vermes obtidos por tratamento com hipoclorito ou "branqueamento" (secção 4).
    Nota: arrefecer as placas para RT antes da adição de vermes.

4. técnica de branqueamento para a sincronização C elegans culturas

1. Vermes de semente e pedaços em placas NGM de 6 cm.
2. Deixe os vermes crescendo por 2-3 dias para obter números suficientes de ovos e adultos gravid na placa.
3. Uma vez que há bastante ovos/adultos, despeje 5 mL de M9 na placa.
4. Transfira os vermes para um tubo de centrífuga de 15 mL usando uma pipeta de vidro.
5. Centrifugue o tubo por 2 min a 2.000 x g e pellet os vermes.
6. Sucção para fora a maioria do M9, evitando o distúrbio da pelota do sem-fim.
7. Adicionar 3 mL de solução de branqueamento (2:1:1 proporção de NaOH: NaOCl: H₂O).
8. Inverta suavemente para misturar a solução durante 5 min ou até que o número de vermes adultos intactos diminua.
   Cuidado: não lixívia por mais de 5 min.
9. Centrifugue por 1 minuto em 2.000 x g e sucção a maioria da solução de branqueamento sem perturbar a pelota do sem-fim.
10. Adicione 15 mL de M9 e misture bem.
11. Centrifugar novamente a 2000 x g durante 1 min.
12. Sucção para fora a maioria do M9 sem perturbar a pelota do sem-fim.
13. Repita os passos 4.10-4.12 uma ou duas vezes mais.
14. Adicionar 5 mL de M9 fresco e agitar.
15. Deixe os ovos eclodirem durante a noite com o balanço suave.

5. preparação da amostra do sem-fim

1. Deixe que os embriões N2 obtidos pelo procedimento de branqueamento escotilha durante a noite no tampão M9 (5 mL em um tubo de centrífuga de 15 mL) a 20 ° c.
2. Colher a L1s sincronizada centrifugação do tubo durante 2 min a 2.000 x g.
3. Lave os vermes com o tampão M9 1x e, em seguida, quantifique o número de worms L1 vivos.
4. Sementes de aproximadamente 10.000 vermes em placas NGM (10 cm de diâmetro) com 1 mL de OP50 E. coli (previamente secas).
5. Incubar as placas para 48 h a 20 ° c até que os vermes alcancem o estágio L4.
6. Colher os vermes usando frio M9 buffer em um tubo de centrífuga de 15 mL, lave-os 1x, em seguida, e transferi-los para um tubo de 1,5 mL.
7. Pellet os vermes por centrifugação em 2.000 x g por 1 min, eliminar a maior parte do sobrenadante, mergulhar os tubos em nitrogênio líquido, e armazenar a-80 ° c.

6. extração de lipídios

1. Descongelar aproximadamente 100 μL de pellets de minhoca congelados pertencentes a N2 no gelo, adicionar 1,3 mL de metanol e sonicar a amostra durante 4 min.
2. Adicionar 2,6 mL de clorofórmio, e 1,3 mL de 0,5 M KCl/0,08 M H₃po₄ a uma relação final de 1:2:1, 1.000 ppb do padrão interno 1-AG-d₅, e hidroxitolueno butil como um agente antioxidante na concentração final de 50 μg/ml.
3. Vortex as amostras para 1 min e proceda em um banho de água ultra-sônica para 15 min no gelo.
4. Vórtice as amostras 2x por 1 min e centrifugar por 10 min a 2.000 x g para induzir a separação da fase.
5. Recolher a fase inferior e recolhê-lo em um tubo limpo, seque-o nitrogênio, e ressuscitem o resíduo sólido em 100 μL de ACN.

7. análise endocanabinoide por HPLC-MS/MS

1. Use a cromatografia líquida acoplada com um espectrómetro maciço do Quadrupole de ESI para detectar e quantificar 2 AG das amostras do nematoide.
2. Use a seguinte relação para a HPLC da fase invertida: de 0,0-0,5 min H₂o:acn (40:60), 0,5-6,5 min h₂o:acn (40:60) a (25:75), 6,5-7,5 min h₂o:ACN (25:75), 7,5-8,0 min h₂o:ACN (25:75) a (40:60), 8.0-12.0 min h₂O: ACN (40:60).
3. Mantenha a temperatura da coluna a 40 ° c e ajuste a temperatura da bandeja do amostrador automático para 10 ° c.
4. Defina as seguintes condições de ionização: modo de íon positivo; temperatura do gás de secagem (N₂) = 300 ° c; vazão de gás de secagem = 10 L/min; pressão do nebulizador = 10 UA; e boné. tensão = 4 kV.
5. Para a deteção do analito, use o MRM com as seguintes transições: 379,2 m/z a 289,2 m/z para 2-AG; e 384,2 m/z a 289,2 m/z para 1-AG-d₅.

8. quantificação de endocanabinoides em vermes

1. Use o padrão interno deuterado 1-AG-d₅ e calcule as relações máximas da área do analito ao padrão interno.
2. Use as seguintes transições: 384,2 m/z a 287,2 m/z para 2-AG; e 379,2 m/z a 287,2 m/z para 1-AG-d₅.
3. Calcule a concentração do 2-AG endógeno comparando com as proporções de pico de área do padrão deuterado usando o valor de concentração do padrão.

Resultados

Um análogo isotopicamente marcado foi sintetizado com sucesso a partir de d₈-glicerol e ácido araquidônico comercialmente disponíveis usando um método sintético de 3 etapas (Figura 2, Figura 3). Estes passos são simples e não necessitam de equipamentos sofisticados, especialmente condições controladas, ou reagentes caros. Assim, este método é robusto e pode ser estendido com sucesso para sintetizar monoacil...

Discussão

Os endocanabinoides são uma classe de lipídios que têm sido implicados na regulação da formação de Dauer em C. elegans⁷. Mais especificamente, a síntese de ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) é importante para o tráfico de colesterol e o desenvolvimento reprodutivo de vermes. Revela-se aqui que 2-AG, um ácido araquidônico que contem o endocannabinoid, é responsável para restituir a larva do Dauer a seu ciclo normal nos sem-fins que prejudicaram o metabolismo do colesterol...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-dimethylaminopyridine	Sigma-Aldrich	107700	reagent grade, 99%
antioxidant BHT	Sigma-Aldrich	W21805
Arachidonic acid	Sigma-Aldrich	10931
Glycerol-d8	Sigma-Aldrich	447498
Mass detector Triple Quadrupole	Thermo Scientific		TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	D125407
NMR spectrometer	Bruker		Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column	Thermo Fisher	25003-052130	C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride	Sigma-Aldrich	190500	reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride	Sigma-Aldrich	216143	1.0M in THF
UHPLC System	Thermo Scientific		Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)